Bilirrubina oxidase de Myrothecium verrucaria é uma multicobre oxidase capaz de reduzir O2 pela oxidação de fenóis, aminas aromáticas e polipirróis. Eletroquimicamente, essa reação de redução ocorre pela transferência de elétrons entre a enzima e um eletrodo. Nesta tese, foi investigada a eficiência da enzima como agente redutor de O2 na superfície de eletrodos modificados pela função orgânica naftil-2-carboxilato por acoplamento de diazônio. Essa modificação na superfície do eletrodo aumenta em até quatro vezes a atividade do filme catalítico em relação à obtida por eletrodos em que a adsorção da enzima foi feita de forma convencional, sem a modificação. Foram estudados os efeitos da temperatura sobre a atividade da enzima para a redução de O2, sendo observado um aumento linear da atividade do eletrodo com o aumento da temperatura até 30 °C, de tal forma que temperaturas mais altas proporcionaram o aumento da inativação natural das moléculas de enzima. Esse efeito de inativação foi confirmado pela diminuição da atividade com o tempo na presença de O2, por cronoamperometria, sendo a atividade interrompida pela inserção de argônio e retomada do mesmo ponto pela reinserção de O2, descartando a idéia da queda de corrente proveniente da dessorção de enzima. Foi estudado também o efeito do pH na máxima atividade da bilirrubina oxidase, conduzidos entre pH 5,0 e 8,0, e verificando-se que a máxima atividade da enzima foi obtida entre pH 5,5 e 6,0 e, além disso, verificou-se que a corrente catalítica em baixos valores de pH aumenta diretamente com o aumento do sobrepotencial aplicado. Porém, em altos valores de pH, a curva de redução toma a forma sigmoidal e passa a ser independente do sobrepotencial aplicado, sendo a reação governada por etapas químicas de transferência de prótons. O uso de eletrodos de disco rotatório possibilitou resolver parâmetros de Michaelis-Menten para a cinética do filme catalítico de forma mais precisa (a resposta de corrente é menos dependente do transporte de massa de reagentes) e esses dados foram obtidos dentro de um intervalo de pH importante para aplicações práticas. O sobrepotencial da reação de redução de O2 catalisada por bilirrubina oxidase foi comparado com o sobrepotencial obtido para a mesma reação catalisada por Platina eletrodepositada sobre a superfície de grafite pirolítico, onde foi observado um sobrepotencial de 140 mV para a catálise enzimática, demasiado menor que o valor de 415 mV obtidos para a Platina, sob as mesmas condições experimentais, em pH neutro. A metodologia proposta para a construção de um cátodo para aplicação em células a combustível enzimáticas e os subsequentes estudos possibilitaram uma investigação minuciosa para caracterizar a enzima bilirrubina oxidase como talvez o catalisador mais eficiente na redução eletroquímica de oxigênio molecular em células a combustível até o momento. / Bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria is a multicopper oxidase reducing O2 at the expenses of phenols, aromatic amines and polypyrrols oxidation. Electrochemically, this reduction reaction undergoes through the electron transfer between enzyme and electrode. In this thesis, the enzyme was investigated as an efficient O2 reducing agent on electrode surfaces modified by naphthil-2-carboxylate functionalities through diazonium coupling. This modification of the electrode surface increases the activity of the catalytic film up to four times comparing to that obtained by electrodes in which the enzyme molecules were adsorbed conventionally, without modification. It was studied the effect of temperature on O2 reduction, in which catalysis increased linearly with temperature up to 30 °C, and higher temperatures increased the natural enzyme inactivation. This inactivation was confirmed by the activity drop off with time in the presence of O2, by chronoamperometry, ceased out when argon was inserted into the cell and re-established from the same point when argon was purged out by insertion of O2. These results cast aside the idea of activity drop off caused by enzyme desorption. It was also investigated the pH effect on the maximum activity of bilirubin oxidase, carried out between pH 5.0 and 8.0, being the highest activity obtained at pH 5.5-6.0. Furthermore, it was observed that the catalytic current directly increases with applied overpotential, at low pH values, and the reduction wave shape becomes sigmoidal and independent on applied overpotential at high pH values. The reaction is then governed by chemical steps, as the proton transfer. The use of rotating-disc electrodes favored solving the Michaelis-Menten kinetics for the catalytic film in a much greater accuracy (the current response is much less dependent on reagent mass transport) and these data were obtained for pH interval important for practical applications. The overpotential for the O2 reduction reaction catalyzed by bilirubin oxidase was compared to the overpotential obtained by the same reaction catalyzed by Platinum electrodeposited onto a pyrolytic graphite electrode. An overpotential of only 140 mV was observed for the enzymatic catalysis, much lower compared to the 415 mV obtained for the Platinum electrode, under the same experimental conditions, at neutral pH. The proposed method for constructing a cathode for enzymatic fuel cell application and subsequent investigation described allowed an in-depth study of bilirubin oxidase characterization as perhaps the most efficient catalysts for the electrochemical reduction of molecular oxygen in fuel cells to date.

