Le projet concerne des molécules hétérocycliques, de faible poids moléculaire, présentant des activités cytotoxiques comparables à celles des meilleurs anticancéreux actuellement sur le marché. Ces molécules sont originales, protégées par un brevet international et un brevet de sélection déposé en décembre 2014. La synthèse des premières molécules leaders est maîtrisée et l’exemplification de la diversité moléculaire est en cours. Les études menées pour définir leur profil d’activité permettent d’identifier des caractéristiques tout à fait originales. Le projet, en phase de développement préclinique académique, a permis l’identification de composés leaders présentant des potentiels de développement en tant qu’anticancéreux. Le mécanisme exact des molécules développées est encore en cours d’étude et permettra de définir s’il s’agit d’un mode d’action unique ou multiple. Plusieurs têtes de séries ont pu être identifiées avec visiblement des modes d’actions différents. En effet, les composés EAPB0203 et EAPB0503 montrent un effet dose à partir de 1 µM sur la polymérisation de la tubuline mais la molécule EAPB02303, la plus active sur la lignée A375 (CI50 = 10 nM, de dix fois à cent fois plus active que les deux précédentes), ne montre aucune fixation à la tubuline à la dose de 1µM suggérant un mécanisme d’action différent et original. Le sujet de recherche présenté concerne le développement des études précliniques de ces molécules à visée anticancéreuse. Le premier axe de travail a été de mettre au point une formulation galénique de l'EAPB0503 sous forme de nanocapsules lipidiques. Afin d’optimiser la biodisponibilité des composés, sans perdre leur activité intrinsèque, nous avons ensuite réalisé une modulation chimique sur la structure la plus active des Imiqualines : l’EAPB02303. Afin d’améliorer la balance globale hydrophilie/lipophilie (HLB) des composés dérivés de l’EAPB02303, nous avons greffé un résidu acide aminé en position 4. Enfin, la mise au point d’une méthode de dosage de l’EAPB02303 et l’EAPB02302 en milieu plasmatique en vue d’une étude pharmacocinétique a été le dernier axe du travail de thèse. / The project relates to heterocyclic molecules, low molecular weight, having cytotoxic activities similar to those presented by the best anticancer agents currently on the market. These molecules are originals, protected by an international patent and a selection patent filed in December 2014. The synthesis of the first molecules leader is under control and the exemplification of molecular diversity is underway. Studies to define their activity profile allow to identify quite original features. The project, in its academic preclinical development phase, enabled the identification of leader’s compounds with potential for development as anticancer. The exact mechanism of the molecules developed is still under study and will determine whether there is a single or multiple mode of action. Several series leads were identified with apparently different modes of action. Indeed, compounds EAPB0203 and EAPB0503 show a dose effect from 1 µM on tubulin polymerization but compound EAPB02303, the more active on A375 cell line (IC50 = 10 nM, ten times to hundred times more active than the preceding two), shows no binding to tubulin at a dose of 1 µM suggesting a different and original mechanism of action. The research topic presented concerns the preclinical development of these anticancer molecules. The first line of work was to develop a galenic formulation of EAPB0503 in the form of lipid nanocapsules. To optimize the bioavailability of the compounds, without losing their intrinsic activity, we achieved chemical modulation on the most active structure Imiqualines: EAPB02303. To improve the overall balance hydrophilic / lipophilic (HLB) of compounds derived from EAPB02303, we considered grafting amino acids on position 4. Finally, the development of a method for assaying EAPB02303 and EAPB02302 in plasma for a pharmacokinetic study has been the final focus of the thesis work.

