Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-11T19:56:23Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Karoliny Almeida Oliveira - 2013.pdf: 2228356 bytes, checksum: 8ee6a1227d9438898744c3fcd9ce1c82 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-11T20:00:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Karoliny Almeida Oliveira - 2013.pdf: 2228356 bytes, checksum: 8ee6a1227d9438898744c3fcd9ce1c82 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T20:00:58Z (GMT). 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During the analytical performance investigation with a conventional microplate reader, it was observed that the zone diameter and the sample volume added on each zone directly affect the absorbance response. After the optimization step, printed microplates were used to demonstrate the bioanalytical feasibility with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with a microplate reader or a cell phone camera. Immunoglobulins G (IgG) and M (IgM) antibodies were successfully detected in cell culture cell and human serum samples, respectively. The limit of detection achieved for IgG was 0.2 g/mL (13 fmol/zone). The IgM detection was used to evaluate the printed microplates feasibility for dengue diagnostics. The assays performed with both microplate reader and cell phone camera allowed distinguishing samples from infected and noninfected patients. Furthermore, it was found that the lifetime of each printed microplate depends on the storage temperature. The half life for devices stored at 10 °C has been estimated to be ca. four weeks. In addition to printed microplates, this current report also covers the fabrication of microfluidic devices containing detection zones interconnected by microchannels. These devices were produced with three polyester films. The intermediary layer was previously cut and added on the device to increase the channel depth and to provide the solution transport by capillary action. The three polyester layers were laminated together to obtain a microchannel with ca. 110 μm deep. The device proposed in this report was tested to monitor the enzymatic reaction kinetics for glucose in the presence of glucose oxidase (GOX), peroxidase and potassium iodide. The colorimetric response was recorded with a scanner. The Michaelis-Menten constant achieved with this analytical tool for the mentioned enzymatic reaction was 8.8 mM. This value is similar to the data reported in literature. These devices were also explored to quantitatively determine the glucose concentration in artificial serum samples. The analytical concentrations found in serum samples levels I and II were 4.3 ± 0.5 and 14.3 ± 1.2 mM, respectively and the error found was lower than 8%. The recovery factor found in four concentration levels (five independent measurements) was higher than 95%. / Este trabalho descreve a fabricação de dispositivos em poliéster-toner (PT) para conduzirem ensaios bioanalíticos. A tecnologia de impressão direta foi explorada para confeccionar (i) microplacas impressas contendo 96 zonas e (ii) dispositivos microfluídicos integrados. Basicamente, as configurações dos dispositivos foram desenhadas no programa Corel Draw® e impressas sobre a superfície de um filme de poliéster usando-se uma impressora laser. Na fabricação das microplacas, as 96 zonas foram criadas pela deposição de uma barreira de toner com espessura de aproximadamente 5 μm. As zonas foram distribuídas em 12 colunas e 8 linhas. Na avaliação do desempenho analítico com uma leitora convencional de microplacas, observou-se que o diâmetro da zona e o volume de amostra adicionado em cada zona influenciam diretamente a resposta de absorbância. Após a otimização, as microplacas impressas foram utilizadas para demonstrar a potencialidade bioanalítica com ensaios de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA) empregando-se uma leitora convencional de microplacas e também uma câmera de celular. Os anticorpos imunoglobulina G (IgG) e imunoglobulina M (IgM) foram detectados com sucesso em amostras de culturas de células e soro humano, respectivamente. O limite de detecção obtido para o IgG foi de 0,2 g/mL (13 fmol/zona). A detecção de IgM foi usada para avaliar a viabilidade das microplacas impressas no diagnóstico de dengue. Ensaios realizados com a leitora de microplacas e também com a câmera de celular mostraram que em ambos os casos foi possível distinguir as amostras de soro dos pacientes infectados das amostras dos pacientes não infectados. O tempo de meiavida das microplacas impressas estocadas a 10 °C foi estimado em aproximadamente quatro semanas. Além das microplacas impressas, o presente trabalho também aborda a fabricação de dispositivos microfluídicos contendo zonas de detecção interligadas por microcanais. Estes dispositivos foram fabricados com três filmes de poliéster. A camada intermediária foi previamente cortada e adicionada no dispositivo com intuito de aumentar a profundidade do canal e facilitar o transporte capilar da solução. Essas camadas foram laminadas juntas obtendo um microcanal com profundidade de aproximadamente 110 μm. O dispositivo proposto foi utilizado para monitorar a cinética da reação enzimática para glicose, na presença de glicose oxidase (GOX), peroxidase e iodeto de potássio. A resposta colorimétrica foi capturada com um scanner. Usando-se essa ferramenta analítica, a constante de Michaelis-Menten para a reação estudada apresentou valor igual a 8,8 mM, similar aos valores reportados na literatura. Esses dispositivos também foram usados para determinar quantitativamente a concentração de glicose em amostras artificiais de soro. As concentrações encontradas em amostras de soro Níveis I e II foram iguais a 4,3 ± 0,5 e 14,3 ± 1,2 mM, respectivamente e o valor do erro encontrado foi menor que 8%. O fator de recuperação obtido para essas amostras em quatro níveis de concentração (com cinco determinações independentes cada) foi superior a 95%.

