The existence of GPCRs at the cell nucleus is not universal and these nuclear receptors were reported to evoke functions related to gene transcription while plasma membrane receptors induce mostly acute non-genomic effects. Protease-activated receptor 2 (PAR-2) is a member of the GPCR family. Although many responses induced by PAR-2 can result from its activation at the cell surface, nuclear localization of PAR-2 has been detected in cell tissues. However, the origin of nuclear GPCRs and the mechanisms leading to such localization are not known. Therefore, we used PAR-2 as a model to evaluate whether peptide-activated GPCRs translocate to the cell nucleus. We investigated the possible contributions of PAR-2 nuclear translocation to gene induction and retinal angiogenesis. In addition, we aimed to study the mechanism of nuclear PAR-2 regulation of gene expression. / Cell surface PAR-2 translocated to the nucleus upon stimulation. PAR-2 nuclear translocation pathway is independent of clathrin and caveolin but requires intact microtubules. The C-terminal domain and both NLS sequences of PAR-2 are important for its nuclear translocation. Importinb1 and SNX11 are shown to interact with PAR-2 and are essential for nuclear translocation of the receptor. VEGF expression induced by PAR-2 activation is dependent on nuclear translocation of the receptor. Silencing PAR-2 or SNX11 decreased mice retinal neovascularization while re-expression of PAR-2 in PAR-2 knockout mice was shown to restore normal neovascularization of the retina. Activation of PAR-2 resulted in the interaction of the receptor with Sp1 transcription factor in the nucleus. Sp1 is essential for the regulation of PRIM1 and VEGF gene expression induced by PAR-2 and for PAR-2 regulation of cell proliferation and migration. / In conclusion, PAR-2 at the cell nucleus contributes in serving distinct functions from PAR-2 at the cell surface, specifically induction of major proangiogenic genes both in in vitro and in in vivo model of angiogenesis. Sp1 transcription factor plays an important role in the regulation of gene expression induced by nuclear PAR-2 activation. / La présence de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) au noyau cellulaire n'est pas universelle et il a été suggéré que ces récepteurs nucléaires possèdent des fonctions de transcription de gènes, tandis que les récepteurs au niveau de la membrane plasmique semblent plutôt induire des effets aigus indépendants de la transcription de gènes. Le récepteur activé par protéase 2 (PAR-2) fait partie de la famille des RCPG. PAR-2 au noyau a été observée dans divers tissus cellulaires. L'origine des RCPG au noyau et les mécanismes menant à cette localisation ne sont pas connus. En utilisant PAR-2 comme modèle, le but de ce travail était d'évaluer si l'activation des RCPG par des peptides mène à leur translocation au noyau. Nous avons étudié les rôles possibles de la translocation nucléaire de PAR-2 dans l'induction de l'expression génique et l'angiogénèse rétinienne. De plus, nous voulions aussi étudier le mécanisme de régulation de l'expression génique du PAR-2 nucléaire. / PAR-2 était transloqué de la membrane plasmique au noyau suite à sa stimulation. Cette translocation est indépendante de la clathrine et des cavéolines, mais nécessite des microtubules intactes. Le domaine C-terminal et les deux séquences NLS de PAR-2 sont importants pour sa translocation nucléaire. L'importineb1 et le SNX11 interagissent avec PAR-2 et sont essentiels pour la translocation nucléaire du récepteur. L'expression de VEGF induite par l'activation de PAR-2 est dépendante de la translocation nucléaire du récepteur. L'expression de PAR-2 et de SNX11 sont essentielles pour une néovascularisation normale de la rétine de souris. L'activation de PAR-2 résultait en une interaction du récepteur avec le facteur de transcription Sp1 au niveau du noyau cellulaire. Sp1 est essentiel pour la régulation de l'expression génique de PRIM1 et VEGF induite par la stimulation de PAR-2 et pour la régulation de la prolifération et migration cellulaire. / En conclusion, PAR-2 au niveau de la membrane plasmique diffère de PAR-2 au noyau dans la régulation des gènes pro-angiogéniques, plus spécifiquement dans l'induction des gènes pro-angiogéniques tant au niveau in vitro que in vivo. Sp1 joue un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes induite par l'activation de PAR-2 nucléaire.

