Unlike characteristic HP1 proteins, the HP1c isoform of Drosophila melanogaster is a euchromatic protein. HP1c forms a complex with the zinc finger proteins ROW and WOC, which are crucial for HP1c function. In the present work, we aimed to further characterize the HP1c complex. We purified several novel factors that are associated with the complex. In particular, we characterize the ubiquitin receptor Dsk2 as an intrinsic subunit of the HP1c complex. Further, we show that the HP1c complex binds to TSS of actively transcribed genes and contributes positively to their transcription. The HP1c complex promotes an active chromatin state at target genes. We show evidence that this role involves regulation of H2Bub1 levels through Dsk2. / Al contrario de proteinas HP1 características, la isoforma HP1c de Drosophila melanogaster es una proteína eucromatica. HP1c se encuentra en un complejo con las proteínas “zinc finger” ROW y WOC, que son esenciales para la función de HP1c. En este trabajo, quisimos caracterizar el complejo HP1c en más detalle. Purificamos varios factores nuevos que se unen al complejo. En particular, caracterizamos el receptor de ubiquitina Dsk2 como una unidad principal del complejo HP1c. Además, demostramos que el complejo HP1c se une a TSS de genes que se transcriben activamente y que influye positivamente en su transcripción. El complejo HP1c favorece un estado activo de cromatina en los genes donde se encuentra. Nuestros resultados indican que este mechansimo incluye una regulación de los niveles de H2Bub1 a través de Dsk2

Intron removal is a necessary step for expression of most genes in higher eukaryotes, and alternative splice selection is a highly regulated mechanism that endows a single gene with the possibility to codify for multiple transcripts. Pre-mRNA splicing occurs largely co-transcriptionally, and its outcome is influenced by transcription elongation and chromatin structure. In this thesis we have used two different approaches to study novel links between chromatin structure and alternative splicing regulation. In the first approach, we identified genome-wide progesterone-regulated cassette exons and compared them with nucleosome density profiles, with the aim of finding correlations between changes in nucleosome positioning and changes in alternative splicing. We find that, even if all exons harbor a well-positioned exonic nucleosome, four different classes of nucleosome density profiles can be identified around alternative exons, which strongly correlate with the DNA sequence GC content. Transitions between these profiles occur upon hormone stimulation and can be correlated with alternative splicing changes, although changes in nucleosome profiles are also observed in non-regulated exons. In particular hormone-induced exon inclusion is more frequently linked to changes in nucleosome density than hormone-induced skipped exons, which tend to have low nucleosome density profiles even before hormone treatment. Peaks of nucleosome density before alternative exons tend to correlate with exon inclusion. In the second approach, we took advantage of ENCODE data of chromatin epigenetic signatures and RNA-Seq in multiple cell lines to evaluate functional enrichment of histone modifications over alternative exons. We find that three histone modifications (H3K4me3, H3K27ac and H3K9ac) co-occur in a subset of exons when they are highly included. These features are sufficient to predict differential inclusion levels in other cell lines. Moreover, they are enriched in exons characterized by the presence of DNase hypersensitive sites, promoter signatures and RNA Pol II accumulation. These observations suggest a functional role for 3-dimensional genome structure in the regulation of alternative splicing. / La eliminación de intrones es un paso necesario para expresar la mayoría de los genes en eucariotas superiores. La selección alternativa del corte y empalme (pre-mRNA splicing) es un mecanismo altamente regulado que dota a un solo gen con la posibilidad de codificar para múltiples transcritos. El splicing del pre-mRNA se produce en gran parte de manera cotranscripcional y por esto resultado está influenciado por la elongación de la transcripción y la estructura de la cromatina. En esta tesis se han utilizado dos enfoques diferentes para estudiar nuevos vínculos entre la estructura de la cromatina y la regulación del splicing alternativo. En el primer enfoque hemos identificado, a nivel de todo el genoma, exons internos regulados por progesterona y los hemos comparados con los perfiles de densidad de nucleosomas, con el objetivo de encontrar correlaciones entre los cambios en el posicionamiento de