Leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by Leishmania protozoa and transmitted by a sand fly vector. There are three main disease manifestations: self-healing but scarring cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis with destruction of the mucosal tissues in the nose, mouth and throat, and visceral leishmaniasis in which parasites disseminate to the bone marrow, liver and spleen, leading to high fever, hepatosplenomegaly, wasting, and death in the absence of treatment. Visceral leishmaniasis is the second most lethal tropical disease after malaria. A key question of leishmaniasis research is why some Leishmania species such as Leishmania major remain at the site of the sand fly bite in cutaneous leishmaniasis while other species such as Leishmania donovani metastasize to visceral organs. The overall goal of this thesis was to identify factors involved in visceral disease pathogenesis. We hypothesized that parasite factors play a determining role in visceral disease and that host characteristics are also involved. First, we examined the function of A2, a protein family already implicated in L. donovani visceralization. A2 is shown to protect against heat shock and oxidative stress, key host defences against visceral leishmaniasis. Second, we studied an atypical L. donovani clinical isolate from Sri Lanka that causes cutaneous rather than visceral leishmaniasis, comparing it to a clinical isolate from a Sri Lankan visceral leishmaniasis patient. Although both strains were equally infective to macrophages in vitro, they caused significantly different disease phenotypes in vivo in mice: only the cutaneous isolate caused footpad swelling while only the visceral isolate led to significant liver and spleen parasitemia. A2 expression was lower in the cutaneous isolate and ectopically expressing an additional A2 gene in the cutaneous isolate partially restored virulence in the visceral organs. Therefore, parasite factors are a key determinant of visceral disease. However, host characteristics and history can also influence the development of visceral leishmaniasis. In Sri Lanka, cutaneous leishmaniasis caused by L. donovani is frequent while visceral disease is rare. We show here that immunization with a cutaneous clinical isolate is associated with a mixed Th1/Th2 response and protects BALB/c mice from visceral leishmaniasis, providing a possible rationale for the low incidence of visceral leishmaniasis in Sri Lanka. Overall, these results represent significant progress into the determinants of visceral leishmaniasis and in particular on the role of the virulence factor A2. A novel candidate for a live-attenuated vaccine against visceral leishmaniasis is also presented here. Given the lack of a human vaccine for leishmaniasis and the limitations of the current treatment options, this work could have a significant impact on disease management in Sri Lanka and on vaccine development. / Les leishmanioses sont un groupe de maladies tropicales causées par le protozoaire Leishmania et transmises par la piqûre de phlébotomes. Les leishmanioses peuvent être divisées en trois formes cliniques: leishmaniose cutanée qui guérit sans traitement mais laisse des cicatrices, leishmaniose mucocutanée avec destruction des muqueuses du nez, de la bouche et de la gorge, et leishmaniose viscérale où les parasites quittent le site de la piqûre et se propagent jusqu'à la moelle osseuse, le foie et la rate. Les symptômes de la leishmaniose viscérale sont une forte fièvre et une hepatosplénomégalie, et ceci peut être fatal en l'absence de traitement. La leishmaniose viscérale a le deuxième plus haut taux de mortalité parmi les maladies tropicales, après la malaria. Un des enjeux majeurs de la recherche sur les leishmanioses est de comprendre pourquoi certaines espèces de Leishmania comme Leishmania major restent au site de la piqûre des phlébotomes dans le cas des leishmanioses cutanées, tandis que Leishmania donovani se propage jusqu'aux organes viscéraux. Le but de cette thèse est d'identifier les facteurs impliqués dans la pathogénèse de la leishmaniose viscérale. L'hypothèse de recherche est que les caractéristiques du parasite jouent un rôle principal dans la leishmaniose viscérale et que les caractéristiques de l'hôte sont également importantes. Nous examinons la fonction de A2, une famille de protéines qui sont impliquées dans la viscéralisation de L. donovani. Nous montrons que A2 protège contre le choc thermique et contre les oxydants, deux défenses clé du système immunitaire contre la leishmaniose viscérale. Ensuite, nous étudions un isolat clinique atypique de L. donovani venu du Sri Lanka qui cause des leishmanioses cutanées au lieu de provoquer des leishmanioses viscérales. Nous comparons cet isolat à un isolat clinique provenant d'un patient sri lankais souffrant de leishmaniose viscérale. Quoique ces deux isolats soient tout aussi infectieux l'un que l'autre in vitro, ils causent des symptômes différents in vivo: seul l'isolat cutané cause l'enflure du coussinet plantaire après injection sous-cutanée chez les souris et seul l'isolat viscéral peut se multiplier dans le foie et la rate. Les niveaux de A2 sont plus bas dans l'isolat cutané et nous démontrons que cela constitue un facteur déterminant de son atténuation. Ces résultats prouvent donc que les caractéristiques du parasite ont une influence majeure dans la pathogénèse des leishmanioses viscérales. Cependant, les caractéristiques de l'hôte et son historique médical peuvent également influencer le développement de cette maladie. Les leishmanioses cutanées sont beaucoup plus fréquentes au Sri Lanka que les leishmanioses viscérales. Nous prouvons ici que la vaccination avec l'isolat cutané mène à une réponse du système immunitaire de type Th1/Th2 mixte et protège contre la leishmaniose viscérale dans un modèle in vivo d'infection de souris BALB/c. Ces résultats proposent un modèle pour expliquer la rareté de la leishmaniose viscérale au Sri Lanka. En conclusion, ces résultats éclaircissent plusieurs facteurs impliqués dans le développement de la leishmaniose viscérale et en particulier le rôle du facteur de virulence A2. Nous présentons également un nouveau candidat de vaccin atténué contre la leishmaniose viscérale. Etant donné l'absence de vaccin humain pour cette maladie et les limites des traitements actuels, cette étude pourrait avoir un impact majeur sur la santé publique au Sri Lanka et sur le développement de vaccins contre la leishmaniose viscérale.