Extensive research indicates that the pregnancy/lactation hormone prolactin (PRL) and its downstream pathway Jak2/Stat5a are required for lobuloalveolar growth/morphogenesis of the mammary gland and terminal differentiation of mammary epithelial cells. The role of PRL in breast cancer development and progression is yet to be fully elucidated. While some studies have indicated that PRL may enhance breast cancer cell viability these effects may not fully describe the role of PRL in breast carcinogenesis. Importantly, recent evidence including data generated from our laboratory indicates that PRL may suppress certain aspects of breast carcinogenesis. Indeed, our laboratory has previously shown that PRL is an effective suppressor of epithelial-mesenchymal transformation process and the invasive potential of breast cancer cells. Therefore, the aim of my project was to characterize the role of PRL and its signaling mechanisms leading to the establishment and maintenance of mammary epithelial architecture. / In mammals, epithelial cell polarity is defined by tight junctions which separate apical from basolateral membrane domain. These processes are regulated by a conserved protein complex designated as the Par complex consisting of par6-PKCζ-par3. Using the mouse mammary epithelial cells HC11 we showed that in contrast to EGF, PRL in combination with hydrocortisone and insulin induces formation of mammospheres on Matrigel with complete lumen and apical/basal polarity as determined by apical localization of ZO1 and basal/lateral localization of E-cadherin. Furthermore, our results indicate that Jak2 kinase plays an important role in determining cell polarity. Indeed, specific Jak2 knockdown in HC11 cells led to complete loss of lumen formation and apical/basal polarity of the mammospheres. Moreover, Jak2 knockdown cells showed not only disruption of ZO1 localization but also that of Par3 in 2D and 3D cultures. In addition, our results showed that PRL promoted tyrosine phosphorylation of the Par3 and Par complex formation. Our data together indicate that PRL regulates cell polarity through tyrosine phosphorylation of Par3 via Jak2, thereby promoting the Par complex formation and localization to the membrane. Our results showed that PRL has a critical role in regulating epithelial polarity. Since the establishment and maintenance of cell polarity is required for the development of all metazoans, and disruption of cell polarity is a hallmark of malignant cancer our results also implicate PRL as an invasion suppressor in breast cancer cells. / Recherche approfondie indique que l'hormone de la grossesse et de la lactation prolactine (PRL) et sa voie de signalisation en aval Jak2/Stat5a sont nécessaires à la croissance et à la morphogenèse lobulo-alvéolaire de la glande mammaire ainsi qu'à la différentiation finale des cellules épithéliales mammaires. Le rôle de la PRL dans le développement et la progression du cancer du sein n'est pas encore parfaitement connu. Bien que certaines études indiquent que la PRL pourrait améliorer la viabilité des cellules du cancer du sein, cet effet ne pourrait suffisamment décrire le rôle de la PRL dans la carcinogenèse du sein. De récentes preuves, incluant des données obtenues par notre laboratoire, indiquent de manière significative que la PRL pourrait supprimer certains aspects de la carcinogenèse du sein. En effet, notre laboratoire a déjà montré que la PRL est un efficace suppresseur du processus de transformation épithélial-mésenchymateux et du potentiel invasif des cellules du cancer du sein. Par conséquent, le but de mon projet était de caractériser le rôle de la PRL et de ses mécanismes menant à l'établissement et au maintien de l'architecture épithélial mammaire. / Chez les mammifères, la polarité des cellules épithéliales est définie par les jonctions serrées qui séparent le domaine membranaire apical du basolatéral. Ces processus sont régulés par un complexe protéique conservé appelé complexe Par qui consiste en par6-PKCζ-par3. En utilisant les cellules épithéliales mammaires de souris HC11, nous avons montré qu'à la différence de l'EGF, la PRL, associée à l'hydrocortisone et à l'insuline, induit la formation de mammosphère sur des Matrigel avec une lumière entière et une polarité apicale/basale mises en évidence par la localisation apicale de ZO1 et par la localisation basale/latérale de l'E-cadhérine. De plus, nos résultats indiquent que la kinase Jak2 joue un rôle important dans la détermination de la polarité cellulaire. En effet, la diminution spécifique de Jak2 dans les cellules HC11 a mené à une perte complète de la formation de la lumière et de la polarité apicale/basale des mammosphères. Par ailleurs, la diminution de Jak2 n'a pas seulement montré la perturbation de la localisation de ZO1 mais aussi celle de Par3 en cultures 2D et 3D. Nos résultats ont également montré que la PRL promouvait la phosphorylation des tyrosines de Par3 et la formation du complexe Par. L'ensemble de nos données indique que la PRL régule la polarité cellulaire à travers la phosphorylation des tyrosines de Par3 via Jak2, d'où la promotion de la formation du complexe Par et de sa localisation à la membrane. Nos résultats ont montré que la PRL a un rôle critique dans la régulation de la polarité épithéliale. Du moment où l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire sont requis pour le développement de tous les métazoaires et où la perturbation de la polarité cellulaire est une caractéristique des cellules malignes, nos résultats impliquent également la PRL comme un suppresseur invasif des cellules de cancer du sein.

