Following infection by most viruses, an antiviral state is induced in the host cells characterized by the expression of interferon (IFN) and several IFN-stimulated genes (ISGs). IFN treatment is effective to inhibit HIV replication in infected cells, but shows no significant improvement of HIV-infected patients. Currently, the discrepancy between the in vitro and the in vivo findings remains largely unresolved. The IFN-induced RNA-dependent protein kinase PKR is activated via trans-phosphorylation and plays a central role in the IFN-induced antiviral pathway. Our results show that PKR is transiently activated following HIV-1 infection of Jurkat and peripheral blood mononuclear cells. The kinase is then inactivated at the viral peak, when HIV replication is highly active. By immunoprecipitation, we found that PKR forms a ribonucleoprotein complex with cellular double-stranded RNA binding proteins (dsRBPs), the TAR RNA Binding Protein (TRBP), the adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)1 and the PKR Activator (PACT) during HIV replication. Over-expression of PKR is sufficient to inhibit HIV production in HEK 293T cells. This inhibition is reversed by expression of the ADAR1, another ISG. By using mutants of ADAR1, we show that this activity is linked to the ability of the protein to bind PKR. In astrocytes that do not replicate HIV efficiently due to an enhanced PKR response, ADAR1 partially restores viral expression. Surprisingly, PACT binds to and inhibits PKR activity. All three dsRBPs, TRBP, ADAR1 and PACT prevent PKR activation and the phosphorylation of its downstream target, eIF2alpha. Together, our results highlight the key function of PKR in innate immunity and its multiple-level of regulation during HIV-1 replication. / L'infection d'une cellule par un virus induit un état antiviral, caractérisé par l'expression de l'interféron (IFN) et de plusieurs gènes induits par l'IFN. Le traitement par l'IFN est efficace pour inhiber la réplication du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans des cellules infectées en culture, mais ne montre aucun effet bénéfique chez les patients infectés par ce même virus. Cette disparité qui existe entre les résultats de recherche in vivo et in vitro n'est toujours pas résolue. PKR, une protéine kinase induite par les IFNs, est activée par phosphorylation et joue un rôle central dans le mécanisme antiviral de l'IFN. Nos résultats démontrent que PKR est activée de manière transitoire suite à l'infection de cellules lymphocytaires Jurkat ou de lymphocytes/monocytes primaires du sang périphérique par le VIH. Par contre, la kinase n'est plus activée durant et après le pic d'infection, lorsque la réplication du virus est intense. Par immunoprécipitation, nous avons démontré que PKR forme un complexe ribonucleoprotéique avec plusieurs protéines cellulaires qui lient l'ARN double-brin, soit la protéine liant l'ARN TAR, TRBP, l'adénosine déaminase ADAR, ainsi que la protéine activatrice de PKR, PACT, pendant la réplication virale. La surexpression de PKR est suffisante pour inhiber la production du VIH dans les cellules HEK 293T. Cette inhibition est supprimée par l'expression d'ADAR1, une des protéines induite par les IFNs. Par différentes mutations dans la séquence protéique d'ADAR1, nous avons démontré que cette activité d'ADAR est liée à sa capacité de lier PKR. Dans les astrocytes, qui ne répliquent pas le VIH efficacement en raison d'une activation accrue de PKR, ADAR1 rétablit partiellement l'expression virale. Étonnamment, PACT se lie à PKR et inhibe son activité dans les cellules infectées par le VIH. Testées en parallèle, TRBP, ADAR1 et PACT empêchent l'activation de PKR ainsi que la phos

The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) usurps host cellular components and machinery for its advantage. Several host proteins have been shown to play a crucial role in the HIV-1 replication cycle. Staufen1, for instance, plays an important role in HIV-1 viral genomic RNA (vRNA) selection and encapsidation. The Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) machinery is another example of host proteins that are hijacked by HIV-1 virus. The endogenous role for the ESCRT machinery is to help in the inward budding of intraluminal vesicles (ILV) from the membranes of late endosomes to generate multi vesicular bodies (MVB). MVBs are then directed to lysosomes for the degradation of their cargo proteins. HIV-1 uses the ESCRT machinery for budding from the cell in a similar manner to the ILV budding. In Drosophila, Vps22 and Vps36, both part of ESCRT-II complex, work together with Staufen to properly localize bicoid mRNA in the fertilized egg. / In our work, we show that altering cellular levels of Vps22 has a significant effect on the precursor protein pr55Gag (Gag) and virion production. We also show that a novel interaction between Vps22 and both Gag and Staufen1 exists in HeLa cells. Our data provide the first evidence that the Staufen1—ESCRT-II (Vps22) interaction is evolutionarily conserved in mammalian cells. Our data also