The obligate intracellular pathogen Toxoplasma gondii is one of the most successful pathogens in the world, with an average worldwide infection rate of ~30 % in humans. The ability of the T. gondii to establish persistent infections in immunocompetent hosts is likely due to its immune evasion strategies that include interference with T cell activation, blocking of pro-inflammatory cytokine signaling while stimulating anti-inflammatory signaling and preventing the expression of major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules by immune cells. This blocking the production of MHC-II by professional antigen presenting cells dampens the CD4+ T cell response and delays the onset of cellular immunity, thereby allowing T. gondii to establish a lifelong chronic infection. Infection of professional antigen presenting cells with live parasites and exposure to parasite lysate both result in a blockage of IFN-gamma dependant MHC-II production and surface expression. However, the mechanisms of inhibition by live parasites differ from those observed with parasite lysates suggesting multiple and non-redundant mechanisms of MHC-II expression inhibition during a T. gondii infection. The active molecules from parasite lysates likely represent proteins secreted by the parasite that act on host cells even prior to their infection. The parasite molecule(s) responsible for this important immune evasion mechanism remain(s) unknown. In our studies, we used sub-cellular fractionation and chromatographic techniques to isolate and enrich for the protein(s) responsible for interfering with IFN-gamma dependant MHC-II production. Preliminary experiments demonstrated that the active component was a soluble protein. Sub-cellular fractionation experiments indicated that inhibition levels corresponded to the amount of dense granules, a specialized T. gondii secretory organelle, present in the fractions. We also demonstrated that extracellular parasites actively secrete proteins and that these excretory-secretory antigens (ESA) contain MHC-II expression inhibiting molecule(s). Size-exclusion chromatography of soluble parasite lysate and ESA indicated MHC-II expression inhibiting molecules were present in fractions representing a large size range of proteins. Most of these molecules were however confined to the fractions containing the largest proteins and/or protein complexes. To isolate the active molecules, a two-step fractionation process was devised. ESA proteins were first subjected to anion-exchange chromatography and the fraction presenting the greatest abundance of MHC-II expression inhibition was then further separated by size-exclusion chromatography for isolation and enrichment of active molecule(s). The latter separated the active molecule(s) into two fractions. LC-MS/MS analysis of these fractions identified 24 candidate Toxoplasma gondii proteins responsible for the inhibition of MHC-II expression in bone marrow derived macrophages. / Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii est l'un des pathogènes les plus prolifiques, avec une incidence mondiale d'environ 30 % chez les humains. La capacité de T. gondii d'établir une infection persistante dans un hôte immunocompétent est accomplie grâce à son éventail de stratégies qui lui permet d'échapper au système immunitaire de l'hôte, incluant l'interférence de l'activation des cellules T, la dérégulation du signalement des cytokines pro-inflammatoires, la promotion du signalement des cytokines anti-inflammatoires et l'inhibition de l'expression des molécules complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) par les cellules immunitaires. En bloquant l'expression de CMH-II par les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles, la réponse des cellules T CD4+ est réduite et le déclanchement de l'immunité cellulaire est retardé, permettant à T. gondii d'établir une infection chronique qui persiste pour le reste de la vie de l'hôte. Une infection par des parasites vivants ou l'exposition à des lysats de parasites bloquent tous deux la synthèse de molécules de CMH-II induite par l'IFN-gamma et leur expression à la surface cellulaire par les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles. Cependant, les mécanismes d'inhibition par des parasites vivants diffèrent de ceux observés avec les lysats de parasites, ce qui suggère qu'une multitude de mécanismes non-redondants soient sollicités pour inhiber l'expression de CMH-II lors d'une infection par T. gondii. Les molécules actives présentes dans les lysats de parasites sont probablement des protéines normalement sécrétées par le parasite qui agissent sur les cellules hôtes précédant l'invasion. Les molécules du parasite responsables de ce mécanisme important d'évasion du système immunitaire restent inconnues à ce jour. Pour nos recherches, nous utilisâmes un fractionnement subcellulaire et des techniques de chromatographie pour isoler et enrichir les protéines responsables de l'activité inhibitrice sur l'expression de CMH-II. Des résultats préliminaires démontrèrent que la composante active provient de protéines solubles. De plus, des fractionnements subcellulaires révélèrent que l'activité inhibitrice se retrouvait dans les fractions enrichies d'organelles sécrétoires, nommément les rhoptries (ROP) et les granules denses (GRA). Nous démontrâmes aussi que les parasites extracellulaires sécrètent activement des protéines et que ces antigènes excrétés-sécrétés (ESA) contiennent des molécules qui inhibent l'expression de CMH-II. Une séparation par chromatographie d'exclusion stérique de la fraction soluble des lysats de parasites et des ESA révéla que les molécules inhibitrices de CMH-II se retrouvaient dans des fractions de protéines de tailles variées. Toutefois, la plupart des ces molécules étaient confinées aux fractions contenant des protéines de larges tailles et/ou des complexes protéiques. Pour isoler davantage les molécules inhibitrices, un fractionnement à deux étapes fut élaboré. Les protéines provenant d'ESA furent séparées par chromatographie d'échange d'anions et la fraction obtenue qui affichait la plus grande activité inhibitrice fut séparée davantage par chromatographie d'exclusion stérique pour isoler et enrichir les molécules d'intérêt. Nous obtînmes deux fractions suivant cette méthodologie et les analysâmes par LC-MS/MS, ce qui généra une liste de 24 protéines de Toxoplasma gondii potentiellement responsables de l'inhibition de l'expression de CMH-II par des macrophages dérivés de la moelle osseuse.