As biocélulas a combustível enzimáticas (BFCs) são dispositivos eletroquímicos que convertem energia química em energia elétrica, utilizando enzimas como biocatalisadores. Quando miniaturizada, uma BFC pode ser implantada em animais vertebrados e invertebrados, vislumbrando-se sua utilização na produção de energia elétrica para alimentar microdispositivos biomédicos e microssensores em pequenos insetos. No entanto, ainda é um desafio obter BFCs implantáveis e miniaturizadas, com uma potência suficiente (dezenas de microwatts) para alimentar microcircuitos eletrônicos de maneira estável e em longo prazo. Diante do exposto, esta tese de doutorado apresenta um estudo das propriedades eletroquímicas de eletrodos enzimáticos, visando a aplicação em BFCs de glicose/O2 miniaturizadas e implantáveis. Para isso, utilizaram-se fibras flexíveis de carbono (FCFs) modificadas com as enzimas bilirrubina oxidase (BOx) no cátodo e glicose desidrogenase (GDh) NAD-dependente no ânodo, a fim de se obter a redução de O2 e a oxidação de glicose, respectivamente. Os resultados obtidos mostram que FCFs previamente submetidas a um tratamento químico de oxidação com permanganato de potássio e com posterior eletrodepolimerização do mediador vermelho neutro produzem bioânodos estáveis e robustos. Estes eletrodos, combinados com biocátodos compostos por FCFs na ausência de mediadores redox, foram utilizados em BFCs miniaturizadas, que foram implantadas em formigas da espécie Atta sexdens rubrupilosa. A potência máxima da BFC operando in vivo foi 13,5 ± 3,8 µW cm-2 em 190 ± 58,9 mV, com corrente máxima de 143 ± 40,2 µA cm-2 e a voltagem de circuito aberto de 260 ± 99,6 mV. Acredita-se que estes valores ainda possam ser otimizados e este trabalho contribui para mostrar que a flexibilidade das FFC, a presença de um mediador de elétrons polimérico no ânodo, o uso do tratamento químico de oxidação com permanganato de potássio das fibras e a miniaturização dos eletrodos são elementos importantes, e que podem ser considerados no desenvolvimento de biocélulas a combustível implantáveis. / Enzymatic biofuel cells (BFCs) are electrochemical devices that convert chemical energy into electrical energy using enzymes as biocatalysts. When miniaturized, BFCs can be implanted in vertebrate and invertebrate animals and, their use to produce electrical energy to feed biomedical microdevices and micro-sensors in small insects can be observed. However, it is still challenging to obtain implantable and miniaturized BFCs, with sufficient power (tens of microwatts) to power electronic microcircuits in a stable and long-term manner. In view of the above, this PhD thesis presents a study of the electrochemical properties of enzymatic electrodes, aiming to use them in miniaturized and implantable glucose/O2 BFCs. In order to obtain a reduction in O2 and oxidation of glucose, flexible carbon fibers (FCFs) modified with bilirubin oxidase (BOx) enzymes in the cathode and glucose dehydrogenase (GDh) at the anode, respectively, were used. The results show that FCFs previously submitted to a chemical treatment of oxidation with potassium permanganate and, subsequently, electropolymerization of the neutral red mediator produce stable and robust bioanodes. These electrodes, combined with biocathodes consisting of FCFs in the absence of redox mediators, were used in miniaturized BFCs, which were implanted in Atta sexdens rubrupilosa ant species. The BFC maximum power source, operating in vivo, was 13.5 ± 3.8 μW cm-2 at 190 ± 58.9 mV, with a maximum current of 143 ± 40.2 μA cm-2 and the open circuit voltage was 260 ± 99.6 mV. Although these values can be optimized, this research shows that the flexibility of the FCF, the presence of a polymer electron mediator on the anode, using the chemical treatment of oxidation with potassium permanganate of the fibers and electrode miniaturization are important elements, which can be considered in the development of implantable biofuels.