The scaffolding protein intersectin1 is involved in clathrin-mediated endocytosis, apoptosis, signal transduction and regulation of cytoskeletal rearrangements. Thus, understanding the interactions of intersectin1 with other proteins has important consequences for cell biology. It had previously been shown that Cdc42 GTPase-activating protein (CdGAP) is inhibited by intersectin1, resulting in increased actin polymerization and lamellipodia formation. The central basic-rich region of CdGAP has been shown to bind to the intersectin1 SH3D, despite not containing any previously described SH3 binding motifs. Several CdGAP peptides from its basic-rich region were found to bind to the intersectin1 SH3D in peptide array experiments, and therefore were proposed to contain novel SH3 binding motifs. Binding of a peptide causes specific chemical shift perturbations in the nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum of a protein. In this study NMR spectroscopy was used to validate the interaction of the intersectin1 SH3D domain with peptides from several putative binding partners. The basic-rich CdGAP peptides identified in the peptide array experiments did not bind to recombinant intersectin1 SH3D in NMR titrations. Two peptides from dynamin containing typical SH3 binding motifs did not bind to intersectin1 SH3D; however, a longer proline-rich peptide from synaptojanin binds weakly. Based on homology to this synaptojanin peptide, a novel CdGAP peptide was identified that did bind to the intersectin1 SH3D. Chemical shift data was used to map the binding sites of each peptide onto the previously published structure of intersectin2 SH3D. The binding sites of the two peptides overlap, and include residues that are highly conserved amongst SH3 domains. This is the first identification of a peptide from CdGAP that binds to intersectin1 SH3D, and its homology to the synaptojanin peptide helps define the atypical binding motif of the intersectin1 SH3D domain. This study se / La protéine structurale intersectine1 est impliquée dans l'endocytose, l'apoptose, la transduction de signaux ainsi que la régulation des réarrangements du cytosquelette. La compréhension des interactions d'intersectine1 avec d'autres protéines a des conséquences importantes pour la biologie cellulaire. L'activité de la protéine activatrice de la GTPase Cdc42 (CdGAP) est empêchée par l'intersectine1 ce qui augmente la polymérisation des d'actine. La région centrale basique de CdGAP qui contrôle la liaison de la protéine avec ses substrats ne contient aucun motif qui se lie aux domaines SH3. Quelques peptides de de cette région se lient à intersectine1 SH3D en utilisant un criblage d'une banque de peptides, et ont été proposés de contenir des motifs SH3 nouveaux. La liaison avec un peptide entraîne des perturbations de déplacements chimiques dans le spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) d'une protéine. Dans cette recherche, la RMN fut utilisée pour étudier l'interaction du domaine SH3D de l'intersectine1 avec des peptides de quelques associés putatifs. Les peptides de CdGAP qui furent identifiés lors du criblage d'une banque de peptides ne se lient pas à l'intersectine SH3D recombinante. Deux peptides de la protéine dynamine qui contiennent des motifs SH3 typiques ne se lient pas avec l'intersectine1 SH3D, mais un plus long peptide de synaptojanine, riche en proline, se lie faiblement. Un peptide de CdGAP, identifiée par homologie avec ce peptide, s'est aussi lié. Les changements de déplacements chimiques furent utilisées pour déterminer le site de liaison sur la structure de l'intersectine2 SH3D. Les sites de liaison des deux peptides se superposent. Cette liaison se produit avec des acides aminés qui sont conservés parmi les domaines SH3. Ceci est le premier peptide de CdGAP qui se lie à l'intersectine1 SH3D. Son homologie au peptide de synaptojanine peut aider la caractérisation de ce motif de liai

The AAA ATPase p97/VCP functions in numerous cellular pathways. The molecular function of p97 in any of these pathways is specifically determined by the adaptor protein it is bound to. I am interested in studying new p97 functions, specifically their role related to cancer, such as apoptosis and cytoskeletal rearrangements. I initially focused on identifying the apoptotic adaptor of p97. I showed that PTEN is not the adaptor linking p97 to apoptosis through immunoprecipitation. Bioinformatics analysis revealed 14 potential p97 adaptors. FAF1 is the one involved in apoptosis, while Socius is a candidate for cytoskeletal rearrangements. I was able to outline a general strategy of how to determine and functionally classify candidate p97 interacting proteins.