Cryptosporidium parvum and Trypanosoma brucei are two protozoan parasites that can cause life-threatening illnesses in humans. Over 70 million people on the African continent are at risk of contracting T.brucei. In the case of C.parvum, infections are cosmopolitan, and a major problem is that it can be acquired very easily and requires only an infectious dose of 10 oocysts to cause the illness. If released in the public water supplies, C.parvum can endanger entire cities. This is one reason why C.parvum is categorized as a Class B bioterrorist weapon. Despite the threat C.parvum poses and the severe illness T.brucei causes, current treatments against these parasites are insufficient. These treatments fail to consistently eliminate the parasites and cause many adverse side effects. Furthermore, no significant improvements to the efficacy of these currently available treatments have been made. Given the need to find new drugs against these parasites and improve treatments, we tested the anti-parasitic activity of two compounds against T.brucei and C.parvum, respectively. First, we looked at the in vivo activity of TH-III-149, a cyclopropyl-indol, against T. brucei and then the in vitro and in vivo activity of oleyl-PC, a phosphocholine analog, against C. parvum. To begin, we looked at the effects of TH-III-149 against T.brucei by using a CD1 mouse model of infection. We demonstrated that an 8mg/kg treatment of TH-III-149 for three days resulted in a significant decrease in parasite replication rates compared to non-treated mice. By real-time PCR quantification of blood parasitemia, we showed that non-treated, T.brucei-infected mice had a thousand-fold increase in parasite burden between day 2 and 4 of infection. In comparison, only a 7.5-fold increase in parasite burden was observed in mice treated with TH-III-149. Results from blood smears and microscopy also confirmed this reduction in the replication rate of parasites. The treatment of infected mice with TH-III-149 delayed the patent period (appearance of parasites in the blood smear) by two days when compared to non-treated mice. In non-treated mice, parasite in the blood smears appeared at day 4 of the infection, while TH-III-149-treated mice only exhibited parasites in the blood smears at day 6. In addition, this compound showed minimal signs of toxicity, as non-infected mice treated with 8mg/kg of TH-III-149 for three days did not exhibit weight loss, hepatomegaly or splenomegaly. Therefore, our results support the development of TH-III-149 as a new treatment against T.brucei. In parallel, we also tested oleyl-PC against C.parvum. We showed that in vitro oleyl-PC has an IC50 of 22.9nM against C.parvum. Toxicity was evaluated using human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8 cells) and was not significant at concentrations below 100µM (TC50=153.7 µM). The ratio between the TC50 and the IC50 allowed us to calculate a therapeutic index of 6.7x103. The in vivo animal study confirmed the activity of oleyl-PC previously seen in vitro. Treating C57BL/6 IFNγR-KO mice with 40mg/kg of oleyl-PC for ten days resulted in the cure (clearance of blood parasitemia) in 75% of the mice and a percent survival of 100% after 30 days (P < 0.001). In contrast, all of the non-treated mice succumbed to C. parvum infection and died by day 11. Using real-time PCR, oleyl-PC-treated mice showed no detectable levels of parasitic DNA in their intestines 30 days post infection, which indicates that these mice successfully cleared their parasitic infections. These results were confirmed by histological analysis of sections of the ileum which were clear of C.parvum oocysts. Furthermore, after ten days of treatment with 40mg/kg of oleyl-PC, no signs of toxicity were seen in treated mice; non-infected oleyl-PC-treated mice were monitored for visible behavioral changes and weight loss. Therefore, our results support the development of oleyl-PC as a new safe and effective treatment against C.parvum. / Cryptosporidium parvum et Trypanosoma brucei sont deux parasites protozoaires qui peuvent causer des maladies mortelles chez les humains. Confinées au continent africain, les infections dues à T.brucei affectent plus de 70 millions d'habitants. Dans le cas de C.parvum, les infections qui sont cosmopolites causent un problème majeur puisque la dose infectieuse n'est que de 10 oocysts. De plus, ce parasite peut être obtenu facilement et peut mettre en danger plusieurs villes, s'il est relâché dans les eaux potables. C'est un des raisons pourquoi ce parasite a été catégorisé comme une arme bio-terroriste de classe B. Malgré les risques majeurs associés à C.parvum et la maladie sévère de T.brucei, aucun progrès n'a été fait pour améliorer les traitements actuels. Ceux-ci n'ont toujours pas réussi à démontrer leur efficacité en plus de causer des effets secondaires sérieux. Vu le besoin urgent de trouver de meilleurs traitements, nous avons testé l'activité de TH-III-149, un indole-cyclopropane, contre T.brucei dans une étude in vivo ainsi que le oleyl-PC, un analogue de la phosphocholine, contre C.parvum dans des études in vitro et in vivo. Pour commencer, nous avons observé les effets du TH-III-149 contre T.brucei dans un modèle de souris CD1. Les résultats in vivo ont démontré qu'un traitement de trois jours en utilisant 8 mg/kg cause une réduction significative dans le taux de réplication du parasite en comparaison aux souris non-traitées. En utilisant le PCR en temps réel comme méthode de quantification, nous avons démontré que la charge en parasite dans le sang des souris non-traitées a augmenté de mille fois entre les jours 2 et 4, tandis qu'elle n'a augmenté que de 7.5 fois dans les souris qui ont été traitées. Les résultats des frottis sanguins ont confirmé cette réduction dans le taux de réplication des parasites. En effet, l'apparition de parasites dans les frottis sanguins a été observée dès le jour 4 de l'infection dans les souris non-traitées, tandis qu'elle n'a pu être observée qu'à partir du jour 6 dans les souris traitées avec le TH-III-149. De plus, ce composé n'a pas révélé de signes de toxicité car les groupes de souris non-infectées traitées pendant trois jours avec 8 mg/kg n'ont pas démontré de splénomégalie, d'hépatomégalie ni de perte de poids. Donc, nos résultats supportent le