nucleosomas y en el splicing alternativo. Hemos encontrado que, aunque todos los exones albergan un nucleosoma bien posicionado, se pueden identificar cuatro clases diferentes de perfiles de densidad de nucleosomas alrededor de exones alternativos, que se correlacionan fuertemente con el contenido G+C en la secuencia del ADN. Las transiciones entre estos perfiles se producen tras la estimulación con la hormona y se pueden correlacionar con los cambios en splicing alternativo, aunque se observan también cambios en los perfiles de nucleosomas en exones no regulados. La inclusión de exones inducida por la hormona está relacionada más a menudo con cambios en la densidad de nucleosomas que la exclusión. Estos exones excluidos tienden a tener perfiles de baja densidad nucleosomal incluso antes del tratamiento hormonal. Los picos de densidad de nucleosomas antes de exones alternativos tienden a correlacionarse con la exclusión de exones. En el segundo enfoque nos aprovechamos de los datos de ENCODE de marcas epigenéticas de la cromatina y de RNA-Seq en múltiples líneas celulares, para evaluar el enriquecimiento funcional de las modificaciones de histonas en exones alternativos. Encontramos que tres modificaciones de las histonas (H3K4me3, H3K27ac y H3K9ac) co-ocurren en un subconjunto de exones mas incluidos. Estas características son suficientes para predecir los niveles de inclusión diferenciales de estos exones entre líneas celulares. Además, estos exones se caracterizan también por la presencia de sitios hipersensibles a la DNasa, de marcas de promotores y la acumulación de ARN Pol II . Estas observaciones sugieren un papel funcional para la estructura en 3 dimensiones del genoma en la regulación del splicing alternativo.

Les catequines i els seus polímers, les procianidines, són flavonoids presents en hortalissesi fruits amb efectes beneficiosos sobre la salut. Actuen com a antioxidants segrestantespècies reactives d'oxigen (ROS) i quelant els metalls ferro i coure. També es comportencom a molècules senyalitzadores, modulant múltiples vies de senyalització i metabòliques il'expressió gènica, incloent-hi la d'enzims antioxidants. Resultats previs del Grup de Recercaen Nutrigenòmica mostren que una dosi oral aguda d'un extracte de procianidines de llavorde raïm (GSPE) reprimeix l'expressió de les metal·lotioneïnes (MT), proteïnes lligadores dezinc, a fetge de rates, i tanmateix incrementa l'expressió del receptor nuclear orfe smallheterodimer partner.(SHP/Nr0b2) (Del Bas et al., 2005). Igualment, es va demonstrar que lesprocianidines actuen com a coactivadors transcripcionals del receptor nuclear d'àcids biliarsFarnesoid X Receptor (FXR), el qual es responsable de la sobre-expressió de SHP causadaper GSPE a cèl·lules hepàtiques, i de l'efecte hipotrigliceridèmic de les prociandines effect(Del Bas et al., 2008; Del Bas et al., 2009).Els objectius d'aquesta Tesi van ser determinar si les catequines i procianidinesinteraccionen amb el zinc, avaluar el seu efecte sobre l'homeòstasi del zinc en cèl·luleshepàtiques -incloent l'efecte sobre l'expressió de genes MT, utilitzats aquí com abiomarcadors de l'activitat de les procianidines a cèl·lules hepàtiques-, i disseccionar elsmecanismes pels quals les procianidines afecten l'homeòstasi del zinc, en particularconfirmar si els gens MT són dianes de SHP i FXR.Els resultats obtinguts mostren que GSPE, així com diverses catequines i procianidinespures, incloent-hi el flavonoid del te verd (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), lliguencations de zinc en solució amb una afinitat més gran que el quelant específic de zincZinquin. En cèl·lules d'hepatocarcinoma humanes HepG2, GSPE inhibeix l'acumulacióintracel·lular de zinc i contraresta els efectes tòxics de dosis elevades de zinc sobre laviabilitat cel·lular. GSPE reprimeix l'expressió de gens de MTs i d'exportadors de zinc mentreque estimula l'expressió d'importadors de zinc. L'expressió dels importadors de zinc de laxarxa Trans-Golgi és estimulada per GSPE. A més a més, GSPE bloqueja la inducció del'expressió de MTs per la citoquina proinflamatoria IL-6, pel generador de ROS tBOOH, perl'agonista de receptors de glucocorticoids dexametasona, i pels metalls coure i zinc.EGCG reprodueix els efectes de GSPE sobre l'homeòstasi del zinc en HepG2, reprimintl'expressió de MTs i d'exportadors de zinc, estimulant l'expressió d'importadors de zinc, iUNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILIEFFECTS OF DIETARY CATECHINS AND PROANTHOCYANIDINS ON ZINC HOMEOSTASIS IN HEPATIC CELLSIsabel Maria QuesadaISBN:978-84-694-1258-9/DL:T-322-2011inhibint l'acumulació de zinc intracel·lular i la toxicitat de dosis elevades