The adenovirus protein E4orf4 kills cancer cells but not normal primary cells. The possibility of developing a drug that mimics the killing by E4orf4 for cancer therapy is therefore of great interest but its mechanisms of action first need to be elucidated. Studies over the past decade have shown that E4orf4 induces p53-independent, caspase-independent cell death in a PP2A Balpha-dependent manner. In an effort to better understand its mechanism of action and identify putative cell death targets, the localization to function relationship of E4orf4-induced cell death was investigated. Here, I show that E4orf4 has a predominant nuclear localization following expression even though small amounts are observed in the cytoplasm and that, in addition, it can induce cell death both from the nucleus and from the cytoplasm when artificially targeted to these sites using well-characterized, exogenous localization signals. Furthermore, I identify an arginine-rich signal in E4orf4 spanning residues 66 to 75 (E4ARM) that mediates nuclear and nucleolar localization of E4orf4 and I show that, importantly, it contributes to at least 50% of E4orf4-induced cell death activity. Finally, I demonstrate that wild-type E4orf4 associates with several nuclear bodies such as viral replication centers, nucleoli, perinuclear bodies and PML bodies during adenovirus infection but that association with these structures is not essential for virus growth as mutants that are defective for E4orf4 expression generally replicate as efficiently as wild-type virus. However, I also show that a virus encoding a mutant form of E4orf4 accumulating at PML bodies during infection has a dominant negative effect on virus growth, thus highlighting the functional importance of nuclear bodies during cellular growth and adenovirus infection.

Changes in extracellular matrix (ECM) deposition along with increases in airway smooth muscle (ASM) mass are characteristic features of airway remodeling which contribute to asthma pathophysiology. Modifications in ECM include increased collagen deposition and altered proteoglycans (PGs) levels. While biglycan, a small leucine-rich PG (SLRP), deposition is generally increased, changes in decorin, another SLRP, are more variable. The interaction between the cell and the surrounding ECM triggers numerous cellular responses, which modulate functions such as survival, proliferation and differentiation. Since decorin and biglycan are known to influence cell behaviour in various types of cells, we hypothesized that these molecules would affect human airway smooth muscle cell (HASMC) function. We sought to determine the effects of decorin and biglycan on HASMC proliferation, apoptosis and attachment, and to explore the putative mechanisms responsible for these effects. Collagen type I was used as a control.Culture on a decorin matrix caused a decrease in HASMC number, which was attributed to a decrease in proliferation and an increase in apoptosis. Culture on biglycan caused an initial decrease in cell number that was not sustained. Collagen caused a significant increase in cell number. Neither biglycan nor collagen caused changes in proliferation or apoptosis. Subsequent experiments showed that cell anchorage to decorin and biglycan matrices caused abnormal focal adhesion and cytoskeletal organization, as well as, increases in alpha2 integrin protein levels as compared to cells seeded on collagen or plastic. To assess integrin activation, focal adhesion kinase (FAK) protein levels and activation were measured. FAK levels were significantly decreased compared to cells cultured on plastic or collagen I, but activation levels were unchanged.These studies demonstrate that PGs have differential effects on HASMC growth. Whereas decorin reduces ASM proliferation and increases apoptosis, biglycan has no effect. Cell-matrix adhesions were irregular in HASMCs seeded on decorin or biglycan compared to cells on collagen I or plastic. Decreases in decorin in the asthmatic airway wall, as observed in fatal asthma cases, may permit more exuberant ASM hyperplasia, suggesting that decorin's presence could serve a protective role by modulating the increase in ASM mass in asthma. / Les changements de composition de la matrice extracellulaire (MEC) ainsi que l'augmentation de la masse du muscle lisse des voies aériennes sont des caractéristiques du remodelage des voies aériennes qui contribuent à la physiopathologie de l'asthme. Les modifications de la MEC comprennent une augmentation du dépôt de collagène et un changement du niveau des protéoglycanes (PGs). Le dépôt de biglycane, un petit PG riche en leucine, est généralement plus élevé. Les changements d'expression de la décorine, un autre petit PG riche en leucine, sont, par contre, plus variables. L'interaction entre la cellule et la MEC qui l'entoure, déclenche de nombreuses réponses cellulaires, telles que la survie, la prolifération et la différenciation. Étant donné que la décorine et le biglycane peuvent influencer le comportement de différents types de cellules, nous avons émis l'hypothèse que ces molécules auraient aussi un effet sur la fonction des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Nous avons cherché à déterminer les effets de la décorine et du biglycane sur la prolifération, l'apoptose et l'attachement des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Nous avons aussi exploré les mécanismes putatifs qui seraient responsables de ces effets en utilisant le collagène de type I sera