développement de TH-III-149 en tant que nouveau traitement contre les infections de T.brucei. En parallèle, nous avons aussi testé l'oleyl-PC contre C.parvum. Nos résultats in vitro démontrent que la concentration nécessaire pour réduire de 50% le taux de réplication du parasite (IC50) est de 25nM. La toxicité a été évaluée en utilisant une culture entérique humaine en couche monocellulaire (HCT-8). Les résultats de celle-ci démontrent que les premiers signes de toxicité apparaissent à partir de 100µM (TC50=123µM). Le ratio entre le TC50 et le IC50 a permis de calculer un index thérapeutique de 5x103. Les résultats in vivo ont servis à confirmer l'activité in vitro de oleyl-PC. En effet, le traitement de dix jours des souris C57BL/6 IFNγR-KO avec 40mg/kg de oleyl-PC a réussi à guérir (absence de parasitémie sanguine) 75% des souris, tout en gardant un taux de survie de 100% après le jour 30 (P<0.001). En contraste, toutes les souris non-traitées ont succombées à l'infection à la fin du jour 11. En utilisant le PCR en temps réel, aucune trace d'ADN provenant de C.parvum n'a pu être détectée dans les intestins de ces souris 30 jours après l'infection. Ces résultats ont été confirmés par l'analyse des lamelles histologique de l'ilium de ces souris où l'absence d'oocyst de C.parvum a été observée. De plus, chez les souris non-infectées, un traitement de dix jours avec 40 mg/kg de oleyl-PC n'a pas causé d'effets secondaires visibles tels qu'une perte de poids. Donc, nos résultats supportent le développement de l'oleyl-PC en tant que nouveau traitement sécuritaire et efficace contre les infections de C.parvum.

Soil transmitted helminths (STHs) are gastrointestinal nematodes of humans. Periodic deworming with albendazole (ABZ) and mebendazole (MBZ) is applied to control STHs. However, repeated treatment can cause selection of mutations in the β-tubulin gene at codons 167, 198 and 200 leading to resistance. To maintain an effective control strategy it is crucial to identify resistance, if any, at an early stage. Method: We have developed accurate molecular assays for STHs to detect β-tubulin genetic changes at codons 200, 167 and 198 associated with resistance. We also optimized the in vitro egg hatch assay (EHA) for canine hookworms and have applied it to human hookworms for assessing the response to BZs. Both assays have been tested on samples collected in endemic countries. Furthermore we carried out a 14-month longitudinal study in Haiti to investigate the response of STHs to two rounds of ABZ treatment in endemic communities naive for ABZ. Results: We validated genetic markers with control plasmids in hookworms, A. lumbricoides and T. trichiura for codons 167,198 and 200. We also identified at low frequency, before and after treatment, the resistance-associated SNP at codon position 200 in hookworms from Kenya, while the egg reduction rate (ERR) values indicated good drug efficacy. In A. lumbricoides, a SNP at position 167 was identified at high frequency before and after one drug treatment of subjects in Haiti, Kenya and Panama while ABZ efficacy remained high. In T. trichiura, the SNP at codon position 200 was detected and there was a significant increase in the homozygous resistance-type in Haiti and Kenya after one round of ABZ treatment. The associated drug efficacies, based on faecal egg counts (FEC), were low in Kenya and moderate in Haiti. From this result in Haiti, we classified subjects infected with T. trichiura into good, intermediate or poor ABZ responders. The frequency of SNPs 198 and 200 increased significantly after one round of ABZ treatment in the intermediate and poor response groups. Conclusion: This study has shown for the first time evidence of an association between genetic changes in the β-tubulin gene of T. trichiura and poor ABZ efficacy against this parasite. / Contexte: Les géohelminthes sont des nématodes parasitant le système gastrointestinal de l'Homme. Pour lutter contre les géohelminthiases une des stratégies consiste à déparasiter périodiquement avec l'albendazole (ABZ) et le mébendazole (MBZ). Cependant, l'utilisation répétitive de BZ peut causer une sélection au niveau du gène de la β-tubuline aux codons 167, 198 et 200 et entraîner une résistance. Pour maintenir une stratégie de contrôle efficace, il est indispensable de détecter rapidement la résistance, si présente. Méthode : Dans ce contexte, nous avons développé pour les géohelminthes des tests moléculaires précis pour détecter les changements génétiques de la β-tubuline aux codons 167, 198 et 200, associés à la résistance. Nous avons aussi optimisé un test in vitro, le EHA, chez les ankylostomes infestant la race canine. Les deux tests (moléculaire et in vitro), ont été expérimentés sur des échantillons collectés dans des pays endémiques aux géohelminthes. De plus, nous avons mené, une étude longitudinale de 14 mois en Haiti afin d'investiguer la réponse des géohelminthes à deux traitements d'ABZ. Résultat: Dans cette étude, des marqueurs génétiques des codons 200 chez les ankylostomes, puis 167 et 198 chez les ankylostomes, A. lumbricoides et T. trichiura ont été validés par des plasmides de contrôles. Nous avons aussi identifié à faible fréquence avant et après traitement, le SNP 200 chez des ankylostomes collectés au Kenya. Cependant, l'efficacité de l'ABZ était élevée. Chez A. lumbricoides, le SNP 167 a été identifié à forte fréquence avant et après traitement en Haiti, au Kenya et au Panama alors que l'efficacité de l'ABZ était élevée. Chez T. trichiura, le SNP 200 a été détecté et il y a eu une augmentation significative de l'homozygote de type résistant chez les parasites collectés au Kenya et en Haiti. L'efficacité de l'ABZ estimée par le nombre d'œufs compté, était faible au Kenya et modérée en Haiti. A partir de ces résultats, en Haiti, nous avons classés les individus infestés par T. trichiura en trois groupes de réponse à l'ABZ : "bonne", "intermédiaire" et "faible" réponse au traitement. Après un traitement, les fréquences des SNPs 198 et 200 ont augmenté significativement dans les groupes de réponse intermédiaire et faible. Conclusion : Cette étude a montré pour la première fois, la preuve de l'existence d'une association entre les changements génétiques au niveau de la β-tubuline et la faible efficacité de l'ABZ chez T. trichiura.