de zinc. Laprocinidina dimèrica B1 i la trimèrica C1 es comporten tenen efectes contraris als de GSPE iEGCG pel que fa a l'expressió de MT i l'acumulació de zinc total en cèl·lules HepG2.Pel que fa al zinc làbil citoplasmàtic, la minúscula fracció del total del zinc cel·lular quemodula múltiples vies metabòliques i senyalitzadores, tant GSPE com EGCG i C1 eleven engran manera els nivells de zinc làbil detectable per Zinquin a cèl·lules HepG2.Experiments amb ratolins KO per SHP o per FXR han demonstrat que GSPE reprimeixl'expressió postprandrial de gens MT a fetge per una via que no depen de SHP però que ésdepenent de FXR. A més, l'àcid biliar CDCA, un lligand fisiològic i activador de FXR,reprimeix l'expressió de gens MT a cèl·lules HepG2. Per tant, els gens MT són diana de FXRi, conseqüentment, FXR apareix com un receptor nuclear que modula l'homeòstasi del zinc.Per explicar aquests resultats, proposem que catequines i procianidines poden actuar tantcom a segrestadors de zinc -evitant la seva entrada a la cèl·lula a través dels transportadorsde zinc de membrana plasmàtica-, com d'ionòfors de zinc -cotransportant cations zinc através de la bicapa lipídica i incrementant així els nivells de zinc làbil citoplasmàtic. Larepressió de gens MT induïda per l'activació de FXR per GSPE podria també contribuir al'increment de zinc làbil, en impedir que els cations zinc siguin segrestats per apo-tioneïnasintetitzada de novo.Donat el paper del zinc làbil com a modulador de múltiples víes de senyalització imetabòlics, formulem la hipòtesi que la quelació extracel·lular de cations de zinc i l'elevacióde zinc làbil citoplasmàtic són mecanismes subjacents a l'activitat biològica de catequines iprocianidines i, per tant, que les vies metabòliques i de senyalització afectades pel zinc làbil,ho seràn també per aquests flavonoids.Effects of dietary catechins and proanthocyanidins on zinc homeostasis inhepatic cells.Catechins and their polymers procyanidins are health-promoting flavonoids found in ediblevegetables and fruits. They act as antioxidants by scavenging reactive oxygen species andby chelating the redox-active metals iron and copper. They also behave as signalingmolecules, modulating multiple cell signaling and metabolic pathways and gene expression,including that of antioxidant enzymes. Previous results of the Nutrigenomics Reseach Groupshowed that an oral acute dose of a grape-seed procyanidin extract (GSPE) represses theexpression of the zinc-binding protein metallothionein (MT) genes in rat liver, and enhancesthe expression of the orfan nuclear receptor small heterodimer partner (SHP/Nr0b2) (Del Baset al., 2005). In addition, it was shown that procyanidins act as transcriptional coactivators ofthe nuclear bile acid receptor Farnesoid X Receptor (FXR), which in turns upregulates SHPexpression, thereby exerting an hypotrygliceridemic effect (Del Bas et al., 2008; Del Bas etal., 2009).The objectives of this Ph.D. Thesis were to determine whether catechins and procyanidinsinteract with the redox-inactive metal zinc, to evaluate their effect on zinc homeostasis inhepatic cells -including the expression of MT genes, used here as a biomarkers ofprocyanidin activity in hepatic cells-, and to disect the mechanisms by which procyanidinsaffect cellular zinc homeostasis, in particular to asses whether MT genes are targets of SHPand FXR.Our results show that GSPE, as well as individual catechins and procyanidins tested,including the green tea flavonoid (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), bind zinc cations insolution with higher affinity than the zinc-specific chelator Zinquin. In humanhepatocarcinoma HepG2 cells, GSPE inhibits intracellular zinc accumulation and counteractsthe toxic effects of excess zinc on cell viability. At the mRNA expression level, GSPEdownregulates MTs and zinc-efflux transporters while upregulating zinc-influx transporters.Zinc importers of the Trans-Golgi network are upregulated by GSPE. In addition, GSPEblocks the induction of MTs expression by the proinflammatory cytokine IL-6, the ROSgenerator tBOOH, the glucocorticoid receptor agonist dexamethasone, and the metalscopper and zinc.EGCG reproduces the major effects of GSPE on zinc homeostasis in HepG2, downregulingthe expression of MTs and zinc-efflux transporters, while upregulating the expression of zincinfluxtransporters, concomitantly inhibiting intracellular zinc accumulation and the toxicity of high zinc doses. Procyanidin dimer B1 and trimer C1 behave opposite to GSPE and EGCGwith regard to MT expression and intracellular zinc accumulation in HepG2 cells.Concerning cytoplasmic labile zinc, the tiny fraction of total cellular