As biocélulas a combustível enzimáticas (BFCs) são dispositivos eletroquímicos que convertem energia química em energia elétrica, utilizando enzimas como biocatalisadores. Quando miniaturizada, uma BFC pode ser implantada em animais vertebrados e invertebrados, vislumbrando-se sua utilização na produção de energia elétrica para alimentar microdispositivos biomédicos e microssensores em pequenos insetos. No entanto, ainda é um desafio obter BFCs implantáveis e miniaturizadas, com uma potência suficiente (dezenas de microwatts) para alimentar microcircuitos eletrônicos de maneira estável e em longo prazo. Diante do exposto, esta tese de doutorado apresenta um estudo das propriedades eletroquímicas de eletrodos enzimáticos, visando a aplicação em BFCs de glicose/O2 miniaturizadas e implantáveis. Para isso, utilizaram-se fibras flexíveis de carbono (FCFs) modificadas com as enzimas bilirrubina oxidase (BOx) no cátodo e glicose desidrogenase (GDh) NAD-dependente no ânodo, a fim de se obter a redução de O2 e a oxidação de glicose, respectivamente. Os resultados obtidos mostram que FCFs previamente submetidas a um tratamento químico de oxidação com permanganato de potássio e com posterior eletrodepolimerização do mediador vermelho neutro produzem bioânodos estáveis e robustos. Estes eletrodos, combinados com biocátodos compostos por FCFs na ausência de mediadores redox, foram utilizados em BFCs miniaturizadas, que foram implantadas em formigas da espécie Atta sexdens rubrupilosa. A potência máxima da BFC operando in vivo foi 13,5 ± 3,8 µW cm-2 em 190 ± 58,9 mV, com corrente máxima de 143 ± 40,2 µA cm-2 e a voltagem de circuito aberto de 260 ± 99,6 mV. Acredita-se que estes valores ainda possam ser otimizados e este trabalho contribui para mostrar que a flexibilidade das FFC, a presença de um mediador de elétrons polimérico no ânodo, o uso do tratamento químico de oxidação com permanganato de potássio das fibras e a miniaturização dos eletrodos são elementos importantes, e que podem ser considerados no desenvolvimento de biocélulas a combustível implantáveis. / Enzymatic biofuel cells (BFCs) are electrochemical devices that convert chemical energy into electrical energy using enzymes as biocatalysts. When miniaturized, BFCs can be implanted in vertebrate and invertebrate animals and, their use to produce electrical energy to feed biomedical microdevices and micro-sensors in small insects can be observed. However, it is still challenging to obtain implantable and miniaturized BFCs, with sufficient power (tens of microwatts) to power electronic microcircuits in a stable and long-term manner. In view of the above, this PhD thesis presents a study of the electrochemical properties of enzymatic electrodes, aiming to use them in miniaturized and implantable glucose/O2 BFCs. In order to obtain a reduction in O2 and oxidation of glucose, flexible carbon fibers (FCFs) modified with bilirubin oxidase (BOx) enzymes in the cathode and glucose dehydrogenase (GDh) at the anode, respectively, were used. The results show that FCFs previously submitted to a chemical treatment of oxidation with potassium permanganate and, subsequently, electropolymerization of the neutral red mediator produce stable and robust bioanodes. These electrodes, combined with biocathodes consisting of FCFs in the absence of redox mediators, were used in miniaturized BFCs, which were implanted in Atta sexdens rubrupilosa ant species. The BFC maximum power source, operating in vivo, was 13.5 ± 3.8 μW cm-2 at 190 ± 58.9 mV, with a maximum current of 143 ± 40.2 μA cm-2 and the open circuit voltage was 260 ± 99.6 mV. Although these values can be optimized, this research shows that the flexibility of the FCF, the presence of a polymer electron mediator on the anode, using the chemical treatment of oxidation with potassium permanganate of the fibers and electrode miniaturization are important elements, which can be considered in the development of implantable biofuels.