comme traitement de référence. La culture des cellules sur une matrice de décorine a provoqué une diminution du nombre cellules musculaires lisses des voies aériennes due à une diminution de la prolifération et à une augmentation de l'apoptose. La culture sur le biglycane a causé initialement une diminution du nombre de cellules, mais cette baise n'a pas été maintenue. Le collagène a provoqué une augmentation significative du nombre de cellules. Ni le biglycane ni le collagène n'ont induit des changements au niveau de la prolifération ou de l'apoptose. Des expériences ultérieures ont démontré que l'ancrage des cellules musculaires lisses des voies aériennes sur des matrices de décorine et de biglycane était anormal, ainsi que la formation d'adhésions focales et l'organisation du cytosquelette, en comparaison avec les cellules ensemencées sur du collagène ou du plastique. De plus, l'augmentation d'expression protéique de la sous-unité alpha2 d'intégrine a également été observée. Pour évaluer l'activation des intégrines, le niveau de protéine, ainsi que l'activation de la kinase des adhésions focales (FAK) ont été mesurés. En présence de décorine, l'expression protéique de FAK était significativement diminuée comparativement aux niveaux produits par les cellules ensemencées sur du plastique ou du collagène bien que le niveau d'activation était inchangé. Ces études démontrent que les PGs ont des effets distincts sur la croissance des cellules musculaires lisses des voies aériennes: la décorine a réduit la prolifération et a augmenté l'apoptose des cellules, tandis que le biglycane n'a pas modifié ces paramètres. Les adhésions cellules-matrice des cellules musculaires lisses des voies aériennes ensemencées sur la décorine ou le biglycane étaient irrégulières par rapport aux cellules sur le collagène de type I ou le plastique. La diminution de la quantité de décorine dans la paroi des voies aériennes observée dans les cas d'asthme fatal pourrait entraîner une hyperplasie plus prononcée des cellules musculaires lisses des voies aériennes. Ceci suggère que la présence de la décorine pourrait jouer un rôle protectif dans l'asthme, en modulant l'augmentation de la masse du muscle lisse des voies aériennes.

Activin and TGFbeta, members of the TGFbeta superfamily, are pluripotent cytokines that are expressed in virtually every cell of the body. These factors play diverse roles in the body such as regulating early development of the embryo, differentiation, extracellular matrix formation, hematopoiesis, angiogenesis and immune functions. TGFbeta superfamily signaling is transduced by heteromeric serine/threonine kinase receptors at the cell surface and the intracellular mediator, the Smad complex. Following activation of the receptors, there is recruitment and phosphorylation the Smads. As a result the Smad proteins accumulate in the nucleus, bind co-activators or repressors and elicit or suppress transcription of target genes. / To date, the molecular signaling mechanisms for activin/TGFbeta in mammary gland growth and differentiation have not been fully elucidated. Our data identify a novel regulatory crosstalk mechanism by which activin/TGFbeta induced Smad signaling acts to antagonize Stat5 transactivation in mammary epithelial cells. We demonstrate an inhibitory effect of activin/TGFbeta on milk protein expression, specifically betacasein. We further show that activin/TGFbeta inhibitory effect upon betacasein expression is not due to changes in either Stat5 phosphorylation, translocation to the nucleus or binding on the Stat5 response element. We finally demonstrate that the Smads are required to block Stat5 transactivation by activin/TGFbeta and show that they are important mediators in activin/TGFbeta inhibitory response upon Stat5 target gene expression, in particular betacasein and cyclin D1. Finally, we unveil the mechanism by which these two signaling cascades antagonize their effects and find that activated Smads inhibit Stat5 association with its co-activator CBP, thus blocking Stat5 transactivation of its target genes. Thus, we define a novel crosstalk mechanism between two divergent signaling pathways that are involved in regulating mammary gland growth and differentiation. / Whereas the role of TGFbeta signaling in breast cancer has been well characterized, we sought out to study the role and mechanism of action of activin in the human breast cancer T47D cells. We found that activin treatment of T47D cells leads to a potent inhibition of cell growth. We further show that activin induces the Smad, the p38-mitogen activated kinase pathways and the p38 downstream target ATF2. Finally, using specific inhibitors to block p38 MAPK, activin-mediated cell growth inhibition is completely abolished. Together, these results define a novel signaling mechanism induced by activin in breast cancer cells. / Finally in an attempt to identify genes regulated by activin in breast cancer cells, we discover the death adaptor molecule RAIDD as a novel target of activin signaling. We show that RAIDD mRNA and protein levels are potently upregulated by activin. Using antisense-oligos directed against RAIDD, we show that RAIDD expression is necessary in mediating activin inhibition in breast cancer cells. Hence, we define the involvement of a new player in activin mediated cell growth inhibition. / Collectively, these studies reveal novel mechanisms of the activin/TGFbeta signaling cascade in normal mammary epithelial cells and breast cancer cells.