The objective of this study was to explore Macrostomum lignano, a free-living organism, as a model organism for parasitic trematodes, such as Fasciola and Schistosoma, in order to better understand the role of their cysteine proteases (cathepsins). Using a bioinformatics approach, two novel cysteine proteases genes (mlcl1 and mlcb2) were identified and phylogenetically characterized. These genes were synthesized, cloned into the yeast secretory system Pichia pastoris (Invitrogen), and functionally-active recombinant proteins were expressed and purified. These recombinant peptidases were then characterized biochemically in terms of activity and stability in various conditions including temperature, salinity and pH. Antibodies specific for the recombinant proteins were generated through a peptide or whole-protein immunization, and tested against both the recombinant proteins and the worm extract proving that the proteins exist in the worm. These studies lay the foundation for further investigations on the biological function of the cysteine peptidases using RNAi and confocal microscopy. In conclusion, M. lignano is a tractable model organism for its parasitic counterparts. / L'objectif de cette recherche était d'explorer l'organisme, vivant en liberté dans la nature, Macrostomum lignano en tant qu'organisme modèle pour ses cousins parasites, Fasciola et Schistosoma, et de mieux comprendre le rôle de leurs protéases cystéines (cathepsins). En utilisant une approche bioinformatique, deux nouveaux gènes de protéases cystéines (mlcl1 et mlcb2) ont été découverts et caractérisés phylogénétiquement. Ces gènes ont été synthétisés, clonés dans un système de sécrétion employant la levure Pichia pastoris (Invitrogen) et exprimés en tant que protéases recombinantes et actives. Ces protéases recombinantes ont alors été caractérisées biochimiquement en termes d'activité et de stabilité dans diverses conditions telles que la température, la salinité et le pH. Des anticorps spécifiques aux protéines recombinantes ont été générés en immunisant des mammifères avec des séquences de peptides ou la protéine recombinante entière, et ont été testés avec l'extrait du vers prouvant ainsi que les protéines sont bel et bien exprimées. Ces études jettent la base pour l'investigation sur la fonction biologique des protéases cystéines par l'emploi du RNAi et de la microscopie confocale. En conclusion, M. lignano est un organisme modèle tractable pour ses cousins parasites.

The genome of the human bloodfluke Schistosoma mansoni encodes 18 putative biogenic amine-like G-protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are potential targets for the development of antischistosomal drugs. One of these sequences, SmGPR-1 (formerly SmGPCR), was previously cloned and was identified as a histamine receptor. In this study, we expanded the functional analysis of SmGPR-1 by studying its expression and tissue distribution both at the RNA and protein levels in different developmental stages of the parasite. In the second part of the study, we cloned and characterized two structurally related receptors, named SmGPR-2 and SmGPR-3. Bioinformatics analyses showed that the three receptors are members of a new clade of biogenic amine GPCRs and are characterized in part by the absence of a highly conserved aspartate (Asp3.32) of the third transmembrane domain. Like SmGPR-1, our first cloned receptor, SmGPR-2, was activated by histamine and its developmental expression at the mRNA level was similar to that of SmGPR-1, both receptors being upregulated in young schistosomula. However, their tissue localization was different. SmGPR-1 was enriched in the tegument, subtegumental musculature and the suckers, whereas SmGPR-2 was associated with neurons of the subtegumental plexuses. The distribution of these receptors correlated with that of histaminergic neurons, which were also detected in the subtegumental neuronal plexuses, the innervation of the suckers, elements of the central nervous system and transverse commissures. These studies suggest that histamine is an important neurotransmitter system in schistosomes. The third receptor investigated in this study, SmGPR-3, was not responsive to histamine but rather was found to have broad specificity for catecholamines, particularly dopamine and related metabolites. In vitro assays of cultured schistosomula revealed that many of the ligands that interact with SmGPR-3 also have strong effects on larval motilit / Au génome de Schistosoma mansoni, un parasite sanguin de l'homme, on retrouve 18 récepteurs putatifs à amine biogène couplés aux protéines G (RCPG). Ces récepteurs ont un potentiel thérapeutique contre les infections aux schistosomes. La séquence SmGPR-1 (anciennement SmGPCR) a déjà été clonée et identifiée comme un récepteur à l'histamine. Une analyse fonctionnelle plus poussée de SmGPR-1 est l'objet de cette thèse. L'analyse de taux d'ARNm et de protéines à différents stades de développement du parasite a servi à l'étude de l'expression et la répartition tissulaire de SmGPR-1. Deux récepteurs similaires, de par leur structure, le SmGPR-2 et le SmGPR-3 ont été identifiés, clonés et caractérisés lors de cette étude. Suite à des analyses bioinformatiques, ces trois récepteurs ont révélé leur appartenance à une nouvelle variante de récepteurs à amine biogène couplés aux protéines G caractérisés par l'absence d'aspartate conservé (Asp3.32) dans le troisième domaine transmembranaire. Tout comme SmGPR-1, le récepteur SmGPR-2 est activé par l'histamine, et l'expression de l'ARNm est similaire à celle de SmGPR-1, les deux récepteurs étant régulés à la hausse chez les jeunes schistosomes. Toutefois, ils sont localisés à différents endroits, SmGPR-1 se retrouve dans le tégument, la musculature subtégumentaire et les ventouses, tandis que SmGPR-2 est associé aux plexus nerveux subtégumentaires. La localisation de ces récepteurs est similaire à celle des neurones histaminergiques que l'on retrouve dans les plexus nerveux subtégumentaires, l'innervation des ventouses, dans certains éléments du système nerveux central et les commissures transversales. Il semblerait que l'histamine soit un important système neurotransmetteur du schistosome. Le troisième récepteur identifié, SmGPR-3, n'est pas activé par l'histamine, mais semble démontrer une spécificité étendue aux catécholamines et tout particuli