show a novel role for Vps22 in the context of HIV-1. / Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) usurpe les composantess cellulaires à son avantage. Il a été démontré que plusieurs protéines de l'hôte jouent un rôle important pendant le cycle de réplication du VIH-1 tel que Staufen1 lors du processus de la sélection et d'encapsidation de l'ARN génomique viral (ARNv). L'Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) est un autre exemple de protéines de l'hôte détournées par le VIH-1. Le rôle endogène pour l'ESCRT est de porter assistance au bourgeonnement intérieur des vésicules intraluminales (ILV) de la membrane des endosomes tardifs pour générer les corps multivésiculaires (MVB). Les MVBs sont ensuite dirigés vers les lysosomes pour la dégradation de leurs cargaison de protéines. Le VIH-1 utilise l'ESCRT pour son bourgeonnement dans une manière similaire à la formation de l'ILV. Dans la Drosophile, les Vps22 et Vps36, deux protéines du complexe ESCRT-II, interagissent avec Staufen pour une localization correcte de l'ARNm bicoid dans l'œuf fécondé. / Dans notre travail, nous démontrons que la modification des niveaux de Vps22 a un effet significatif sur le polyprotéine précurseur Gag et aussi sur la production de virus. Dans les cellules HeLa, nous démontrons également une nouvelle intéraction entre Vps22 et les deux protéines Gag et Staufen1. Nos données fournissent la première preuve que l'intéraction entre Staufen1 et ESCRT-II (Vps22) est conservée chez les eucaryotes. Nos données démontrent également un nouveau rôle pour Vps22 dans le contexte de la réplication du VIH-1.

Viral infection triggers production of interferon (IFN) that in turn leads to the expression of genes known as IFN-stimulated genes (ISGs), some of which possess antiviral activities. Previous studies have shown that IFN suppresses the replication of human immunodeficiency virus type I (HIV-1). While several ISGs have been linked to this specific antiviral activity with well-defined inhibitory mechanisms, others remain to be investigated. With the purpose of identifying novel ISGs capable of inhibiting HIV-1 replication, we have performed a shRNA screen of the genes upregulated by IFN in SupT1 cells. This study reports three ISGs, known as interferon-induced transmembrane proteins 1, 2 and 3 (IFITM1, 2 and 3), that substantially inhibit HIV-1 replication in SupT1 cells. Further studies suggest that HIV-1 entry is impaired. Collectively, these findings identify a small family of cellular restriction factors that serve as a barrier to HIV-1 entry into the host cell. / Suite à une infection virale, les interférons (IFNs) sont produites et servent à induire l'expression de certains gènes, appelés gènes stimulés par l'interféron (ISGs), dont certains possèdent des effets antivirales. Plusieurs études ont démontré que l'IFN possède la capacité d'inhiber la réplication virale du virus de l'immunodéficience humaine de type I (VIH-1). Tandis que certains ISGs ont été associés à une activité antivirale spécifique avec un mécanisme d'action bien défini, d'autres ISGs sont moins bien caractérisés. Dans le but d'identifier de nouveaux ISGs responsables d'inhiber la réplication virale du VIH-1, nous avons réalisé un criblage par shRNA des gènes régulés par l'IFN dans les cellules SupT1. Cette étude rapporte trois ISGs, appelés «interferon-induced transmembrane proteins 1, 2 et 3» (IFITM1, 2, et 3), dont l'expression dans les cellules SupT1 peut inhiber la réplication virale du VIH-1 de façon significative. Les résultats indiquent que ces protéines agissent au niveau de l'entrée du virus dans la cellule. Collectivement, cette étude a identifié une famille de facteur de restriction cellulaire qui agit comme barrière pour prévenir l'entrée du VIH-1 dans la cellule hôte.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) commandeers host proteins and cellular machineries to its advantage at every step of its replication cycle. This work initially shows that HIV-1 infection causes enhanced expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1) and promotes its cytoplasmic retention; and that this is dependent on the nuclear export of the unspliced viral genomic RNA (vRNA) and to alterations in the abundance and localization of nucleoporin p62 (Nup62). HnRNP A1 and the vRNA remain colocalized in the cytoplasm where hnRNP A1 acts as an internal ribosomal entry site (IRES) trans-acting factor (ITAF) to up-regulate IRES-mediated translation initiation of the HIV-1 vRNA to ensure abundant expression of viral structural proteins in cells infected with HIV-1. To define which components of the nuclear pore complex (NPC) are responsible for alterations in cellular Nup62 expression levels, nuclear envelopes (NEs) were isolated from mock- or HIV-1-infected T-cells for a comparative mass spectrometry study. The level of compositional and abundance changes to NE-associated proteins by the infection was surprisingly extensive, where it caused a large decrease in the presence of anchoring, scaffolding and core Nups. Immunoelectron