Bilirrubina oxidase de Myrothecium verrucaria é uma multicobre oxidase capaz de reduzir O2 pela oxidação de fenóis, aminas aromáticas e polipirróis. Eletroquimicamente, essa reação de redução ocorre pela transferência de elétrons entre a enzima e um eletrodo. Nesta tese, foi investigada a eficiência da enzima como agente redutor de O2 na superfície de eletrodos modificados pela função orgânica naftil-2-carboxilato por acoplamento de diazônio. Essa modificação na superfície do eletrodo aumenta em até quatro vezes a atividade do filme catalítico em relação à obtida por eletrodos em que a adsorção da enzima foi feita de forma convencional, sem a modificação. Foram estudados os efeitos da temperatura sobre a atividade da enzima para a redução de O2, sendo observado um aumento linear da atividade do eletrodo com o aumento da temperatura até 30 °C, de tal forma que temperaturas mais altas proporcionaram o aumento da inativação natural das moléculas de enzima. Esse efeito de inativação foi confirmado pela diminuição da atividade com o tempo na presença de O2, por cronoamperometria, sendo a atividade interrompida pela inserção de argônio e retomada do mesmo ponto pela reinserção de O2, descartando a idéia da queda de corrente proveniente da dessorção de enzima. Foi estudado também o efeito do pH na máxima atividade da bilirrubina oxidase, conduzidos entre pH 5,0 e 8,0, e verificando-se que a máxima atividade da enzima foi obtida entre pH 5,5 e 6,0 e, além disso, verificou-se que a corrente catalítica em baixos valores de pH aumenta diretamente com o aumento do sobrepotencial aplicado. Porém, em altos valores de pH, a curva de redução toma a forma sigmoidal e passa a ser independente do sobrepotencial aplicado, sendo a reação governada por etapas químicas de transferência de prótons. O uso de eletrodos de disco rotatório possibilitou resolver parâmetros de Michaelis-Menten para a cinética do filme catalítico de forma mais precisa (a resposta de corrente é menos dependente do transporte de massa de reagentes) e esses dados foram obtidos dentro de um intervalo de pH importante para aplicações práticas. O sobrepotencial da reação de redução de O2 catalisada por bilirrubina oxidase foi comparado com o sobrepotencial obtido para a mesma reação catalisada por Platina eletrodepositada sobre a superfície de grafite pirolítico, onde foi observado um sobrepotencial de 140 mV para a catálise enzimática, demasiado menor que o valor de 415 mV obtidos para a Platina, sob as mesmas condições experimentais, em pH neutro. A metodologia proposta para a construção de um cátodo para aplicação em células a combustível enzimáticas e os subsequentes estudos possibilitaram uma investigação minuciosa para caracterizar a enzima bilirrubina oxidase como talvez o catalisador mais eficiente na redução eletroquímica de oxigênio molecular em células a combustível até o momento. / Bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria is a multicopper oxidase reducing O2 at the expenses of phenols, aromatic amines and polypyrrols oxidation. Electrochemically, this reduction reaction undergoes through the electron transfer between enzyme and electrode. In this thesis, the enzyme was investigated as an efficient O2 reducing agent on electrode surfaces modified by naphthil-2-carboxylate functionalities through diazonium coupling. This modification of the electrode surface increases the activity of the catalytic film up to four times comparing to that obtained by electrodes in which the enzyme molecules were adsorbed conventionally, without modification. It was studied the effect of temperature on O2 reduction, in which catalysis increased linearly with temperature up to 30 °C, and higher temperatures increased the natural enzyme inactivation. This inactivation was confirmed by the activity drop off with time in the presence of O2, by chronoamperometry, ceased out when argon was inserted into the cell and re-established from the same point when argon was purged out by insertion of O2. These results cast aside the idea of activity drop off caused by enzyme desorption. It was also investigated the pH effect on the maximum activity of bilirubin oxidase, carried out between pH 5.0 and 8.0, being the highest activity obtained at pH 5.5-6.0. Furthermore, it was observed that the catalytic current directly increases with applied overpotential, at low pH values, and the reduction wave shape becomes sigmoidal and independent on applied overpotential at high pH values. The reaction is then governed