Trypanosoma brucei is a parasite that causes the vector-borne disease African sleeping sickness. The mitochondrial mRNAs of T. brucei undergo post-transcriptional RNA editing to make mature, functional mRNAs. The final step of this process is catalyzed by the essential ligase, Kinetoplastid RNA Editing Ligase 1(KREL1) and closely related KREL2. This study is an in vitro characterization of interaction of KREL1 and KREL2 with binding partners KREPA2 and KREPA1, respectively, using full-length, truncated and point-mutated ligases. We have shown a strong, specific stimulatory effect of the interacting partners on catalytic activity of the ligases. We have narrowed the region of contact to fifty-nine C-terminal residues for KREL1 and forty-five for KREL2. Finally we have identified the N-terminal residues F206, T264 and Y275 and C-terminal K405 on KREL1 as critical for catalytic activity as well as interaction with KREPA2. K424 and the KWKE (441-444) stretch possibly co-ordinate KREPA2 interaction during adenylylation. / Trypanosoma brucei est un parasite responsable en Afrique de la maladie du sommeil, une maladie à transmission vectorielle. Les ARNm mitochondriaux de T. Brucei subissent l'édition de l'ARN au niveau post-transcriptionnel pour produire des ARNm matures et fonctionnels. L'étape finale de ce processus est catalysée par la ligase essentielle KREL1 (Kinetoplastid RNA Editing Ligase 1) et celle étroitement liée, KREL2. Cette étude est une caractérisation in vitro de l'interaction de KREL1 et de KREL2 avec les partenaires de liaison KREPA2 et KREPA1 respectivement, en utilisant les séquences complètes, tronquées et mutées des ligases. Nous avons montré un effet stimulateur spécifique prononcé des partenaires interagissant, sur l'activité catalytique des ligases. Nous avons rétréci la région de contact à cinquante neuf acides aminés à l'extrémité C-terminale pour KREL1 et quarante cinq pour KREL2. Finalement, nous avons identifié les acides aminés F206, T264 et Y275 à l'extrémité N-terminale et K405 à l'extrémité C-terminale de KREL1 comme crucial pour l'activité catalytique aussi bien que pour l'interaction avec KREPA2. Les acides aminés K424 et KWKE (441-444) s'étendent éventuellement pour coordonner l'interaction de KREPA2 au cours de l'adénylation.

Ligand-gated chloride channels (LGCCs) are key components that form the inhibitory neurotransmission system in animals. Nematodes possess LGCCs that are gated by unique ligands such glutamate, serotonin and acetylcholine. Higher living forms such as mammals are not known to possess similar receptors. Hence nematodes can be deemed to comprise a phylum with a divergent inhibitory neurotransmission system. Based on this premise, the current project aimed to better understand the inhibitory nervous system of the parasitic nematode, Haemonchus contortus through the characterization of novel LGCC subunits and the localization of relevant ligands believed to function as inhibitory neurotransmitters. The first novel LGCC subunit gene to be isolated was named Hco-GGR-3 (previously named as HcGGR3). Electrophysiological analyses of this subunit in Xenopus laevis oocytes revealed the homomeric assembly of the channel which was predominately gated by dopamine (DA). Immuno-staining of H. contortus adult worms using antibodies raised against a peptide exclusive to Hco-GGR-3 showed that this subunit localized to deirid (cervical papilla) socket and sheath cells. Gender specific differences in localization of this subunit were also observed. In addition, a single nucleotide polymorphism located in the 3' untranslated region (UTR) of Hco-ggr-3 was found to be associated with the selection for resistance towards macrocyclic lactones (MLs) – moxidectin (MOF) and ivermectin (IVM) in H. contortus. A second amine-gated chloride channel gene called Hco-lgc-55 was also isolated. Electrophysiology of this subunit revealed that this channel was gated mainly by tyramine (TA) [EC50 5.8 ± 1.0 μM (n=5)] and a lesser extent by dopamine (DA) and octopamine (OA). Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (SqRT-PCR) showed the presence of mRNA for Hco-lgc-55 in all the life-cycle stages of the parasite. A detailed examination of the localization and characterization o / Les canaux chlorures ligand-dépendants (CCLDs) sont la composante clef du système d'inhibition de la neurotransmission chez les animaux. Les nématodes possèdent des CCLDs qui sont activés par des ligands uniques tels que le glutamate, la sérotonine et l'acétylcholine. Les mammifères ne possèdent pas ce type de récepteurs. Il est possible d'émettre l'hypothèse que le phylum des nématodes a un système d'inhibition de la neurotransmission divergent. Basé sur cette caractéristique, le projet a pour objectif de mieux comprendre le système nerveux inhibiteur chez le nématode parasite, Haemonchus contortus, en caractérisant de nouvelles sous-unités de CCLD, et en localisant des ligands valables, connus pour fonctionner comme neurotransmetteur inhibiteur. La première nouvelle sous-unité du gène de CCLD à avoir été isolée, a été appelé Hco-GGR-3 (précédemment nommé HcGGR3). Les analyses électrophysiologiques de cette sous-unité, réalisées dans les ovocytes de Xenopus laevis, ont permis d'identifier un assemblage homomérique de ce canal qui est majoritairement dépendant de la dopamine (DA). L'immunocoloration de vers adultes d'H. contortus, faite à partir d'anticorps spécifiques à un peptide exclusif à Hco-GGR3, a permis de montrer que cette sous-unité était localisée au niveau des ports des deirids (papille cervicale) et des cellules de gaines. Il a été aussi observé qu'il y avait une différence de localisation de cette sous-unité en fonction du genre des vers. De plus, un polymorphisme mononucléotidique au niveau de la région 3' non transduite (UTR) de Hco-ggr3 s'est avéré être associé à une sélection pour la résistance aux lactones macrocycliques (LM) - la moxidectine (MOF) et l'ivermectine (IVM) - chez H. contortus. Un second gène d'un canal chlorure dépendant d'un acide aminé appelé Hco-lgc-55 a aussi été isolé. L'électrophysiologie de cette sous-unité a permis de montrer que ce canal était maj