The development of the nervous system is highly dependent on the differentiation of various neuronal and glial cell populations, efficient targeting of axons, establishment of neuronal connections and continuous branching/pruning and establishment of new connections. These processes are possible through migration, adhesion and cytoskeletal rearrangement processes that are common in most organogenesis. The extracellular matrix and guidance molecules interact with cell surface receptors that transduce signaling mechanisms intracellularly allowing for these cellular responses to take place.Netrins are bifunctional chemotropic cues that attract or repel different classes of axons by signaling through the netrin receptors Deleted in Colorectal Cancer (DCC) and the UNC5 homologues (UNC5a, b, c and d) during the development of the nervous system. This family of chemotropic molecules is a member of the laminin superfamily. Similar to laminin-integrin signaling, netrin-1's interaction with its receptor DCC results in the activation of the Rho GTPases Rac and Cdc42 and the promotion of a signaling cascade that leads to growth cone cytoskeletal and membrane remodeling. This thesis focused on further identifying the signaling molecules and complexes downstream of DCC that are required for netrin-1 mediated commissural neuron axon chemoattraction.In the first part of this thesis we have used an unbiased mass spectrometry approach to identify signaling molecules complexed to DCC in commissural neurons isolated from E12/13 spinal cord. From the mass spectrometry data obtained we chose to characterize Arp2/3 and 14-3-3. Arp2/3 co-immunoprecipitated with DCC in commissural neuron in a netrin-1-dependent manner. We further established that netrin-1 mediated commissural growth cone expansion and filopodia remodeling is blocked by wiskostatin, a potent chemical inhibitor of N-WASP activity towards the Arp2/3 complex. The treatment of the neurons with wiskostatin also inhibited netrin-dependent externalization of DCC. These results suggest that actin polymerization resulting from N-WASP/Arp2/3 complexes may be required to maintain DCC cell surface recycling during netrin-1 mediated axon guidance. The 14-3-3 epsilon adaptor protein was also identified as a DCC associated protein. However, its association with DCC decreased with the addition of netrin-1. The inhibition of 14-3-3 function using a function-blocking peptide resulted in the collapse of commissural growth cones which could not be recovered by the addition of netrin-1. In the second part of this thesis we identified β-Pix as a potential GEF downstream of DCC involved in the activation and propagation of Rac-1 and Cdc42 signaling. We found that a β-Pix/Git complex associates with DCC in commissural neurons. β-Pix is highly expressed in the developing spinal cord in various neuronal subpopulations. Additionally functional assays using the overexpression of β-Pix mutants showed that β-Pix complexes and association with Pak are important steps in the maintenance of netrin-1 induced changes in GC morphology, in commissural axon extension to the midline, and for cortical neuron branching. Using modified GTPase assays we further demonstrated that β-Pix is required for Cdc42 and Rac-1 activation downstream of netrin-1 and is associated with the GTP-bound GTPases. β-Pix may associate with the GTPases by binding to Pak, or alternatively, may bind directly, as has been demonstrated for the related protein α-Pix, resulting in allosteric activation of the GTPase. These results support a novel model, in which β-Pix/Git complexes play an integral part in the activation of Rac-1 and Cdc42 downstream of DCC.These findings provide novel insight into the signaling events activated by netrin-1 downstream of DCC during commissural axon guidance. They have also identified new questions related to how signal transduction mechanisms activated by netrin-1 regulate the cytoskeleton of the axonal growth cone. / Le développement du système nerveux dépend en grande proportion en la différentiation de différentes populations de cellules neuronales et gliales, du guidage efficace des axones, de l'établissement de connexions neuronales et de ramification et élagage de ces nouvelles connexions. Ces procès sont possibles grâce à la migration, adhésion et réarrangement du cytosquelette, des mécanismes communs à l'organogénèse. Les Netrines sont des signaux chimiotropiques qui attirent ou bien repoussent différentes classes d'axones, par l'intermédiaire du récepteur Deleted in Colorectal Cancer (DCC) et des récepteurs UNC5 (UNC5a, b, c et d) pendant le dévelopement du système nerveux. Cette famille de molécules chimiotropiques partage une haute homologie avec la famille des laminines. De façon analogue à la signalisation laminine-intégrine, l'intéraction de la Netrine avec son récepteur DCC mène à l'activation des Rho-GTPases Rac-1 et Cdc42 et d'une cascade de signalisation qui mène au remodèlement du cytosquelète et de la membrane du cône de croissance. Cette thèse se concentre sur l'identification plus approfondie des molécules et complexes de signalisation en aval du récepteur DCC qui sont requis pour la chimio-attraction des axones des neurones comissuraux médiée par la Netrine. Dans la première partie de cette thèse nous avons utilisé une approche de spectrométrie de masse non biaisée pour identifier des molécules de signalisation complexées au récepteur DCC lié à la Netrine dans