zinc that modulatessignaling and metabolic pathways, we found that GSPE, EGCG and trimeric procyanidin C1greatly elevate Zinquin-detectable labile zinc in HepG2 cells.Experiments with SHP-null and FXR-null mice demonstrate that GSPE downregulatespostprandial expression of MT genes in the liver, in a SHP-independent but FXR-dependentmanner. In addition, chenodeoxycholic acid, a physiological ligand and activator of FXR,represses the expression of MT genes in HepG2 cells. Thus, MT genes are targets of FXRand, consequently, FXR is revealed as a modulator of zinc homeostasis.To explain these results, we postulate that catechins and procyanidis may act both assequestrants of zinc -thereby impeding the entrance of zinc cations to the cell throughplasma membrane zinc transporters-, and as zinc ionophores -thereby cotransporting zinccations through the lipid bilayer and increasing the levels of cytoplasmic labile zinc.Repression of MT expression by procyanidin-activated FXR might also contribute to theincrement of the labile pool of zinc, by hindering the sequestration of zinc-cations by de novosynthesized apo-thionein.Given the role of labile zinc as modulator of multiple intracellular signaling and metabolicpathways, we forward the hypothesis that extracellular complexation of zinc cations andsubsequent elevation of cytoplasmic labile zinc may be relevant mechanisms underlying thehealth-promoting activity of catechins and procyanidins and, therefore, that the signaling andmetabolic pathways modulated by labile zinc will be aslo a target of these flavonoids.

L’enginyeria de sistemes bioinspirats ha crescut en importància i nombre d’aplicacions en el últims anys, atraient l’atenció dels científics sobre els seus usos potencials en camps com ara la bionanotecnologia, la nanomedicina i la ciència de materials. En aquesta tesis, es presenta una aproximació mitjançant mètodes computacionals a l’enginyeria de sistemes biomimètics. Em posat la nostra èmfasi en l’estudi teòric basat en principis fonamentals de sistemes peptídics, això vol dir des de mètodes mecànic quàntics d’alt nivell per als elements més bàsics fins a la simulació de tot o part del sistema en un ambient més realista a partir de diferents aproximacions computacionals. Un altre objectiu del present treball és la recopilació exhaustiva de la informació derivada dels estudis fets així com dels potencials usos en un sistema informàtic orientat a l’usuari d’emmagatzemament de dades. S’han caracteritzat anàlegs conformacionalment restringits de l’arginina, prolina i fenilalanina a través de càlculs mecànic quàntics d’alt nivell. Aquest aminoàcids no codificats (és a dir que no estan entre els 20 aminoàcids naturals) han demostrat la seva capacitat de modulació del perfil conformacional dels pèptids a on són introduïts. A més a més, indueixen resistència a l’acció de les proteases a banda d’introduir noves propietats electròniques i espectroscòpiques útils en aplicacions tals com els sistemes de diagnòstic, alliberadors de fàrmacs i del camp de l’enginyeria de materials. Els aminoàcids obtinguts són emprats per a modificar pèptids de “homing”, blocs proteics autoagregants i superfícies actives recobertes de pèptids. La remarcable quantitat d’informació sobre aminoàcids no codificats accessible en publicacions científiques expressa la necessitat urgent de sistemes que, basant-se en ordinadors recopilin, organitzin i ofereixin aquesta informació de manera intel·ligible per a l’usuari final. Una base de dades ha estat dissenyada, creada i posada en funcionament per tal d’emmagatzemar dades conformacionals teòriques sobre aminoàcids no codificats. La base de dades també conté, en cas que la informació sigui accessible, dades experimentals referents a aplicacions, caracterització estructural i propietats espectroscòpiques. En resum, aquests treball ofereix un nou enfoc a l’enginyeria assistida per ordinador i la gestió de la informació de sistemes bioinspirats des de les seves unitats més elementals fins al disseny de les aplicacions de major complexitat / The engineering of systems inspired by biochemical molecules has grown in importance and number of applications in the recent years, focusing the researchers’ attention in its potential uses in fields such as nanotechnology, bionanotechnology, nanomedicine and material sciencie. A computational approach to engineering of biomimetic systems is presented in this work. Our emphasis is put on theoretical studies of some peptidic systems from scratch, this means from the use high level quantum mechanics studies of their primary building blocks to the simulation using different computational approaches of their behavior as