Caractérisation de NEF-sp: une exoribonucléase 3'→ 5' spécifique du testicule. Les études biochimiques et génétiques ont révélé que de nombreuses protéines jouent un rôle important dans la voie des ARNpi (ARN interagissant avec Piwi). Néanmoins, certaines caractéristiques mécanistes ne sont pas encore complètement comprises. D’autre part, certaines protéines impliquées dans la voie des ARNpi pourraient ne pas encore être caractérisées. Lorsque ce projet a commencé, le traitement 3’ des ARNpi n'avait pas été complètement identifié. Par contre la directionnalité 3’ à 5’ avait été observée avec une dépendance au Mg2+. Toutefois, la protéine responsable du raccourcissement des ARNpi à leur longueur mature n'était toujours pas connue.NEF-sp devrait être une exo nucléase d'ARN avec une directionnalité de 3' à 5'. Sa prédiction de domaine a révélé que cela se compose d'un domaine de nucléase N-terminal et de deux motifs de reconnaissance d'ARN (RRM). NEF-sp est également prévue comme une nucléase spécifique aux testicules, mais son rôle biologique n'a pas été caractérisé auparavant. Ce projet s'est concentré sur une hypothèse initiale selon laquelle NEF-sp pourrait potentiellement agir comme une nucléase impliquée dans la voie des ARNpi.Globalement, nous avons démontré que NEF-sp humaine est une exoribonucléase avec une directionnalité 3'→ 5'qui est active sur les substrats de l'ARN simple brin. Cette protéine est exprimée exclusivement dans les testicules des souris. En plus, NEF-sp pourrait fonctionner dans le compartiment nucléaire. Notre analyse de la souris Nef-sp mutante n'a révélé aucun phénotype évident. Nous avons observé que les homozygotes des deux sexes sont viables et présentent une fertilité normale. De plus, NEF-sp ne semble pas jouer un rôle dans la voie des ARNpi. Il est possible que le recadrage du/des substrat(s) inconnu(s) ne soit pas important pour la viabilité et fertilité en raison de la compensation potentielle par d'autres nucléases. Néanmoins, notre étude fournit une caractérisation biochimique et génétique de l'exoribonucléase NEF-sp des mammifères. / Genetic and biochemical studies have identified more than twenty different proteins involved in the piRNA pathway. However, some mechanistic features are still not fully understood. When this project started, piRNAs 3' end trimming was not completely characterized. Trimming was observed before in BmN4 cells and an Mg2+-dependent 3′ to 5′ exonuclease was implicated in this process. However, the protein responsible for shortening piRNAs to their mature length was still not known.NEF-sp is predicted to be an RNA exonuclease with 3′ to 5′ directionality. This protein is composed by three domains: a nuclease domain at N-terminal and two RNA binding motifs at C-terminal. NEF-sp is also predicted to be a testis-specific nuclease, however its biological role was not previously characterized. This project was based on the hypothesis that NEF-sp could potentially act as a nuclease involved in the piRNA maturation.We examined the biochemical properties of the uncharacterized mammalian nuclease family member NEF-sp. We show that Nef-sp transcripts are detected exclusively in mouse testes. We demonstrate that hNEF-sp is a 3ʹ→5ʹ exoribonuclease that is active on ssRNA substrates and likely functions in the nucleolar compartment. Our own analysis of the Nef-sp mouse knock-out mutant revealed no obvious phenotype. We observed that homozygous animals of both sexes are viability and display normal fertility. NEF-sp does not seem to play a role in piRNA pathway. It is possible that precise trimming of the unknown substrate(s) may not be important for viability/fertility due to potential complementation by other nucleases. Nevertheless, our study provides a biochemical and genetic characterization of the mammalian NEF-sp exoribonuclease.