Tesis por compendio / [ES] La medicina actual se dirige hacia un enfoque más personalizado basándose en el diagnóstico molecular del paciente a través del estudio de biomarcadores específicos. Aplicando este principio molecular, el diagnóstico, pronóstico y selección de la terapia se apoyan en la identificación de variaciones específicas del genoma humano, como variaciones de un único nucleótido (SNV). Para detectar estos biomarcadores se dispone de una amplia oferta de tecnologías. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones como un elevado coste, complejidad, tiempos de análisis largos o requieren de personal y equipamiento especializado, lo que imposibilita su incorporación masiva en la mayoría de los sistemas sanitarios. Por tanto, existe la necesidad de investigar y desarrollar soluciones analíticas que aporten información sobre las variantes genéticas y que se puedan implementar en diferentes escenarios del ámbito de la salud con prestaciones competitivas y económicamente viables. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar estrategias innovadoras para resolver el reto de la detección múltiple de variantes genéticas que se encuentran en forma minoritaria en muestras biológicas de pacientes, cubriendo las demandas asociadas al entorno clínico. Las tareas de investigación se centraron en la combinación de reacciones de discriminación alélica con amplificación selectiva de DNA y el desarrollo de sistemas ópticos de detección versátiles. Con el fin de atender el amplio abanico de necesidades, en el primer capítulo, se presentan resultados que mejoran las prestaciones analíticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la incorporación de una etapa al termociclado y de un agente bloqueante amplificando selectivamente las variantes minoritarias que fueron monitorizadas mediante fluorescencia a tiempo real. En el segundo capítulo, se logró la discriminación alélica combinando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA), que al operar a temperatura constante permitió una detección tipo point-of-care (POC). La identificación de SNV se llevó a cabo mediante hibridación en formato micromatriz, utilizando la tecnología Blu-Ray como plataforma de ensayo y detección. En el tercer capítulo, se integró la RPA con la reacción de hibridación alelo especifica en cadena (AS-HCR), en formato array para genotipar SNV a partir de DNA genómico en un chip. La lectura de los resultados se realizó mediante un smartphone. En el último capítulo, se presenta la síntesis de un nuevo reactivo bioluminiscente que se aplicó a la monitorización de biomarcadores de DNA a tiempo real y final de la RPA basada en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), eliminando la necesidad de una fuente de excitación. Todas las estrategias permitieron un reconocimiento especifico de la variante de interés, incluso en muestras que contenían tan solo 20 copias de DNA genómico diana. Se consiguieron resultados sensibles (límite de detección 0.5% variante/total), reproducibles (desviación estándar relativa < 19%), de manera sencilla (3 etapas o menos), rápida (tiempos cortos de 30-200 min) y permitiendo el análisis simultaneo de varios genes. Como prueba de concepto, estas estrategias se aplicaron a la detección e identificación en muestras clínicas de biomarcadores asociados a cáncer colorrectal y enfermedades cardiológicas. Los resultados se validaron por comparación con los métodos de referencia NGS y PCR, comprobándose que se mejoraban los requerimientos técnicos y la relación coste-eficacia. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo posibilitaron desarrollar herramientas de genotipado con propiedades analíticas competitivas y versátiles, aplicables a diferentes escenarios sanitarios, desde hospitales a entornos con pocos recursos. Estos resultados son prometedores al dar respuesta a la demanda de tecnologías alternativas para el diagnóstico molecular personalizado. / [CA] La medicina actual es dirigeix cap a un enfocament més personalitzat basant-se en el diagnòstic molecular del pacient a través de l'estudi de biomarcadors específics. Aplicant aquest principi molecular, el diagnòstic, pronòstic i selecció de la teràpia es recolzen en la identificació de variacions específiques del genoma humà, com variacions d'un únic nucleòtid (SNV). Per a detectar aquests biomarcadors, es disposa d'una àmplia oferta de tecnologies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions com un elevat cost, complexitat, temps d'anàlisis llargues o requereixen de personal i equipament especialitzat, la qual cosa impossibilita la seua incorporació massiva en la majoria dels sistemes sanitaris. Per tant, existeix la necessitat d'investigar i desenvolupar solucions analítiques que aporten informació sobre les variants genètiques i que es puguen implementar en diferents escenaris de l'àmbit de la salut amb prestacions competitives i econòmicament viables. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut desenvolupar estratègies innovadores per a resoldre el repte de la detecció múltiple de variants genètiques que es troben en forma minoritària en mostres biològiques de pacients, cobrint les demandes associades a l'entorn clínic. Les tasques d'investigació es van centrar en la combinació de reaccions de discriminació al·lèlica amb amplificació selectiva de DNA i al desenvolupament de sistemes òptics de detecció versàtils. Amb la finalitat d'atendre l'ampli ventall de necessitats, en el primer capítol, es presenten resultats que milloren les prestacions analítiques de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la incorporació d'una etapa al termociclat i d'un agent bloquejant amplificant selectivament les variants minoritàries que van ser monitoritzades mitjançant fluorescència a temps real. En el segon capítol, es va aconseguir la discriminació al·lèlica combinant el lligament d'oligonucleòtids amb l'amplificació de la recombinasa