part of an entire system in a more realistic environment. The thorough compilation of the derived information and its potential uses in a proper user-friendly data-storage support is also a question dealt in the thesis. Conformationaly restricted analogues of arginine, proline and phenylalanine amino acids are designed and fully characterized using high level quantum mechanics methods. These new non-coded amino acids (non-naturally occurring amino acids in proteins) demonstrate to modulate the conformational profile of peptides where they are inserted. Furthermore, they induce resistance to proteolysis altogether with new electronic and spectroscopic features useful in diagnostics, drug delivery and material engineering. The developed non-coded amino acids are used to engineer systems such as homing peptides, self-aggregating protein building blocks and peptide-coated active surfaces. The remarkable amount of information available about non-coded amino acids in scientific publications stressed out the dire need of computer-based systems to gather, to organize and to display in a user-friendly way the information about these compounds. A data base has been designed, implemented and run to store theoretically-obtained conformational information on non-coded amino acids. The data bases also contains, if available, experimentallyacquired knowledge such us structural and spectroscopic characterizations and reported applications. To conclude, this thesis offers a successful approach to the computer-aided engineering and information management of bioinspired systems from their basics to high complexity design.

High Mobility Group proteins (HMG) are architectural factors involved in modulating chromatin structure and influencing a myriad of cellular processes such as transcription, replication and DNA repair. Altered levels of expression and mislocalization of these proteins have several pathological outcomes such as cancer and inflammatory processes. Understanding how the different HMG proteins recognize DNA and which changes can induce in it is still a challenge, and will be of great importance to interpret their activities in vivo. For this purpose, the aim of this work is to obtain the atomic structure of HMG proteins in complex with DNA using X-ray crystallography. In this work, we have studied two HMG families: HMGA and HMGB. Both bind to the minor groove of the DNA but are distinguished by their binding motifs: AT-hook motif (HMGA) and HMG-box motif (HMGB). AT-hooks are short positively charged flexible segments that bind preferentially to AT rich regions whereas HMG-box domains contain ~75 amino acids and have a characteristic L-shaped fold consisting of three a-helices and bind to DNA with limited or no sequence specificity. We have expressed and purified the HMGA1a protein, the fragment HMGA1b(1-79), the fragments Box A, Box B and Box A+B of the HMGB1 and the NHP6A (yeast HMGB). We have performed crystallographic assays of the complexes of AT rich oligonucleotides with these proteins (as well as with synthetic peptides corresponding to the AT-hook motif). We have studied the packing of some of the obtained crystals. As a major contribution of this thesis, we report the crystal structure of the HMGB1 Box A domain bound to the oligonucleotide ATATCGATAT at a resolution of 2 Å. It demonstrates a new mode of DNA recognition for HMG-box proteins. Two Box A domains act together kinking the DNA by 85º. In this unusual configuration the Phe37 of both domains stack together and intercalate the same CG base step. This duplex shows the greater distortion in just a base pair step that we have evidence for complexes with HMG-box domains. / Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són considerades com a factors arquitectònics del DNA que modifiquen l'estructura de la cromatina afectant així diversos processos cel·lulars com la transcripció, la replicació i la reparació del DNA. L'alteració en els nivells d'expressió normals d'aquestes proteïnes i la seva deslocalització estan relacionades amb nombrosos processos patològics com ara el càncer o la inflamació. Per a poder interpretar l'activitat de les proteïnes HMG in vivo és molt important entendre els mecanismes de reconeixement en la unió al DNA que presenten les diferents famílies d'HMG així com els canvis que poden provocar en aquest, fet que representa encara un repte. Amb aquesta finalitat, en aquest treball ens hem proposat obtenir l'estructura atòmica dels complexos de diverses proteïnes HMG amb DNA mitjançant cristal·lografia de raigs X. Hem treballat amb dues famílies de proteïnes HMG: les HMGA i les HMGB. Ambdues s'uneixen al solc menor del DNA però es