Pour aider à la protection de l’environnement et au diagnostic de maladies, il est nécessaire de disposer de méthodes d’analyse performantes. Ces méthodes doivent être rapides et peu coûteuses afin d’analyser un grand nombre d’échantillons et détecter la présence éventuelle de la molécule recherchée. C’est dans ce cadre qu’un bio-essai à double reconnaissance dédié aux petites molécules a été développé. Il repose sur l’utilisation d’aptamères comme élément de reconnaissance moléculaire et sur la formation de « kissing complex ». Les aptamères sont des oligonucléotides qui possèdent une grande spécificité et une grande affinité pour leur cible. Les « kissing complexes » désignent, quant à eux, l’interaction de deux séquences au niveau de leur boucle apicale. L’objectif de la thèse est de continuer l’étude et l’optimisation de ce schéma d’analyse, puis montrer sa potentialité et sa versatilité. Dans un 1er temps, la détection en multiplexe de plusieurs petites molécules a été mise en place. L’optimisation du système de détection a ensuite été effectuée pour la détection de l’adénosine avec le développement d’une nouvelle stratégie de détection. Enfin, un test colorimétrique basé sur l’utilisation de nanoparticules d’or a été décrit. / Bioanalytical tools based on molecular recognition elements constitute one of the most important strategies used to routinely quantify low molecular weight analytes in biological fluids or environmental matrices as disease-related biomarkers, drugs or toxins/contaminants. Recently, a novel aptamer-based sensing design has been reported. It is based on a dual recognition mechanism that involves the formation of functional nucleic acid architectures, named “kissing complex”. Aptamers are single stranded oligonucleotides that possess high affinity and high selectivity for their target. The aim of this thesis is to pursue the study and the optimization of this sandwich like scheme and to prove its potential. Firstly, the simultaneous detection of multiple small analytes by fluorescence anisotropy using the sandwich like scheme has been reported. Then, this novel bioassay has been optimized through the development of a new strategy. Finally, a gold nanoparticle colorimetric

La pharmacogénomique (PGx) étudie le concept selon lequel les déterminants génétiques peuvent aider à prédire la réponse clinique d’un patient aux médicaments. Les concentrations plasmatiques de ces derniers sont essentielles pour déterminer l’exposition, les profils pharmacocinétiques (PK), les effets cliniques et éventuellement les doses des médicaments, dont la plupart sont métabolisés par des enzymes hépatiques, les cytochromes P450 (CYPs). Néanmoins, la plupart des découvertes en matière de PGx concernant la prédiction des profils de concentrations des médicaments ont généralement recours à des plans d’études PK traditionnels avec une approche fonctionnelle. Bien qu’utile, cette méthodologie comporte des limites pour les études PGx, notamment le nombre restreint de sujets inclus, qui réduit la puissance statistique des associations PGx et limite l’identification de nouveaux variants génétiques moins fréquents. À l’inverse, les grandes cohortes observationnelles sont largement utilisées pour identifier des marqueurs génétiques physiopathologiques. Cette thèse de doctorat visait donc à 1) synthétiser les données publiées concernant les effets cliniques des polymorphismes génétiques de l’enzyme CYP2D6 sur le traitement au métoprolol, un agent β-bloquant. Les concentrations plasmatiques de métoprolol ont montré à plusieurs reprises qu’elles étaient fortement influencées par la PGx du CYP2D6; 2) développer une nouvelle méthode bioanalytique capable de quantifier les concentrations chirales de métoprolol des patients dans un contexte clinique; 3) mener une étude clinique en utilisant une grande cohorte observationnelle, ou biobanque, comme preuve de concept pour recréer l’association précédemment établie entre les phénotypes inférés des génotypes du CYP2D6 et les concentrations plasmatiques de métoprolol. Ces projets sont présentés en tant que chapitres de thèse et sous forme de manuscrits publiés. Le premier projet consistait en une revue systématique qui a permis d’extraire toutes les études relatives à la PGx du métoprolol-CYP2D6. La synthèse qualitative a suggéré que les métaboliseurs lents du CYP2D6, dépourvus de capacité enzymatique, avaient des valeurs plus élevées concernant les réductions de la fréquence cardiaque et de tension artérielle, ainsi que la survenue d’épisodes bradycardiques relativement aux autres phénotypes. Une méta-analyse ultérieure a confirmé la significativité de ces associations. Le deuxième projet a combiné des techniques bioanalytiques telles que la dérivation, l’extraction en phase solide et la chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem. Une méthode permettant de surmonter les limites analytiques antérieures a été validée avec succès pour mesurer les concentrations plasmatiques de (S)-métoprolol, l’énantiomère pharmacologiquement actif, et de son métabolite spécifique au CYP2D6. L’applicabilité d’une telle méthode a ensuite été démontrée grâce aux échantillons d’un groupe de patients issus de la Cohorte Hospitalière de l’Institut de Cardiologie de Montréal (ICM). Puis, le troisième projet présente la réalisation de l’étude LEVEL-PGx (LEVEraging Large observational cohort studies to identify pharmacogenetic determinants of drug dosing : A proof-of-concept study in the Montreal Heart Institute Hospital Cohort). L’étude portait sur un échantillon de >1000 patients sélectionnés dans la cohorte hospitalière de l’ICM, incluant leur génotypage pour CYP2D6 et la quantification du métoprolol racémique et de son métabolite