des neurones commissuraux isolés de moelle épinière à E12/E13. A partir des données de spectrométrie de masse nous avons choisi de caractériser Arp2/3 et 14-3-3. Arp2/3 a co-immunoprécipité avec DCC de façon dépendante de la Netrine. De plus nous avons démontré que l'expansion du cône de croissance et le remodelage des filopodes commissuraux sont bloqués par la Wiskostatine, un puissant inhibiteur de l'activité de N-WASP envers le complexe Arp2/3. De plus, le traitement aves la wiskostatine a inhibé l'externalisation dépendante de la Netrine du récepteur DCC. Ces résultats suggèrent que la polymérisation de l'actine résultant de complexes N-WASP/Arp2/3 peut être requise pour le maintient du recyclage de DCC à la surface de la cellule pendant le guidage axonal généré par la Netrine. La proteine adaptateur 14-3-3 epsilon a aussi été identifiée comme étant associée à DCC. Néanmoins, son association à DCC décroit suite à l'addition de Netrine. L'inhibition de 14-3-3 par l'utilisation d'un peptide bloqueur a eu comme résultat le collapse des cônes de croissance commissuraux, qui n'ont pas pu être récupérés par l'addition de Netrine. Dans la deuxième partie de cette thèse nous avons identifié ß-Pix comme un potentiel GEF en aval de DCC, impliqué dans l'activation et la propagation de la signalisation par Rac-1 et Cdc42. Nous avons déterminé qu'un complexe ß-Pix/Git s'associe avec DCC dans les neurones commissuraux. De plus, des essais fonctionnels utilisant la surexpression de mutants ß-Pix a montré que les complexes ß-Pix et l'association avec Pak sont des pas importants dans le maintient et la morphologie des cônes de croissance, l'extension des axones commissuraux vers la ligne médiane et la ramification des neurones corticaux éllicités par la Netrine. En utilisant des essais de GTPase modifiés nous avons aussi démontré que ß-Pix est requis pour l'activation de Cdc42 et Rac-1 en aval de la Netrine et qu'il est associé avec les GTPases liées à GTP. ß-Pix peut s'associer aux GTPases par l'intermédiaire de Pak ou, en alternative, peut se lier directement, tel que démontré pour la protéine proche α-Pix, menant à l'activation allostérique de la GTPase. Ces résultats supportent un nouveau modèle où des complexes ß-Pix/Git pourraient jouer un rôle intégral dans l'activation de Rac-1 et Cdc42 en aval de DCC. Ces données apportent de nouvelles avenues dans la signalisation en aval de DCC pendant le guidage des axones commissuraux.

Heart failure is the leading cause of death in both men and women of Western countries. The pathophysiology of heart failure is associated with abnormalities in intracellular calcium control. Calsequestrin (CSQ2), a calcium storage protein in cardiomyocytes, is negatively regulated by the transcription factor Egr-1 thus altering calcium availability for cardiac contraction/relaxation. Here, we tested the hypothesis that the proteins complexed to Egr-1 and/or their post-translational modifications would affect regulation of CSQ2 expression. Egr-1 and Sp1 compete for binding at the CSQ2 promoter, but also bind one another. In fact, together they form a complex with another ubiquitous transcription factor YBX-1. This complex was identified in vivo and in vitro by a series of co-immunoprecipitations. To test the idea that complex formation and CSQ2 expression could be affected by acetylation, histone acetyltransferase (HAT) inhibitors and histone deacetylase (HDAC) inhibitors were used to respectively decrease or increase acetylation within cells. We found that acetylation did not impact the formation of the Egr-1: Sp1: YBX-1 complex thought to regulate CSQ2 expression. However, changes in CSQ2 expression were observed when acetylation was modified by HAT and HDAC inhibitors. We conclude that acetylation modifies CSQ2 expression although not by means of the Egr-1: Sp1: YBX-1 complex even though Egr-1 is known to be acetylated. / La maladie du coeur est la cause principale de mortalité chez les femmes et les hommes en Occident. L'arrêt cardiac est souvent associé à des anomalies en control de calcium intracellulaire. Le facteur de transcription Egr-1 est connu pour son contrôle négatif de l'expression de calsequestrine (CSQ2), une protéine réservoir de calcium. Un manque de CSQ2 impacte les quantités de calcium disponible pour un bon fonctionnement cardiaque. Ici nous avons examiné l'hypothèse que les protéines liées à Egr-1 et que ses modifications post-translationelles. Egr-1 et Sp1 sont en compétition pour le promoteur de CSQ2 mais sont aussi liés l'un à l'autre. En fait, ensemble ils forment un complexe avec le facteur de transcription universel YBX-1. Ce complexe a été identifié en vivo et en vitro par co-immunoprécipitations. Considérant que la formation de ce complexe ainsi que l'expression de CSQ2 peuvent être affectés par l'acétylation, des inhibiteurs d'acétyltransferase d'histone (ATH) et de déacétylase d'histone (DACH) ont été respectivement utilisés pour réduire et augmenter l'acétylation en cellules. Nous avons trouvés que la formation du complexe Egr-1: Sp1: YBX-1 qui est possiblement responsable de l'expression de CSQ2 n'est pas affecté par les changements en acétylation. Par contre, des changements ont été aperçus dans l'expression de CSQ2 quand l'acétylation a été modifiée par ATH ou par DACH. Nous croyons que l'acétylation impacte l'expression de CSQ2 mais pas par entremise du complexe Egr-1 : Sp1 : YBX-1 malgré l'acétylation de la protéine Egr-1 elle-même.