diferencien pels seus motius d'unió: motiu AT-hook (les HMGA) i motiu HMG-box (les HMGB). Els AT-hooks són cadenes curtes bàsiques i flexibles que s'uneixen preferentment a regions riques en ATs, mentre que els dominis HMG-box, compostos per uns 75 aminoàcids, presenten una forma d'L constituïda per tres hèlixs alfa i una especificitat de seqüència d'unió al DNA reduïda o inexistent. Durant el transcurs d'aquest treball s'han expressat i purificat la proteïna HMGA1a, el fragment HMGA1b(1-79), els fragments corresponents al Box A, Box B i Box A+B de l'HMGB1 i la proteïna NHP6A (HMGB de llevat) i s'han dut a terme assajos cristal·logràfics dels complexos d'oligonucleòtids rics en ATs amb aquestes proteïnes (així com amb pèptids sintètics corresponents als motius AT-hook). S'ha pogut estudiar l'empaquetament d'alguns dels cristalls obtinguts d'aquests complexos. L'aportació més important d'aquesta tesi és la resolució de l'estructura tridimensional d'un complex del domini Box A de l'HMGB1 amb l'oligonucleòtid ATATCGATAT a una resolució de 2 Å. Aquesta demostra un nou mode de reconeixement de DNA lineal per part dels dominis HMG-box. En l'estructura, dos dominis Box A s'uneixen a un mateix dúplex de DNA provocant un doblegament d'aquest de 85º. En aquest mode d'unió inusual, les Phe37 d'ambdós dominis s'intercalen en el mateix pas CG. Aquesta estructura presenta un dúplex amb la major distorsió en un únic pas de la que tenim constància per un complex del domini HMG-box.

Objectives: Three objectives of this thesis have been: (i) Mastering of the main analytical platforms used in metabolomics, (ii) Developing an untargeted metabolomic workflow, involving novel aspects of sample preparation, and data processing for metabolite identification, (iii) Implementing our untargeted metabolomic workflow to the study of human patients with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) and their response to drug treatment Results: In Work 1: Optimization metabolite extraction conditions for NMR analysis, followed by LC/ESI-MS by using the same sample extract with no need for solvent exchange or further pretreatment. In Work 2: Investigate the impact of different aspects of univariate statistical analysis on untargeted LC-MS based metabolomic experiments. In Work 3: Implementation of GC-MS untargeted metabolomic approach to provide new insights on the impact that obesity exerts on the metabolic derangements associated with PCOS. In Work 4: Implementation of multiplatform metabolomics approach based on NMR and LC-MS to provide new insights in PCOS disease in a cohort of young lean PCOS patients. In Work 5: Implementation of multiplatform metabolomics approach based on NMR, GC-MS and LC-MS to provide new insights on the action of drug polytherapy to PCOS disorder. Conclusion: Metabolomics can be consider as a powerful tool for the study of metabolic disorders. Furthermore, metabolite profiling has demonstrated feasibility and flexibility for revealing new mechanistic insights in metabolic disorders that are not been consider when classical analysis is used. Therefore, our metabolomic analysis have demonstrated a great potential as a useful diagnostic technique and can facilitate monitoring of both disease progression and effects of therapeutic treatment. / Objetivos: El presente trabajo tiene dos objetivos generalizables que han sido estudiados con más detalle en la presente tesis doctoral. El primero de ellos es mejorar aspectos metodológicos en el ámbito de la metabolómica y el segundo ha sido la aplicación de la metabolómica en el estudio del síndrome del ovario poliquístico (PCOS). Resultados: Del primer objetivo se han realizado dos trabajos: en el primero, la optimización de un método de extracción común para analizar muestras biológicas en dos plataformas analíticas complementarias utilizadas en metabolómica como son la resonancia magnética nuclear y la espectrometría de masas. Del segundo trabajo realizado se han obtenido unas pautas para abordar los retos que surgen del análisis de datos de metabolómica en espectrometría de masas. Del segundo objetivo también han sido realizados dos trabajos: en ambos se ha utilizado la metabolómica no dirigida para abordar el estudio del PCOS. En el primer trabajo, se ha utilizado la metabolómica para conocer el impacto que ejerce la obesidad en los trastornos metabólicos asociados al PCOS. En el segundo trabajo, se ha utilizado la metabolómica no dirigida para evaluar como afecta la aplicación de una politerapia con medicamentos al metabolismo de pacientes con PCOS. Conclusión: La metabolómica puede ser utilizada como una nueva herramienta para estudiar los trastornos metabólicos.