spécifique au CYP2D6 dans des échantillons provenant de la Biobanque de l’ICM. Un seul échantillon unique et aléatoire par patient a été utilisé. Le recours à des modèles multivariables a validé le concept selon lequel de grandes cohortes transversales recueillant des échantillons biologiques pouvaient être utilisées afin d’identifier des associations PGx de concentrations de médicaments et ce, à des valeurs satisfaisant les seuils de significativité d’essais pangénomiques. D’autres analyses de cette cohorte ont indiqué que cette méthodologie parvenait à identifier des associations PGx qui influençaient la fréquence cardiaque au repos et la posologie du métoprolol à-travers les phénotypes du CYP2D6 et pour les déterminants génétiques uniques, même en présence de co-médications. Cependant, ces associations PGx avec les paramètres cliniques n’ont pas atteint une significativité applicable aux seuils pangénomiques. En résumé, par la reproduction d’une association PGx préalablement démontrée, l’ensemble des travaux présentés dans cette thèse suggère que l’identification et la découverte de nouveaux déterminants génétiques prédictifs des concentrations et des doses des médicaments pourrait s’effectuer par le biais de grandes cohortes observationnelles à l’échelle du génome. Ces approches permettraient de développer des modèles prédictifs plus précis de l’exposition et de la réponse aux médicaments, ce qui pourrait favoriser les découvertes PGx et, dans certains cas, éventuellement développer le potentiel translationnel d’une approche thérapeutique personnalisée selon le profil génétique des patients. / Pharmacogenomics (PGx) studies the concept that genetic determinants can help predict a patient’s clinical response to therapies. Drug concentrations are an essential component to determining the exposure, pharmacokinetic (PK) profiles, clinical effects, and potentially drug doses, most of which are metabolized through the cytochrome P450 (CYPs) liver enzymes. Nevertheless, most PGx discoveries regarding the prediction of drug concentration profiles have generally resorted to traditional PK study designs with a functional approach. Though useful, this methodology contains limitations for gene-drug interaction studies, most notably the restricted number of subjects included, which reduces the statistical power for PGx associations and limits the identification of new, less frequent genetic variants. On the opposite, large observational cohorts have long been utilized for identifying genetic markers of disease. This doctoral thesis therefore aimed to 1) synthesize published data regarding the clinical effects of CYP2D6 genetic polymorphism on metoprolol therapy. A β-blocker, metoprolol plasma concentrations have shown repeatedly to be heavily influenced by the PGx of the CYP2D6 enzyme; 2) develop a new bioanalytical method able to quantify patients’ chiral concentrations of metoprolol in a clinical setting; 3) conduct a clinical study using a large observational cohort, or biobank, as a proof of concept to recreate the previously established association between CYP2D6 genotype-inferred phenotypes and metoprolol plasma concentrations. Those projects are presented as thesis chapters in the form of published manuscripts. The first project was a systematic review that allowed us to find all studies pertaining to the PGx of metoprolol. The qualitative synthesis suggested that CYP2D6 poor metabolizers (PMs), without enzymatic capacity, had greater values regarding reductions in heart rate, blood pressures, and occurrences in bradycardia relative to non-PMs. A subsequent meta-analysis confirmed the significance of those associations. The second project combined bioanalytical techniques such as derivatization, solid phase extraction, and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. A method overcoming previous analytical shortcomings was successfully validated to measure (S)-metoprolol plasma concentrations and its CYP2D6-specific metabolite. Its application was later demonstrated in a group of patients from the Montreal Heart Institute (MHI) Hospital Cohort. Then, the third project presents the conduct of the LEVEL-PGx study (LEVEraging Large observational cohort studies to identify pharmacogenetic determinants of drug dosing: A proof-of-concept study in the Montreal Heart Institute Hospital Cohort). The study implicated a sample of >1000 selected patients selected from the MHI Hospital Cohort, along with the genotyping of CYP2D6, and the quantification of racemic metoprolol and its CYP2D6-specific metabolite in samples from the MHI Biobank. A single, random sample per patient was used. Multivariable modeling validated the concept that large observational cohorts collecting biospecimens could be utilized to identify PGx associations of drug concentrations with genome-wide significance. Further analyses in our cohort indicated that the tested PGx associations influenced resting heart rate and metoprolol daily drug dosage across CYP2D6 phenotypes and for single genetic determinants, regardless of interfering comedications. However, such PGx associations with clinical parameters could not achieve genome-wide significance. In summary, the body of work presented in this thesis suggested that, using a previously validated PGx association, the identification of novel genetic determinants predictive of drug concentrations and dosage could be discovered and identified at the genome-wide level with large observational cohorts. These approaches would help develop more accurate predictive models of drug exposure and response, which could favor PGx discoveries and the translational potential of a personalized approach to treatments according to a patient’s genetic profile.