by chemical steps, as the proton transfer. The use of rotating-disc electrodes favored solving the Michaelis-Menten kinetics for the catalytic film in a much greater accuracy (the current response is much less dependent on reagent mass transport) and these data were obtained for pH interval important for practical applications. The overpotential for the O2 reduction reaction catalyzed by bilirubin oxidase was compared to the overpotential obtained by the same reaction catalyzed by Platinum electrodeposited onto a pyrolytic graphite electrode. An overpotential of only 140 mV was observed for the enzymatic catalysis, much lower compared to the 415 mV obtained for the Platinum electrode, under the same experimental conditions, at neutral pH. The proposed method for constructing a cathode for enzymatic fuel cell application and subsequent investigation described allowed an in-depth study of bilirubin oxidase characterization as perhaps the most efficient catalysts for the electrochemical reduction of molecular oxygen in fuel cells to date.

Biocélulas a combustível (BFCs) são definidas como dispositivos bioeletroquímicos que utilizam componentes biológicos, como enzimas ou microrganismos, para converter energia química em energia elétrica. Neste estudo, reporta-se o desenvolvimento de um bioeletrodo composto por fibras flexíveis de carbono (FFC) modificadas com a enzima álcool desidrogenase (ADH), o qual foi utilizado juntamente com a levedura Saccharomyces cerevisiae , sendo enzima e microrganismos usados como biocatalisadores cooperativos para bioprodução e oxidação de etanol. A glicose é oxidada pelas células de levedura sob condições anaeróbias, e o etanol formado pela fermentação alcóolica é, em seguida, oxidado a acetaldeído pela enzima ADH. A oxidação de etanol pela ADH resulta ainda, na redução da molécula de nicotinamida adenina dinucleotídeo, NAD+ a NADH. Posteriormente, o NADH formado nessa reação é eletroquimicamente oxidado a NAD+ na superfície do bioeletrodo de FFC baseado em ADH (FFC-ADH). Avaliou-se a influência da temperatura e do pH na bioeletrocatálise de etanol pela ADH e a melhor resposta obtida foi em 40 ºC e pH 8,5. Além disso, obteve-se uma excelente correlação linear entre os valores de concentração de etanol e densidade de corrente, indicando que a resposta bioeletrocatalítica da ADH é diretamente proporcional à concentração de etanol produzido a partir da fermentação. O conceito de que microrganismos e enzimas podem trabalhar cooperativamente para produzir uma nova classe de bioeletrodos, foi introduzido nesse trabalho. Por fim, demonstrou-se, que o bioeletrodo cooperativo pode ser aplicado com sucesso em uma BFC, utilizando o biocátodo de difusão de gás contendo a enzima bilirrubina oxidase (BOx) imobilizada em sua superfície. / Biofuel cells (BFCs) are defined as bioelectrochemical devices that use biological components, such as enzymes or microorganisms, to convert chemical energy into electric energy. In this study, we report the development of a bioelectrode composed of flexible carbon fibers (FCF) modified with the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) together with Saccharomyces cerevisiae yeast, being enzyme and microorganisms used as cooperative biocatalysts for bioproduction and oxidation of ethanol. Glucose is oxidized by the yeast cells in anaerobic conditions, and ethanol is produced through alcoholic fermentation and then it is oxidized to acetaldehyde by the ADH enzyme. The ethanol oxidation by ADH also results in the reduction of the nicotinamide adenine dinucleotide molecule, NAD+ to NADH. Subsequently, the NADH produced in this reaction is electrochemically oxidized to NAD+ on the surface of the FCF bioelectrode based on ADH (FCF-ADH). The influence of temperature and pH on the bioelectrocatalysis of ethanol was evaluated and the best performance was found at 40 ºC and pH 8.5. Additionally, the results demonstrated an excellent linear correlation between the ethanol concentration and the current generated, which indicates that the bioelectrocatalytic response of ADH is directly proportional to concentration of ethanol produced from the fermentation. The present study has introduced the concept that microorganisms and enzymes can work cooperatively to produce a new class of bioelectrodes. Finally, it has been demonstrated that the cooperative bioelectrode can be applied successfully to BFC using a gas-diffusion biocathode containing the bilirubin oxidase enzyme (BOx) immobilized on its surface.