Les ARNnc sont impliqués dans la régulation de l’expression de gènes chez les Procaryotes, les Archées et les Eucaryotes. Cette régulation peut être effectuée au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Elle fait parfois intervenir des modifications des histones comme la méthylation ou l’acétylation. J’ai étudié le gène TIR1 dont l’expression est fortement réduite lorsqu’un ARNnc codant antisens nommé TIR1axut est stabilisé. J’ai montré que cette régulation est dépendante de l’histone déacétylase Hda1. De plus, j’ai montré que l’acétylation de H3K14 et H3K18 ne sont pas directement impliquées dans la régulation de TIR1 mais qu’un résidu polaire est nécessaire pour la répression de TIR1 en présence de l’ARNnc antisens. En outre, j’ai mis en évidence que la répression de TIR1 par son XUT est en parti post-transcriptionnel, mais ne fait pas varier la stabilité de l’ARNm. Finalement, j’ai tenté en vain de comprendre le ciblage de l’activité histone déacétylase de Hda1 le long de TIR1 en cherchant la présence d’hybride ARN/ADN grâce à un anticorps reconnaissant ce type de structure. / NcRNAs are involved in gene regulation in Prokaryotes, Eukaryotes and Archaea. This regulation could be transcriptional or post-transcriptional. Histone modifications could be involved such as methylation or acetylation. I studied TIR1 gene whose expression is highly reduced when an antisense ncRNA called TIR1axut is stabilized. I showed that this regulation is Hda1-dependant. In addition to that, I showed that H3K14ac and H3K18ac are not directly responsible for TIR1 repression but a polar residue is required for a proper silencing of TIR1 in a XUT depending manner. Moreover, I showed that TIR1 repression is due to a post-transcriptional effect but does not affect mRNA stability. Finally, I tried in vain to understand Hda1 targeting on TIR1 searching for RNA/DNA hybrids using an antibody that recognizes such structures.

Le cancer du poumon est la première cause de mortalité par cancer en France et dans le monde. Aujourd'hui, en France, la survie cinq ans après un diagnostic de cancer du poumon est de seulement 14%, ce qui en fait l'un des cancers les plus difficiles à soigner. La médecine personnalisée, notamment l’immunothérapie, est désormais l’approche privilégiée pour les cancers du poumon aux stades métastatiques. Au sein d’une tumeur, les cellules cancéreuses sont entourées par un microenvironnement inflammatoire riche en polymorphonucléaires neutrophiles (PMN). Alors qu’il est établi que la présence répétée de PMN est associée au développement des carcinomes, la contribution de l'interaction intratumorale des PMN avec les cellules cancéreuses dans la progression tumorale n’est pas claire. Pour cela nos objectifs ont été de : 1) décrypter les moyens de communication engagés entre les neutrophiles et les cellules tumorales (miARNs et microvésicules) et 2) la régulation de ces acteurs dans les cellules réceptrices, 3) démontrer leur rôle dans la progression et la dissémination tumorale. La plasticité tumorale et l’invasion font parties des caractéristiques les plus importantes de la progression du cancer. Ces travaux nous ont permis d’identifier un nouveau mécanisme d'acquisition transitoire du phénotype invasif via le transfert de miARNs extracellulaires dans les cellules tumorales. Nous avons pu observer que le miR-223-3p extracellulaire est transféré des PMN aux cellules tumorales pulmonaires via des exosomes. / Lung cancer is the leading cause of cancer mortality in France and worldwide. Today in France, the overall five-year survival rate after diagnosis is only 14%, making it one of the most challenging cancers to treat. Personalized medicine is now the preferred approach for lung cancer for metastatic stage, including so-called immunotherapy. Within a tumor, cancer cells are surrounded by an inflammatory microenvironment rich in polymorphonuclear neutrophils (PMN). While it is established that the presence of PMN is associated with the development of carcinomas, the contribution of intratumoral PMN and their interaction with cancer cells in tumor progression is unclear. To explore these hypotheses, objectives of our study were: 1) to decrypt the communication between neutrophils and tumor cells (miRNAs and microvesicles) and 2) the regulation of these actors in the recipient cells, 3) to demonstrate their role in tumor progression and dissemination. Tumor plasticity and invasion are part of the most important features of cancer progression. This work has allowed us to identify a new mechanism of transient acquisition of phenotype by transfer of extracellular miRNA (ex-miRNA) into cancer cells with and, importantly, by letting the ex-miRNA decay. We observed that the ex-miR-223-3p is transferred from PMN to lung tumor cells via exosomes. This transfer is functional, as demonstrated by the occurrence of epithelial to mesenchymal transition (EMT) associated with an invasive phenotype and inhibition of one of its targets, FOXO1 transcription factor.

Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale. / This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism.

