<p> Current antiretroviral therapy (ART) is highly effective at blocking HIV-1 replication but does not cure the infection due to the persistence of latently-infected cells that are able to undergo cellular proliferation (1). The majority of HIV-1 proviruses that persist during ART are defective. Of the minority that are intact and replication competent, it is not known what fraction are transcriptionally active <i>in vivo</i> versus those that are transcriptionally silent (latently infected). To address this question, I determined the fraction of HIV-1 proviruses in populations of expanded cell clones that express unspliced, cell-associated RNA during ART in one individual. In total, 34 different cell clones carrying either intact or defective proviruses in &ldquo;Patient 1&rdquo; from Maldarelli, <i>et al.</i> (1) were assessed. We found that a median of 2.3% of cells within clones harboring replication-competent proviruses contained unspliced HIV-1 RNA. Highest levels of HIV-1 RNA were found in the effector memory T cell subset, including for the replication-competent AMBI-1 clone, which was the source of persistent viremia on ART. The fraction of cells within a clone that contained HIV-1 RNA was not different in clones with replication-competent vs. defective proviruses. However, higher fractions and levels of RNA were found in cells with proviruses containing multiple drug resistance mutations, including those contributing to rebound viremia. These findings suggest that the vast majority of HIV-1 proviruses in persistently-infected cells, including replication-competent proviruses, are transcriptionally silent at any given time. This silence, if maintained over time, may allow infected cells to persist and expand during effective ART.</p><p>

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Thesis (Ph.D.)--University of California, San Francisco, 2009. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 70-06, Section: B, page: 3359. Adviser: Frank McCormick.

The major source of virus production during human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection is activated CD4 T-cells, although infection of some other cell types can also contribute to virus production. A viral reservoir is either a cell type or an anatomical site whose properties can result in the persistence of infectious virus for a longer time period than the primary source of virus production, and several different HIV-1 reservoirs are known to exist. The work presented in this thesis examines three different aspects of viral reservoirs in HIV-1 infection. The first part (Chapter 2) is an investigation of the role of long-lived virus-producing cells during antiretroviral therapy. Specifically, cell culture experiments were designed that have resulted in a further understanding of the inhibition of HIV-1 replication in viral reservoirs. The second and third parts of this thesis (Chapters 3 and 4) consider the role of latently infected CD4 T-cells in HIV-1 infection. Latently infected cells carry an HIV-1 genome that is integrated into the cellular chromatin and does not produce viruses, but that retains the capacity for infectious virus production in the future. These cells form the latent reservoir, which represents the major barrier to an HIV-1 cure and necessitates life-long antiretroviral therapy for infected individuals. The work presented in Chapter 3 demonstrates that it is possible to inhibit the establishment of latent infection in vitro, something that has not yet been achieved clinically. Chapter 4 considers the potential contribution of latent viruses to viral genetic diversity, and shows that latent viruses can contribute to the development of multidrug resistance. In summary, the work presented in this thesis provides for a greater understanding of the role of viral reservoirs in HIV-1 infection and of the ability of antiretroviral drugs to combat infection. / Les cellules T CD4 activées sont la principale source de virus pendant l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) même si d'autres cellules contribuent à la production virale. Un réservoir viral est un type de cellule ou un compartiment anatomique dont les propriétés permettent la persistance du virus infectieux pour plus longtemps que la source majeure de la production virale et le VIH-1 occupe plusieurs réservoirs. Dans cette thèse, nous examinons trois différents aspects des réservoirs du VIH-1. Dans la première partie (Chapitre 2), nous avons étudié le rôle des cellules à grande longévité qui produisent du virus dans la thérapie anti-rétrovirale. En particulier, nous avons étudié en culture cellulaire