Biocélulas a combustível (BFCs) são definidas como dispositivos bioeletroquímicos que utilizam componentes biológicos, como enzimas ou microrganismos, para converter energia química em energia elétrica. Neste estudo, reporta-se o desenvolvimento de um bioeletrodo composto por fibras flexíveis de carbono (FFC) modificadas com a enzima álcool desidrogenase (ADH), o qual foi utilizado juntamente com a levedura Saccharomyces cerevisiae , sendo enzima e microrganismos usados como biocatalisadores cooperativos para bioprodução e oxidação de etanol. A glicose é oxidada pelas células de levedura sob condições anaeróbias, e o etanol formado pela fermentação alcóolica é, em seguida, oxidado a acetaldeído pela enzima ADH. A oxidação de etanol pela ADH resulta ainda, na redução da molécula de nicotinamida adenina dinucleotídeo, NAD+ a NADH. Posteriormente, o NADH formado nessa reação é eletroquimicamente oxidado a NAD+ na superfície do bioeletrodo de FFC baseado em ADH (FFC-ADH). Avaliou-se a influência da temperatura e do pH na bioeletrocatálise de etanol pela ADH e a melhor resposta obtida foi em 40 ºC e pH 8,5. Além disso, obteve-se uma excelente correlação linear entre os valores de concentração de etanol e densidade de corrente, indicando que a resposta bioeletrocatalítica da ADH é diretamente proporcional à concentração de etanol produzido a partir da fermentação. O conceito de que microrganismos e enzimas podem trabalhar cooperativamente para produzir uma nova classe de bioeletrodos, foi introduzido nesse trabalho. Por fim, demonstrou-se, que o bioeletrodo cooperativo pode ser aplicado com sucesso em uma BFC, utilizando o biocátodo de difusão de gás contendo a enzima bilirrubina oxidase (BOx) imobilizada em sua superfície. / Biofuel cells (BFCs) are defined as bioelectrochemical devices that use biological components, such as enzymes or microorganisms, to convert chemical energy into electric energy. In this study, we report the development of a bioelectrode composed of flexible carbon fibers (FCF) modified with the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) together with Saccharomyces cerevisiae yeast, being enzyme and microorganisms used as cooperative biocatalysts for bioproduction and oxidation of ethanol. Glucose is oxidized by the yeast cells in anaerobic conditions, and ethanol is produced through alcoholic fermentation and then it is oxidized to acetaldehyde by the ADH enzyme. The ethanol oxidation by ADH also results in the reduction of the nicotinamide adenine dinucleotide molecule, NAD+ to NADH. Subsequently, the NADH produced in this reaction is electrochemically oxidized to NAD+ on the surface of the FCF bioelectrode based on ADH (FCF-ADH). The influence of temperature and pH on the bioelectrocatalysis of ethanol was evaluated and the best performance was found at 40 ºC and pH 8.5. Additionally, the results demonstrated an excellent linear correlation between the ethanol concentration and the current generated, which indicates that the bioelectrocatalytic response of ADH is directly proportional to concentration of ethanol produced from the fermentation. The present study has introduced the concept that microorganisms and enzymes can work cooperatively to produce a new class of bioelectrodes. Finally, it has been demonstrated that the cooperative bioelectrode can be applied successfully to BFC using a gas-diffusion biocathode containing the bilirubin oxidase enzyme (BOx) immobilized on its surface.