L’exosome joue un rôle fondamental dans la dégradation de 3’ en 5’ et la maturation des ARNs chez les eucaryotes. Le "coeur" de l’exosome est composé de 9 sous-unités (EXO9). EXO9 est catalytiquement inactif chez l’homme et la levure, et est associé à deux RNases, Rrp6 et Rrp44, responsables de l’activité exonucléolytique de l’exosome. Mes travaux de thèse démontrent que chez Arabidopsis, le coeur de l’exosome EXO9 possède une activité catalytique intrinsèque. Cette activité est dépendante de la présence de phosphate, produit des nucléosides diphosphates et est réversible. Elle possède de ce fait toutes les caractéristiques d’une activité phosphorolytique. L’activité d’EXO9 est impliquée dans l’élimination de sous-produits de la maturation des ARNr et dans la maturation de l’ARNr 5.8S, deux fonctions typiques de l’exosome. Mes travaux révèlent également que AtRRP44, EXO9 et AtRRP6L2 coopèrent de manière séquentielle pour la maturation de l’ARN 5.8S. Mes travaux de thèse constituent la base de travaux futurs visant à comprendre les rôles de l’activité phosphorolytique de l’exosome chez un organisme eucaryote. / The eukaryotic RNA exosome complex is the main 3’-5’ degradation machinery that plays an essential role in RNA decay, quality control and maturation. The exosome core complex (EXO9) is catalytically inert in yeast and humans, and therefore relies on the catalytic activity of associated RNases, Rrp6 and Rrp44. In this study I demonstrated that EXO9 is catalytically active in Arabidopsis. EXO9’s activity is phosphate-dependent, releases nucleoside diphosphates and is reversible, meeting all criteria of a phosphorolytic activity. Importantly, EXO9’s in vivo substrates include the archetypical exosome substrates, rRNA maturation by-products and 5.8S rRNA precursors. My data show that AtRRP44, EXO9 and AtRRP6L2 sequentially cooperate for the processing of 5.8S rRNA. This work sets a basis for studies aiming at further understanding the biological functions of EXO9’s phosphorolytic activity in a eukaryotic organism.

Mon projet a porté sur la caractérisation du mécanisme moléculaire des enzymes d'arenavirus (une 3'-5' exoribonucléase et une endonuclease) impliquées dans l'inhibition de la réponse innée IFN de type I et dans le vole de coiffe respectivement, et le développement d'une stratégie thérapeutique basée sur leur structures. Premièrement, j'ai résolu deux structures cristallographiques à haute résolution du domaine exoribonucléases du virus Mopeia (NP-exo MOPV) -un homologue du virus Lassa pathogène- en complexe avec deux ions différents. Ensuite, j'ai effectué une caractérisation fonctionnelle de l’activité exoribonucléase 3'-5' codée par ce domaine. Une corrélation entre la structure et la fonction de NP-exo MOPV démontre que; L’activité exoribonucléase 3'-5' est conservée chez les arenavirus pathogènes ainsi que chez les non-pathogènes. J'ai démontré pour la première fois que l'exoribonucléase est capable d'exciser un ARN misapparié, suggérant ainsi une potentielle activité de correction d'erreur par cette enzyme. Avec la structure de NP-exo MOPV, j'ai développé une stratégie in silico pour identifier des inhibiteurs potentiels spécifiques contre son activité et un inhibiteur a était identifié.En parallèle, nous avons résolu deux structures cristallographiques du domaine de l'endonuclease du virus de la LCMV en complexe avec deux ions catalytiques et deux composés appartenant a la famille des diketo. En résumé, ce travail éclaircit le rôle des exoribonucléases de la famille d'Arenaviridae allant de l’évasion de l'immunité innée à son implication directe dans la réplication. Il ouvre également la voie au développement des inhibiteurs contre ces nucléases. / My PhD work focused on the characterization of the molecular mechanism of two arenavirus enzymes - a 3'-5' exoribonuclease and an endonuclease - implicated in type I IFN suppression and mRNA cap-snatching respectively and the design of a structure based-drug strategy against them. First I solved two high resolution crystal structures of the exoribonuclease domain of Mopeia virus (NP-exo MOPV) -a non pathogenic homologue of the highly pathogenic Lassa virus- in complex with different metal ions. Next I performed an in depth functional characterization of the 3'-5' exoribonuclease activity encoded by this domain. By correlating the structure and function of NP-exo MOPV, I showed that; the 3'-5' exoribonuclease activity is conserved in pathogenic as well as in non-pathogenic arenaviruses. Also, I showed for the first time that this enzyme is able to excise a mismatched RNA suggesting that, arenaviruses might posses a mechanism to limit error incorporation by the RdR polymerase during replication. Using the crystal structure of NP-exo MOPV I designed a structure-based strategy to identify potential inhibitors specific for the 3'-5' exoribonuclease activity and have identified a potential inhibitor.Alongside, we solved two crystal structures of the endonuclease domain of LCMV in complex with two catalytic ions and two compounds belonging to the diketo family.In conclusion, this work has a deep implication extending the role of the Arenaviridae exoribonuclease from innate immunity evasion to direct implication in replication. It also paves the way for the development of inhibitors against these arenavirus nucleases.