comment inhiber la réplication virale dans ces cellules. Dans la deuxième et troisième partie (Chapitres 3 et 4), nous avons étudié le rôle de la latence dans les cellules T CD4. Les cellules latentes contiennent le génome du VIH-1 intégré dans leur chromatine sans produire du virus. Néanmoins, ces cellules peuvent produire du virus infectieux dans le futur et sont un obstacle majeur contre la guérison des individus vivants avec le VIH, ce qui les oblige à prendre des médicaments pour toute leur vie. Dans le Chapitre 3, nous montrons qu'il est en théorie possible d'empêcher l'infection latente, ce qui n'a jamais été fait en clinique. Finalement, le Chapitre 4 étudie le rôle du virus latent dans la diversité génétique du VIH, et montre que les virus latents peuvent participés à l'émergence de la résistance contre plusieurs médicaments. En résumé, le travail de cette thèse contribue à une meilleure compréhension du rôle des réservoirs viraux dans l'infection au VIH-1.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a small retrovirus that highly depends on the host cell machinery to replicate by completing its lifecycle and producing new infectious viral particles. The complexity of HIV-1 life cycle regulation only reflects the diversity of the virus-host interactions. Cellular helicases are enzymes involved in every step of nucleic acid metabolism, through rearranging ribonucleoprotein complexes. The understanding and the importance of helicases in HIV-1 replication started to emerge a decade ago. Since then, many studies reported the promoting or inhibiting effect of this protein family on HIV-1. My thesis project was to investigate the role of helicases in HIV-1 replication and comprises two parts. First, we performed a shRNA screen in SupT1 cells to knockdown 130 helicases and monitor their effect on the production of HIV-1 particles. This work allowed us to identify cellular pathways that are important for HIV-1 replication, as well as 35 potential helicases that dramatically affect virus production. Second, we chose to further investigate the role of DDX17 in HIV-1 replication. In addition to showing for the first time that a helicase is required for HIV-1 frameshift, we found that DDX17 promotes viral RNA packaging. Considering the role of DDX17 as a cofactor of the zinc antiviral protein (ZAP) in exosome-mediated HIV-1 mRNA degradation, this emphasizes the fact that helicases are multifunctional proteins. Finally, this work identifies helicases that potentially strongly modulate HIV-1 production. Individual investigation for each candidate will be needed to unravel the mechanisms underlying their effect on HIV-1 replication. / Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un petit rétrovirus qui dépend fortement de la machinerie cellulaire afin de compléter son cycle de réplication et produire de nouvelles particules virales infectieuses. La complexité de la régulation du cycle de réplication du VIH-1 reflète la diversité des interactions hôte-virus. Les hélicases sont des enzymes impliquées dans toutes les étapes du métabolisme des acides nucléiques, en réarrangeant les complexes ribonucléprotéiques. La compréhension de l'importance des hélicases dans la réplication du VIH-1 a commencé il y a une dizaine d'années. Depuis, plusieurs études ont rapporté les effets stimulateurs ou inhibiteurs de cette famille de protéines sur le VIH-1. Mon projet de thèse était d'investiguer le rôle des hélicases dans la réplication du VIH-1 ; il comprenait deux parties. Premièrement, nous avons supprimé l'expression de 130 hélicases au moyen de shRNAs dans les cellules SupT1. Ce travail nous a permis d'identifier les voies cellulaires majoritairement impliquées dans la réplication du VIH-1, ainsi que 35 hélicases affectant de manière drastique la production virale. Dans un second temps, nous avons choisi de nous intéresser plus en détails au rôle de la protéine DDX17 dans la réplication du VIH-1. En plus d'identifier pour la première fois une hélicase étant requise pour le décalage du cadre de lecture (-1), nous montrons que DDX17 favorise l'encapsidation de l'ARN viral. Considérant que DDX17 agit également en tant que co-facteur de ZAP (protéine antivirale zinc) dans la dégradation des ARNs du VIH-1 par l'exosome, cela souligne le fait que les hélicases sont multifonctionnelles. Finallement, au cours de ce travail nous avons identifié un certain nombre d'hélicase ayant le potentiel de fortement moduler la production du VIH-1. Des études individuelles seront nécessaires afin de mettre à jour les mécanismes responsables de l'effet de chacun des candidats sur la réplication du VIH-1.