microscopy analysis reveals that the loss of Nups from HIV-1 infection is not accompanied by changes to the general structure of NEs or NPC, and immunogold labelling shows a scattering of Nups into and across the cytoplasm, and their localization at assembling and budding viruses. Purification of cell free viruses reveals that Nup62 is encapsidated, suggesting that it is not simply ejected from the nuclear envelopes of HIV-1 infected cells, but rather may play an important role during HIV-1 replication. / Le virus de l'immunodéficience humaine type 1 (VIH-1) contrôle les protéines et la machinerie de l'hôte à chaque étape de son cycle de réplication. Ce projet a débuté suite à l'observation que l'infection par le VIH-1 augmente l'expression de la protéine ribonucléoprotéique nucléaire hétérogène A1 (hnRNP A1) et cause sa rétention cytoplasmique. Ceci est dépendant de l'exportation nucléaire de l'ARN viral et de modifications de l'abondance et de la localisation de la nucléoporine p62 (Nup62). Dans le cytoplasme, hnRNP A1 sert de facteur facilitant le recrutement des ribosomes sur des sites appelés IRES ('Internal Ribosomal Entry Site') pour garantir l'expression abondante de protéines structurelles virales. Donc, pour définir quels composants du complexe du pore nucléaire (CPN) sont responsables des modifications de Nup62, nous avons isolé les enveloppes nucléaires (ENs) de lymphocytes T infectées pour une étude de spectrométrie de masse comparative. Celle-ci a démontré d'importantes variations dans la composition et la représentation des protéines de l'EN suite à l'infection, entre autres une diminution de l'abondance des Nucléoporines (Nups) qui ancrent et échafaudent le CPN ainsi que celles du noyau. Ensuite, l'analyse ultrastructurelle par microscopie immuno-électronique a révélé que la perte des Nups causée par l'infection n'est pas accompagnée par des changements au niveau de la structure générale des ENs ou CPNs. Nous avons également observé une dispersion des Nups dans et à travers le cytoplasme ainsi que leur présence dans les virus bourgeonnants. La purification de virus libres révèle que Nup62 est incorporée dans ceux-ci, suggérant qu'elle n'est pas simplement éjectée des ENs par l'infection mais plutôt qu'elle joue un rôle important pour la réplication du VIH-1.

All viruses are gene poor relative to their host, thus, most steps in virus infection involve interactions between viral components and host factors. Identification of these factors represents one of the major frontiers in current virus research. In this study, protein-protein interaction methodologies were used to find host interactors of Turnip mosaic virus (TuMV) RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), VPg-protease (VPg- Pro) and P3 protein. / First, eukaryotic elongation factor 1A (eEF1A) was shown to interact with TuMV RdRp and VPg-Pro using tandem affinity purification in Arabidopsis thaliana and/or in vitro assays. Interaction of eEF1A with both viral proteins was shown to take place within 6K-VPg-Pro-induced vesicles. The same vesicles were also shown to contain poly(A)-binding (PABP) and heat shock cognate 70-3 proteins (Hsc70), two previously identified RdRp interactors. To further characterize the content of these vesicles upon TuMV infection, a fluorescently labeled 6K-GFP TuMV infectious clone was constructed and used in confocal microscopy experiments. The inclusion of eEF1A, PABP, Hsc70, eukaryotic initiation factor (iso)4E and VPg-Pro in TuMV-induced vesicles was demonstrated. It is well establish that positive-strand RNA viruses assemble their RNA replication complexes on intracellular membranes, usually in association with vesicle formation. For TuMV, our data suggest that it is the 6K-induced vesicles that house the viral replication complex (VRC). Moreover, the presence of replication and translation elements in these vesicles indicates that both processes might be coupled in TuMV VRC. / Secondly, the yeast two-hybrid system was used to identify plant P3-interacting proteins in a cDNA library from A. thaliana. A lipase was recovered from the screen and shown to interact with P3 in vitro. Both proteins were also demonstrated to partially co-localize in the cytoplasm of the cell. Given that lipases play important roles in the plant response to biotic stress, this interaction reinforce the role of TuMV P3 in plant resistance and/or pathogenesis. / Les virus ont de petits génomes qui codent pour un nombre limité de protéines et dépendent conséquemment des facteurs de l'hôte pour compléter leur cycle de réplication. Dans ce projet, nous avons utilisé différentes méthodes pour identifier des partenaires protéiques de la polymérase virale à ARN (RdRp), de la VPg-Pro et de la protéine P3 du virus de la mosaïque du navet (TuMV). / Premièrement, nous avons trouvé que le facteur eucaryote d'élongation de la traduction 1A (eEF1A) interagit avec la RdRp et la VPg-Pro en utilisant une stratégie de purification en tandem in planta et/ou des essais in vitro. Nous avons montré que ces interactions se