Fasciolosis is an economically important veterinary parasitic disease. Of the two causative agents, Fasciola hepatica and Fasciola gigantica, F. hepatica has a greater ability to effectively establish a primary infection and resist the host defences. Certain host species, such as cattle, are more resistant to reinfection than others, such as sheep. In order to gain a greater understanding of the host response to infection, proteomic analyses of sera from sheep and cattle infected with F. hepatica were undertaken. Twenty-six indicators of infection were validated by SELDI-TOF mass spectrometry (MS) in sheep with a single-dose F. hepatica infection. Two of these markers were identified and their increase in the chronic stage of infection was validated using Western blot analysis. SELDI-TOF MS profiling of sera from trickle-infected cattle did not provide descriptive information, but tandem MS analysis of immunodepleted sera provided a more descriptive view of the host-parasite interaction. This technique was sufficiently sensitive to detect markers of inflammation during the acute stage of infection and markers of liver fibrosis during the chronic stage of infection, but was not sufficiently sensitive to detect parasite proteins. Finally, the excretory-secretory products (ESP) of F. hepatica and F. gigantica were profiled. The similarities between the two species were greater than the similarities between newly excysted juveniles (NEJ) and adults. The most notable differences between NEJ and adults were the profile of proteases released and the specific isotypes released by the parasites. NEJ expressed relatively equal amounts of cathepsin L, B, and legumain, whereas adults expressed predominantly cathepsin L. NEJ- and adult-specific cathepsin L clades were identified as well as a potential F. gigantica NEJ-specific cathepsin L clade. Antioxidant defence enzyme levels were higher in adult ESP than NEJ ESP, with higher relative abundance in F. gigantica than F. hepatica. The analysis suggests that stage-specific expression and isotype diversity should be considered when developing a vaccine targeted to the early stage of infection and when studying broad-spectrum chemotherapeutic targets. These studies contribute to the understanding of the basic biology of the causative agents of fasciolosis and the use of proteomics in studying host-parasite interactions. / La fasciolase est une infection vétérinaire importante. Entre les deux agents causals, Fasciola hepatica et Fasciola gigantica, f. hepatica a une meilleure capacité pour établir une infection primaire et pour résister aux défenses de l'hôte. Certaines espèces hôtes, tels que les bovins, résistent une seconde infection mieux que d'autres espèces, tels que les moutons. Afin de mieux comprendre la réaction de l'hôte pendant l'infection, des analyses protéomiques de sérums de moutons et de bovins affectés par f. hepatica ont été entreprises. Vint-six marqueurs d'infection ont été validés par spectrométrie de masse de temps de vol à désorption-ionisation laser potentialisée par surface (SM TDV-DILPS) chez les moutons avec une seule dose infectieuse de f. hepatica. Deux de ces marqueurs ont été identifiés et leur hausse dans la phase chronique de l'infection a été validée par buvardage de western. Le profil SM TDV-DILPS de bovins infectés à plusieurs reprises n'a pas fourni des détails descriptifs, mais une analyse SM en tandem de sérums immunodéplétés a fourni un portrait descriptif de l'interaction hôte-parasite. Cette technique était suffisamment sensible pour détecter des marqueurs d'inflammation pendant la phase aigüe de l'infection et des marqueurs de la fibrose hépatique pendant la phase chronique de l'infection, mais n'était pas suffisamment sensible pour détecter des protéines parasitaires. Enfin, les produits d'excrétion-sécrétion (PES) de f. hepatica et f. gigantica ont été profilées. Les deux espèces partageaient plus de similitudes que parmi les phases de juvéniles nouvellement excystés (JNV) et des adultes. Les différences les plus notables entre les JNV et les adultes étaient le profil des protéases et les isotypes de ces protéases retrouvés. Les montants de cathepsine L, B et de legumain chez les JNV étaient relativement égaux, tandis que la majorité des protéases chez les adultes étaient cathepsine L. Des clades de cathepsine L spécifiques aux JNV et aux adultes ont été identifiés ainsi qu'un clade potentiellement spécifique aux JNV de f. gigantica. Les niveaux d'enzymes antioxydants de défense dans les PES étaient plus élevés dans chez les adultes que les JNV, ainsi qu'une abondance plus élevées chez f. gigantica que f. hepatica. Ces analyses suggèrent que l'expression des protéines spécifique aux phases de développement et la diversité des isotypes devraient être considérées lors de l'élaboration d'un vaccin ciblé à un stade précoce de l'infection et lors du développement de cibles chimiothérapeutiques à large spectre. Ces études contribuent aux connaissances fondamentales des agents causals de fasciolase et l'usage d'outils protéomiques dans l'étude des interactions hôte-parasite.