Els productes naturals derivats de plantes són una font abundant de compostos biològicament actius, molts dels quals han servit de base pel desenvolupament de productes nutracèutics i farmacèutics. El disseny de fàrmacs assistit per ordinador juga un paper essencial en la identificació de productes naturals bioactius, reduint els costos i esforços experimentals. La diabetis mellitus tipus 2 és considerada com "l’epidèmia del segle 21" i, en conseqüència, és un dels principals reptes en el descobriment de fàrmacs en l'actualitat. Per tant, aquesta tesi doctoral es centra en la identificació de nous compostos i extractes naturals que actuïn com a agents antidiabètics. En aquest sentit, PPARgamma i DPP-IV han estat les dianes estudiades, en les quals s’han desenvolupat i validat diferents protocols de cribatge virtual. Els compostos bioactius trobats poden ser de gran utilitat com additius en l’alimentació funcional adreçada en la prevenció o tractament de la diabetis. / Natural products derived from medicinal plants are an abundant source of biologically active compounds, many of which have formed the basis for development of nutraceuticals and pharmaceuticals compounds. Computer-aided drug design methods such as virtual screening workflows play an essential role in the identification of undescribed bioactivities of natural products by minimizing the synthetic and biological testing efforts. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is considered to be the “epidemic of the 21st century” and, consequently, is one of the main challenges in drug discovery today. There is a significant unmet medical need for better drugs to treat T2DM because some therapies suffer undesirable side effects. Therefore, this PhD thesis is focus on the identification of new natural compounds as antidiabetic agents. In that sense, PPARgamma and DPP-IV have shown to be appropriate targets for antidiabetic drugs, targeting them appears to have good prospects for a successful therapeutic approach in the T2DM.

Les dues proteïnes estudiades en aquest treball (ECP o RNasa 3 i RNasa 1ΔN7) pertanyen a la superfamília de la RNasa A i resulten d'especial interès per la seva potencial aplicació en la teràpia i/o diagnòstic del càncer.A més de la seva capacitat ribonucleolítica, l'ECP presenta d'altres activitats, com l'antibacteriana, l'helmintotòxica o la citotòxica contra cèl·lules i teixits de mamífers. Per la RNasa 1 de tipus pancreàtic expressada per les cèl·lules endotelials humanes també s'ha proposat un paper defensiu. La RNasa 1ΔN7, en canvi, no presenta aquest tipus d'accions biològiques, si bé cal destacar la menor afinitat que exhibeix enfront el seu inhibidor específic en relació a d'altres membres de la família.Tant l'ECP com la RNasa 1ΔN7 s'han cristal·litzat emprant la tècnica de la difusió de vapor en gotes penjants, i s'han determinat les seves estructures tridimensionals (3D) mitjançant el mètode del reemplaçament molecular. Per l'afinament de les estructures s'han usat dades fins a 1,75 i 1,90 Å respectivament.Ambdòs molècules exhibeixen el plegament típic  +  que caracteritza a tots els membres de la superfamília de la RNasa A. Tanmateix, les diferències que mostren en comparació amb l'estructura d'altres RNases permeten explicar, d'una banda, la baixa activitat ribonucleolítica d'aquests enzims i, de l'altra, les seves peculiaritats funcionals. / The proteins studied in this work (ECP or RNase 3 and RNase 1ΔN7) belong to the RNasa A superfamily and their potencial aplication in the therapy and diagnosis of cancer is the base of the present study.Besides its ribonuclease activity, ECP is bactericidal, helminthotoxic and cytotoxic to mammalian cells and tissues. Human endothelial cells expres a pancreatic-type ribonuclease (RNase 1) also involved in defensive functions. In contrast, RNasa 1ΔN7 does not present this kind of special activities, but shows a reduced affinity for the specific ribonuclease inhibitor in comparison with other members of the family.The recombinant proteins have been crystallized by the vapour diffusion method from hanging drops and their crystal structures have been determined by molecular replacement. The refinement of ECP and RNase 1ΔN7 structures has been performed using X-ray diffraction data up to 1,75 and 1,90 Å respectively.Both molecules display the  +  folding topology typical for members of the RNase A superfamily. However, there are some differences that provide an explanation for their low ribonucleolytic activity and, on the other hand, may explain their other particular properties.