Post-translational modification is one crucial cellular mechanism through which proteins are altered in structure and function. A variety of proteins different in function and cellular localization is affected by such modification. With a wide range of influence within a cell, lysine acetylation has emerged as one major post-translational modification that rivals to phosphorylation. Indeed, recent proteomic studies have revealed that lysine acetylation affects 5-10 % of mammalian and bacterial proteins. This modification is catalyzed by the opposing actions of lysine acetyltransferases and deacetylases. One of the first acetylated proteins identified in the mid-1980s is α-tubulin, a subunit of microtubules that comprise the cytoskeletal network. Although deacetylation of α-tubulin is well known to be catalyzed by HDAC6, the responsible acetyltransferase remained elusive until recently. The recent discovery of Atat1 (α-tubulin acetyltransferase 1) has yielded important insights into the role of acetylated α-tubulin in lower organisms such as C. elegans, but it remains unclear whether this is also the case in vivo in higher organisms such as mammals. Here, using mice devoid of Atat1, I demonstrate that Atat1 is a major acetyltransferase of α-tubulin dispensable for mouse development. I also show that Atat1 is highly expressed in testis, renal pelvis, gastrointestinal tract, and hippocampus, but development of these tissues appears normal in the absence of Atat1. Moreover, in a set of molecular and cellular studies, I have identified ATAT1 as a potential interaction partner of several proteins. Together, these findings provide direct support of Atat1 as an authentic α-tubulin acetyltransferase, thereby setting up a solid foundation for additional studies of this enzyme and tubulin acetylation in mice and humans. / La modification post-traductionnelles des protéines est un mécanisme cellulaire essentiel par laquel la structure et la fonction des protéines peuvent-être affectées. Les modifications sont présentes dans la grande majorité de voie cellulaire et les protéines cibles possèdent une grande diversité de fonction et de localisation cellulaire. L'acétylation des lysines a émergé comme une modification de grande importance, ayant un impact majeur sur les cellules, à l'instar de la phosphorylation. Effet, des études récentes de protéomique ont révélées que de 5 à 10 % des protéines bactériennes et animales étaient affectées par l'acétylation des lysines. Cette mondification est catalysé par l'effet inverse de deux classes de protéines, les lysines acétyltransférase et les déactylases. L'une des premières protéines identifiées dans acétylés milieu des années 1980 est l'α-tubuline, une sous-unité des microtubules qui composent le réseau du cytosquelette. Malgré que l'enzyme responsable de la déacétylation de l'α-tubuline est connue sous le nom HDAC6, l'enzyme responsable de son acétylation est restée inconnue jusqu'à récemment. La découverte d'Atat1 (α-tubuline acétyltransférase1) a donné des informations importantes sur le rôle de l' aétylation sur l'α-tubuline dans les organismses inférieurs comme C. elegans, mais il reste difficile de savoir si c'est aussi le cas in vivo dans les organismes supérieurs commes les mammifères. En utilisant des modèles murin de Atat1, je démontre que Atat1 est une acétyltransférase majeur de l'α-tubuline dispensable pour le développement normal. De plus, je démontre que le niveau d'expression d'Atat1 est particulièrement élevé dans les testicules, le bassinet du rein, le tractus gastro-intestinal, et l'hippocampe, pourtant, le développement de ces tissus semble normal en l'absence de Atat1. En outre, dans une série d'études moléculaires et cellulaires, j'ai identifié ATAT1 comme un partenaire potentiel d'interaction de plusieurs autres protéines. Ces résultats non seulement apporter un soutien supplémentaire de la Atat1 comme une acétyltransférase authentique de l'α-tubuline, mais aussi mettre en place une bonne base pour des études supplémentaires de cette protéine chez les souris et les humains.