Schistosomiasis and fasciolosis are parasitic diseases that affect a great number of people, particularly in developing countries, and cause huge global morbidity. Diagnosis is essential for control, treatment and prognosis of the diseases and yet a simple, cheap, sensitive and specific assay is not readily available for either of them. In the current study, cathepsin B (SmCB) and cathepsin L1 (FhCL1) were investigated as potential diagnostic reagents to detect schistosomiasis and fasciolosis, respectively, in humans. The genes encoding SmCB and FhCL1 were expressed Pichia pastoris and the proteins isolated to homogeneity by affinity chromatography. The SmCB ELISA was optimized for antigen concentration, primary antibody dilution and secondary antibody dilution using a pool of sera obtained from patients that were coprologically-positive or negative for schistosomiasis. A clear distinctive was achieved between these two sera pools. However, when employed to screen a panel of patients from Senegal the test failed to provide satisfactory discrimination between schistosoma-infected and schistosoma-negative individuals. The FhCL1 ELISA was optimized using sera from Fasciola-infected individuals from Cuba, and samples from Cuban and Canadian non-infected patients. We determined the optimal dilution for the primary antibody and also assessed/compared the performance of anti-total IgG, IgG4, IgG1 and IgG2 secondary conjugated antibodies. Total IgG provided the best discrimination between Fasciola- infected and non-Fasciola infected individuals with a 99.99% sensitivity and specificity. Furthermore, by screening sera obtained from patients infected with various worm and protozoan diseases we showed that the FhCL1 ELISA does not cross-react with other diseases commonly found in similar geographical regions as fasciolosis. In conclusion, diagnosis of human schistosomiasis still remains uncertain and more studies need to be performed to improve our diagnostic test using SmCB. On the other hand, we have developed a simple, sensitive, specific and accurate test to detected human fasciolosis by using FhCL1, a major protease released by the parasite. The P. pastoris expression system allowed us to obtain up to 80 mg of FhCL1 enzyme per 4 L culture. Therefore, we not only have developed a standardized test that showed high specificity and sensitivity but we also have the methodology to obtain sufficent quantities of antigen needed future mass screening of human fasciolosis in affected regions. / La schistosomiase et la fasciolose sont deux maladies parasitaires qui touchent un grand nombre de personnes, en particulier dans les pays en développement, causant une morbidité élevée. Le diagnostic est essentiel pour le contrôle, le traitement et le pronostic de ces maladies et pourtant aucun essai simple, abordable, sensible et spécifique n'est disponible à ce jour pour l'une d'entre elles. Dans le cadre de la présente étude, cathepsine B (SmCB) et cathepsine L1 (FhCL1) ont fait l'objet d'une investigation sur leur potentiel à être utiliser pour diagnostiquer la schistosomiase et fasciolose, respectivement, chez les humains. Dans la présente étude, les gènes encodant SmCB et FhCL1 ont été exprimés dans Pichia pastoris et les protéines isolées par chromatographie d'affinité. Le test ELISA pour SmCB a été optimisé pour une concentration en antigène et pour une dilution d'anticorps primaire et secondaire en utilisant un pool de sérums provenant de patients qui étaient positifs ou négatifs pour la schistosomiase suivant des examens coprologique. Une distinction claire entre ces deux bassins de sérums a été observée. Toutefois, lorsque le test a été utilisé pour dépister des patients du Sénégal, il a échoué à fournir une discrimination satisfaisante entre les individus infectés et non-infectés par la schistosomiase.Le test ELISA pour FhCL1 a été optimisé à l'aide de sérums provenant de personnes cubaines infectées par la fasciolose et de patients non-infectés de Cuba et du Canada. Nous avons déterminé la dilution optimale pour l'anticorps primaire et également évalué et comparé la performance des anticorps secondaires conjugués contre les IgG totaux, IgG4, IgG1 et IgG2. Les IgG totaux ont fourni la meilleure discrimination entre les personnes infectées et non-infectées par la fasciolose avec une sensibilité et une spécificité de 99.99 %. En plus, en appliquant le test de dépistage sur des patients infectés par d'autres variétés de vers et de protozoaires, nous avons démontré que le test ELISA pour FhCL1 ne réagit pas de façon croisée avec d'autres maladies retrouvées couramment dans les régions géographiques où se trouve la fasciolose.En conclusion, le diagnostic de la schistosomiase humaine reste encore incertain et d'autres études doivent être effectuées pour améliorer notre test de dépistage utilisant SmCB. D'autre part, nous avons développé un test simple, sensible, spécifique et précis pour le dépistage de la fasciolose humaine en utilisant FhCL1, une protéase majeure relâchée par le parasite. Le système d'expression de P. pastoris nous a permis d'obtenir jusqu'à 80 mg de FhCL1 par 4 litres de culture. Dans la présente étude, nous avons non seulement mis au point un test standardisé démontrant une spécificité et une sensibilité élevées, mais également développé une procédure pour produire de grandes quantités d'antigènes nécessaires au dépistage à grande échelle de la fasciolose humaine dans les régions touchées.