Investigation of protein-ligand interactions has been a long-standing application for molecular dynamics (MD) simulations given its importance to drug design. However, relevant timescales for biomolecular motions are orders of magnitude longer than the commonly accessed simulation times. Adequate sampling of biomolecular phase-space has therefore been a major challenge in computational modeling that has limited its applicability. The primary objective for this thesis has been the brute-force simulation of costly protein-ligand binding modeling experiments on a large computing infrastructure. We have built and developed GPUGRID: a peta-scale distributed computing infrastructure for high-throughput MD simulations. We have used GPUGRID for the calculation of protein-ligand binding free energies as well as for the reconstruction of binding processes through unguided ligand binding simulations. The promising results presented herein, may have set the grounds for future applications of high-throughput MD simulations to drug discovery programs.

A part de la secreció convencional, en la qual les proteïnes són transportades a través del reticle endoplasmàtic (RE) i de l'aparell de Golgi, s'han descrit, per a diferents proteïnes i en organismes diversos, rutes de secreció no-convencional que circumval·len l'aparell de Golgi. No obstant, aquests mecanismes de secreció no estan ben entesos. Se sap que per a la secreció no-convencional de la proteïna d'unió a acil-CoA Acb1 a Saccharomyces cerevisiae són necessàries diverses proteïnes, com ara l'ortòleg de GRASP Grh1, proteïnes relacionades amb l'autofàgia, proteïnes involucra-des en la fusió de membranes amb els endosomes, membres de la maquinària ESCRT, i la t-SNARE de la membrana plasmàtica Sso1. La manera per la qual totes aquestes proteïnes cooperen per a dur a terme la secreció d'Acb1 és encara una incògnita. Els resultats de les nostres investigacions indiquen que sota inani-ció de nutrients, condició que indueix la secreció no-convencional d'Acb1, Grh1 es concentra en estructures membranoses prop dels llocs de sortida del RE, de manera dependent de fosfatidilinositol-3-cinasa. Aquestes membranes, en forma de tassa, estan enriqui-des en PI(3)P i contenen la proteïna d'ESCRT-I Vps23 així com les proteïnes d'autofàgia Atg8 i Atg9, reunint així diverses proteïnes necessàries per a la secreció d'Acb1. Hem batejat aquestes estructures CUPS (per les sigles en anglès de compartiment per a la secreció no-convencional de proteïnes), basant-nos en la seva forma i el seu contingut. Proposem que els CUPS són l'estació de sortida per a la formació d'intermediaris vesiculars dedicats a la secreció no-convencionals que contenen Acb1. / Besides conventional secretion, in which proteins are transported through the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi complex, unconventional secretion routes bypassing the Golgi complex have been described for different proteins in several organisms. How-ever, the mechanisms of their release remain poorly understood. It was reported that the unconventional secretion of the acyl-CoA binding protein Acb1 from Saccharomyces cerevisiae requires a diverse group of proteins including the GRASP ortholog Grh1, autophagy-related proteins, proteins involved in fusion of membranes with endosomes, members of the ESCRT-machinery, and the plasma membrane t-SNARE Sso1. How these proteins work together for Acb1 secretion remains elusive. Our findings indicate that upon nutrient starvation, the condition known to induce unconventional secretion of Acb1, Grh1 is concentrated in a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent manner to unique membrane structures near the ER exit sites. These membranes –shaped like cups– are enriched in PI(3)P and contain the ESCRT-I protein Vps23 as well as the autophagy-related proteins Atg8 and Atg9 thereby bringing together different proteins required for Acb1 secretion. We have named these structures CUPS (Compartment for Unconventional Protein Secretion), based on their shape and content. CUPS, we propose, are the starting point for the formation of Acb1-containing vesicular intermediates dedicated for unconventional secretion.