The success of the antiviral response by the host relies on several families of pathogen recognition receptors (PRRs) and sensors that recognize structures conserved among microbial species, culminating in the production of cytokines and chemokines to combat viral infection and signal the formation of an effective adaptive response. At the cellular level, the production of type I interferon (IFN) is regulated at multiple levels. The synergistic action of activated transcription factors such as AP-1, NF-kB and IRFs on the promoters of type I IFN genes triggers the immediate early IFN response, that is further amplified by the JAK-STAT signaling pathway. Thus far, three main families of PRRs have been identified: The transmemebrane Toll-like receptors (TLRs), the cytosolic Nod-like receptors (NLRs) and the RIG-I-like receptors (RLRs). In addition, cytosolic sensors of double-stranded dsDNA have been shown to play an important role in triggering type I IFN and caspase-1 inflammmasome pathways. Throughout the pathogen-host co-evolution, viruses have evolved numerous mechanisms to subvert the antiviral response, as well as prevent host cell apoptosis to promote virus propagation. As a consequence, the development of effective antiviral strategies requires in depth knowledge of IFN and apoptotic signaling pathways. Thus, our first objective was to identify regulators of RNA virus signaling pathways. In our first study, we establish Triad3A, a previously described negative regulator of TLR and TNFR, as an important molecule modulating the RIG-I/MAVS signaling pathway by proteasomal-mediated degradation of the adaptor molecule TRAF3. The second objective of our study was to provide a link between host cell-mediated apoptosis and host cell-mediated antiviral response. The results from our second study demonstrate that the establishment of a complete antiviral response requires pro-apoptotic proteins Bax and Bak-induced cell death in response to RNA virus infection. Therefore, the final aim of this thesis project was to identify apoptotic regulators of the RIG-I signaling pathway. Our third study demonstrates that the noncanonical kinases TBK1/IKKepsilon directly phosphorylate and regulate XIAP protein levels, which in turn regulates IRF-3-Bax-mediated apoptosis. Overall, these studies highlight important regulatory mechanisms and links between apoptotic signaling and the antiviral response that may provide a future avenue for more efficacious vaccines and therapies. / Le succès de la réponse antivirale de l'hôte repose sur plusieurs familles de récepteurs qui reconnaissent des structures conservées d'agents pathogènes (PRRs) et qui abouti à la production de cytokines et de chimiokines pour lutter contre l'infection virale et induire une réponse antivirale acquise. Au niveau cellulaire, la production d'interféron (IFN) de type I est régulé à plusieurs niveaux. L'action synergique des facteurs de transcription activés tels que AP-1, NF-kB et IRF sur les promoteurs des gènes de l'IFN de type I déclenche une réponse immédiate qui est amplifiée par la voie de signalisation JAK-STAT. Jusqu'à présent, trois grandes familles de récepteurs d'agents pathogènes ont été identifiés: les récepteurs transmembranaire Toll-like (TLR), les récepteurs cytosolique Nod-like (NLR) et les récepteurs cystosolique RIG-I-like (RLR). De plus, il a été montré que des récepteurs cytosoliques reconaissant le double brin d'ADN jouent un rôle important dans le déclenchement de la réponse IFN de type I et les voies de signalisation inflammatoire reliées à la caspase-1. Au cours de l'évolution, les virus ont developpé de nombreux mécanismes pour échapper à la réponse antivirale et bloquer l'apoptose de la cellule hôte pour ainsi promouvoir la propagation du virus. En conséquence, le développement de stratégies antivirales efficaces exige une connaissance approfondie des voies de signalisation de l'IFN et de l'apoptose. Ainsi, notre premier objectif était d'identifier des régulateurs des voies de signalisation activées par les virus à ARN. Dans notre première étude, nous établissons que Triad3A, un régulateur negatif de la signalisation des TLR et TNFR décrit précédement, module la voie de signalisation RIG-I/MAVS par la dégradation protéomique de la molecule adapteur TRAF3. Le deuxième objectif de notre étude était d'établir un lien entre l'apoptose cellulaire et la réponse antivirale. Les résultats de notre deuxième étude montrent qu'une réponse antivirale complète dépend de la mort cellulaire induite par les protéines pro-apoptotiques Bax et Bak suite à une infection par un virus à ARN. Par conséquent, l'objectif final de ce projet de thèse était d'identifier des protéines régulant l'apoptose induite par la voie de signalisation RIG-I. Notre troisième étude montre que les kinases non-canoniques TBK1/IKKepsilon phosphorylent directement et régulent le niveau de la protéine XIAP, qui à son tour régule l'apoptose causée par IRF-3-Bax. Globalement, ces études mettent en lumière d'importants mécanismes de régulation et des liens entre la signalisation apoptotique et la réponse antivirale qui pourrait permettre le dévelopment de vaccins et de thérapies plus efficaces.