polimerasa (RPA), que en operar a temperatura constant va permetre una detecció tipus point-of-care (POC). La identificació de SNV es va dur a terme mitjançant hibridació en format micromatriu, utilitzant la tecnologia Blu-Ray com a plataforma d'assaig i detecció. En el tercer capítol, es va integrar la RPA amb la reacció d'hibridació al·lel específica en cadena (AS-HCR), en format matriu per a genotipar SNV a partir de DNA genòmic en un xip. La lectura dels resultats es va realitzar mitjançant un telèfon intel·ligent. En l'últim capítol, es presenta la síntesi d'un nou reactiu bioluminescent que es va aplicar al monitoratge de biomarcadors de DNA a temps real i final de la RPA basada en la transferència d'energia de ressonància de bioluminescència (BRET), eliminant la necessitat d'una font d'excitació. Totes les estratègies van permetre un reconeixement específic de la variant d'interès, fins i tot en mostres que només contenien 20 còpies de DNA genòmic diana. Es van aconseguir resultats sensibles (límit de detecció 0.5% variant/total), reproduïbles (desviació estàndard relativa < 19%), de manera senzilla (3 etapes o menys), ràpida (temps curts de 30-200 min) i permetent l'anàlisi simultània de diversos gens. Com a prova de concepte, aquestes estratègies es van aplicar a la detecció i identificació en mostres clíniques de biomarcadors associats a càncer colorectal i a malalties cardiològiques. Els resultats es van validar per comparació amb els mètodes de referència NGS i PCR, comprovant-se que es milloraven els requeriments tècnics i la relació cost-eficàcia. En conclusió, les investigacions dutes a terme van possibilitar desenvolupar eines de genotipat amb propietats analítiques competitives i versàtils, aplicables a diferents escenaris sanitaris, des d'hospitals a entorns amb pocs recursos. Aquests resultats són prometedors en donar resposta a la demanda de tecnologies alternatives per al diagnòstic molecular personalitzat. / [EN] Current medicine is moving towards a more personalized approach based on the patients' molecular diagnosis through the study of specific biomarkers. Diagnosis, prognosis and therapy selection, applying this molecular principle, rely on identifying specific variations in the human genome, such as single nucleotide variations (SNV). A wide range of technologies is available to detect these biomarkers. However, many of the employed methods have limitations such as high cost, complexity, long analysis times, or requiring specialized personnel and equipment, making their massive incorporation in most healthcare systems impossible. Therefore, there is a need to research and develop analytical solutions that provide information on genetic variants that can be implemented in different health scenarios with competitive and economically feasible performances. The main objective of this thesis has been to develop innovative strategies to solve the challenge of multiple detection of genetic variants that are found in a minority amount in patient samples, covering the demands associated with the clinical setting. Research tasks focused on the combination of allelic discrimination reactions with selective DNA amplification and the development of versatile optical detection systems. In order to meet the wide range of needs, in the first chapter, the analytical performances of the polymerase chain reaction (PCR) were improved by incorporating a thermocycling step and a blocking agent to amplify selectively minority variants that were monitored by real-time fluorescence. In the second chapter, allelic discrimination was achieved by combining oligonucleotide ligation with recombinase polymerase amplification (RPA), which operates at a constant temperature, allowing point-of-care (POC) detection. SNV identification was carried out by hybridization in microarray format, using Blu-Ray technology as the assay platform and detector. RPA was integrated with allele-specific hybridization chain reaction (AS-HCR), in an array format to genotype SNV from genomic DNA on a chip in the third chapter. The reading of the results was performed using a smartphone. In the last chapter, a new bioluminescent reagent was synthesized. It was applied to real-time and endpoint DNA biomarker monitoring based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), eliminating the need for an excitation source. All the strategies allowed specific recognition of the target variant, even in samples containing as few as 20 copies of target genomic DNA. Sensitive (limit of detection 0.5% variant/total), reproducible (relative standard deviation < 19%), simple (3 steps or less), fast (short times of 30-200 min) results were achieved, allowing simultaneous analysis of several genes. As proof of concept, these strategies were applied to detect and identify biomarkers associated with colorectal cancer and cardiological diseases in clinical samples. The results were validated by comparison with reference methods such as NGS and PCR, proving that the technical requirements and cost-effectiveness were improved. In conclusion, the developed research made it possible to develop genotyping tools with competitive analytical properties and versatile, applicable to different healthcare scenarios, from hospitals to limited-resource environments. These results are promising since they respond to the demand for alternative technologies for personalized molecular diagnostics. / The authors acknowledge the financial support received from the Generalitat Valenciana PROMETEO/2020/094, GRISOLIA/2014/024 PhD Grant and GVA-FPI-2017 PhD grant, the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO projects CTQ2016-75749-R and PID2019-110713RB-I00 and European Regional Development Fund (ERDF). / Lázaro Zaragozá, A. (2022). Study of Strategies for Genetic Variant Discrimination and Detection by Optosensing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185216 / TESIS / Compendio