Infection with human T cell Leukemia virus (HTLV-1) can cause Adult T-cell Leukemia (ATL) or the neurological disorder HTLV-1-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP). Although the majority of HTLV-1–infected individuals remain asymptomatic carriers (AC) during their lifetime, 2-5% will develop either ATL or HAM/TSP. The factors that determine HTLV-1 pathogenesis remain elusive, and therefore represent a serious obstacle in the establishment of effective therapies for HTLV-1-associated diseases. Using gene expression profiling of CD4+ T-lymphocytes isolated from HTLV-1-infected individuals, we identified candidate genes differentially regulated in HTLV-1-associated diseases. Of particular interest, SOCS1 was up-regulated in HAM/TSP and AC patients – but not in ATL. SOCS1 positively correlated with HTLV-1 mRNA in HAM/TSP patient samples. SOCS1-mediated degradation of IRF3 - inhibited antiviral signaling during HTLV-1 infection. Our study reveals a novel evasion mechanism utilized by HTLV-1 which leads to increased retroviral replication, without triggering an IRF3-dependent interferon response. Thus, targeting SOCS1 could represent a potential new approach to enhance the therapeutic potency of IFN-α/β treatment in HAM/TSP disease. Although treatment of hematological malignancies has improved considerably, this has not benefited ATL patients, as they are completely refractory to conventional chemotherapeutic regimens. Oncolytic viruses, such as Vesicular stomatitis virus (VSV), have emerged as a potential treatment for cancer. Here we show that in vitro VSV infection induced significant oncolysis in highly proliferating primary ATL cells, but not in primary Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) cells which are arrested in the G0 phase. As chronic activation and proliferation is characteristic of ATL cells, we examined the effect of T-cell activation on VSV permissiveness and lysis. Activation of primary CD4+ T-lymphocytes was sufficient to induce VSV replication and VSV-triggered cell death, suggesting that cellular signaling pathways - ERK, JNK or AKT - that promote VSV replication are engaged during T-cell activation. Similarly, mitogenic activation of primary CLL promotes the exit from G0 and entrance into the cell cycle, rendering them susceptible to VSV-mediated oncolysis. Moreover, a global increase in protein translation mediated by the activation of mTOR and eIF4E was crucial for VSV replication in primary lymphocytes. These findings provide novel molecular targets for ATL and CLL therapeutics. / Le rétrovirus T-lymphotropique humain (HTLV-1) est l'agent étiologique de la leucémie à cellule T de l'adulte (ATL) - une leucémie agressive et fatale des lymphocytes T CD4+. HTLV-1 est également associé à une forme de myélopathie chronique appelée Paraparésie Spastique Tropicale ou atteinte neurologique connue sous le nom de HTLV-1 - Associated Myelopathy (HAM/TSP). Bien que la majorité des individus infectés avec HTLV-1 demeurent asymptomatiques (AC) au cours de leur vie, 2 à 5% développent soit une ATL soit une HAM/TSP. Les facteurs qui déterminent la pathogénèse de l'HTLV-1 restent inconnus, et représentent donc un sérieux obstacle à la mise en place de traitements efficaces contre les maladies associées au virus HTLV-1. Les études sur l'expression des gènes des lymphocytes T CD4+ isolés de patients infectés par HTLV-1, ont permis l'identification de gènes d'intérêt exprimés de façon différentielle dans les maladies associées au virus HTLV-1. De façon intéressante, il a été mis en évidence que l'expression de SOCS1 est plus élevé chez les patients asymptomatiques ou HAM/TSP que chez les patients ATL qui expriment généralement très peu d'ARN viral. Chez les patients HAM, il existe une corrélation directe entre le niveau d'expression de SOCS1 et l'activité transcriptionelle provirale. Du point de vue fonctionnel, SOCS1 inhibe la réponse antivirale, entre autre via la dégradation du facteur de transcription IRF3. Cette étude a donc permis d'identifier un nouveau mécanisme utilisé par HTLV-1 afin d'inhiber la réponse antivirale et ainsi d'augmenter sa capacité de réplication.Dans cette étude, nous démontrons également que l'infection in vitro par le VSV induit la lyse oncogénique des cellules ATL, à fort potentiel prolifératif, mais pas celle des cellules primaires de la leucémie lymphocytique chronique (CLL), qui sont quiescentes in vitro. Puisque l'activation et la prolifération chronique est une caractéristique des cellules ATL, nous avons étudié l'effet de l'activation des cellules T sur leur permissivité au VSV ainsi que leur lyse induite par le virus. L'activation des cellules T CD4+ primaires de patients sains est suffisante pour permettre la réplication virale et la mort cellulaire induite par le VSV. L'utilisation d'inhibiteurs de la signalisation cellulaire a montré que l'activation de ERK, JNK ou AKT est suffisante pour permettre la réplication de VSV dans les cellules T CD4+. De façon similaire, la stimulation mitogénique des cellules CLL de patients induisant leur entrée dans le cycle cellulaire, les rend susceptibles à l'oncolyse par le VSV. De plus, une augmentation globale de la traduction protéique induite par l'activation de mTOR et eIF4E est essentielle pour la réplication du VSV dans les lymphocytes primaires.En conclusion, ces résultats permettent d'identifier de nouvelles voies thérapeutiques pour les leucémies de l'ATL et CLL.

The process of translocation by the reverse transcriptase (RT) of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is a critical step in the incorporation of nucleotides by this polymerase, with functional consequences with respect to both the mechanism of action and resistance to inhibitors of RT. The work contained in this thesis describes the characterization of molecular determinants of the RT translocational equilibrium, and the functional consequences of this equilibrium. Amino acid substitutions F61A and A62V of the fingers subdomain are shown to have opposite effects on the translocational equilibrium with F61A leading to a strong post-translocation bias, and A62V causing increases in the pre-translocation conformation. These effects are related to the activity of the pyrophosphate analogue foscarnet. The impact of the nucleic acid sequence on the translocational equilibrium is also investigated with respect to incorporation and excision of nucleotides. A post-translocation bias is observed for the majority of sequences tested and corresponds to higher efficiency of nucleotide incorporation under pre-steady state conditions with defined sequences. Pre-translocation bias is associated with increased efficiency of excision of chain-terminated nucleotides. Mechanisms for observed differences between pre- and post-translocation sequences and implications for mechanisms of drug resistance are discussed. Finally, this thesis includes the characterization of the mechanism of novel drug resistance-conferring mutation Q151L. Resistance by Q151L to the investigational inhibitor GS-9148 is determined to be increased discrimination by pre-steady state kinetic analysis. / Le processus de translocation de la transcriptase inverse (TI) duvirus d'immunodéficience humaine-1 (VIH-1) est une étape critique de l'incorporation de nucléotides lors du processus de polymerization. Cette translocation de la TI affecte le mécanisme d'action ainsi que la resistance aux inhibiteurs de cette derniere. Les travaux contenus dans cette thèse décrivent la caractérisation des déterminants moléculaires qui affecte l'équilibre de la translocation de la TI et les consequences fonctionnelles de cet équilibre. Les substitutions des acides aminés F61A et A62V du sous-domaine des doigts ont des effets opposés sur l'équilibre. En effet, la mutation F61A confère une forte tendance vers la post-translocation tandis que la mutation A62V entraîne des augmentations de la conformation pré-translocation. Ces effets sont liés à l'activité de l'analogue de pyrophosphate foscarnet. L'impact de la séquence d'acides nucléiques sur l'équilibre de la translocation est également étudiée à l'égard de l'incorporation et de l'excision de nucléotides. Un biais de post-translocation est observé pour la majorité des séquences testées et correspond à une plus grande efficacité de l'incorporation denucléotides dans des conditions pre-stationnaires avec des séquences bien définies. Un biais de pré-translocation est associé à une efficacité accrue de l'excision des analogues de nucléotides qui sont utilisés comme anti-rétroviraux dû a leur capacité à bloquer la polymerization suite à leur incorporation par la TI. Les mécanismes des différences observées entre les sequence post-translocation et pré-translocation ainsi que les implications pour les mécanismes de résistance aux médicaments sont discutés. Enfin, cette thèse inclut la caractérisation du mécanisme de résistance de nouveaux médicaments conférant la mutation Q151L. En effet, l'analyse cinétique pre-stationnaire a demontré que la résistance par Q151L à l'inhibiteur expérimental GS-9148 est causé par une augmentation de la discrimination entre cet inhibiteur et le nucléotide naturel.