produisent en association avec les membranes du réticulum endoplasmique, plus précisément dans les vésicules induites par le polypeptide 6K-VPg-Pro. Nous avons aussi démontré que ces mêmes vésicules contiennent les protéines Hsc70-3 et PABP, deux partenaires connus de la RdRp. Afin de poursuivre la caractérisation du contenu de ces vésicules, nous avons créé un vecteur infectieux du TuMV permettant d'étiqueter les vésicules avec la GFP et d'être utilisé en microscopie confocale. À l'aide de ce vecteur, nous avons observé la présence du facteur eEF1a, de la PABP, de la Hsc70, du facteur eucaryote d'initiation de la traduction (iso) 4E et de la VPg-Pro dans les vésicules induites par le TuMV. Il est bien établit que le complexe de réplication des virus à ARN positif est associé aux membranes cytoplasmiques, généralement sous forme de vésicules. Pour le TuMV, nos données semblent indiquer que les vésicules induites par la protéine 6K contiennent le complexe de réplication viral (VRC). De plus, la présence d'éléments participants à la réplication ainsi qu'à la traduction dans ces vésicules suggère que ces deux processus sont possiblement couplés dans le VRC du TuMV. / Deuxièmement, le système du double-hybride en levure a été utilisé pour rechercher des partenaires protéiques de P3. Le criblage de P3 contre une banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana a révélé une interaction entre P3 et une lipase. Lorsque exprimées ensembles dans Nicotiana benthamiana, les deux protéines co-localisent au cytoplasme. Étant donné le rôle des lipases dans les réponses des plantes aux attaques pathogènes, cette interaction renforce le rôle suggéré de la protéine P3 dans la pathogenèse et les mécanismes de résistance des plantes.

The hepatitis C virus (HCV) has infected over 170 million people worldwide and often leads to a chronic infection which can result in liver fibrosis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In order to develop more specific therapies for this disease, thorough understanding of the virus and its proteins is essential. This thesis focuses on the characterisation of two of these HCV encoded proteins, NS2/3 and NS2. The HCV NS2/3 protease cleaves between NS2 and NS3 and we show that NS2/3 activity is absolutely required for genome replication. Indeed, mutation of any of the catalytic active site residues in NS2/3 to alanine results in the inability of NS2 replicons to replicate in both transient and stable replication assays. However this effect is not explained by impairment of the catalytic activities of NS3 as NS3 ATPase, helicase and protease activities are not significantly affected by the presence of uncleaved NS2 in several in vitro and cell based assays. Furthermore, while the mutant uncleaved NS2/3 protein is found to be rapidly degraded in cell systems in a proteasome-dependent manner, NS2 lysine mutagenesis that results in stabilization of uncleaved NS2/3 is insufficient to rescue replication of NS2/3 protease inactive replicons. This suggests that NS2/3 cannot functionally replace NS3 for viral replication and that cleavage to liberate NS3 is absolutely required. Furthermore, we show that cleaved NS2 is also rapidly degraded in transient and stable RNA replication systems and that this degradation is conserved amongst several genotypes, indicating that control of NS2 levels could be important for the viral life cycle. Interestingly, in contrast to uncleaved NS2/3, NS2 degradation does not appear to be dependent on ubiquitination or proteasomal degradation. Finally, several lysine residues in NS2 are identified to be involved in HCV infectivity in a JFH-1 infection system, indicating these are important amino acids/regions involved in viral / Plus de 170 millions de personnes sont infectées par le virus de l'hépatite C, une infection souvent chronique qui peut entraîner le développement de graves conséquences pour la santé. Afin de développer des traitements spécifiques contre l'hépatite C, il est essentiel de bien comprendre le fonctionnement moléculaire du virus et les rôles des protéines produites par celui-ci. Cette thèse est donc centrée sur la caractérisation fonctionnelle de deux de ces protéines, NS2/3 et NS2. NS2/3 est une protéase autocatalytique qui clive entre NS2 et NS3. Nous démontrons que l'activité de NS2/3 est essentielle pour la réplication de l'ARN génomique du virus. La mutagénèse dirigée inactivant le site catalytique de NS2/3 rend des réplicons contenant NS2 incapables de se répliquer dans des essais de réplication stables et transitoires. Cependant, cet effet sur la réplication génomique n'est pas le résultat d'une déficience au niveau des activités catalytiques de NS3. Les fonctions ATPase, hélicase et protéase de NS3 ne sont pas affectées de façon significative par la présence de NS2 lors d'essais in vitro et cellulaires. Toutefois, nous démontrons que la protéine NS2/3 inactive est rapidement dégradée par la voie du système ubiquitine-protéasome. Bien que la mutagénèse des lysines de NS2 résulte en une stabilisation des niveaux de NS2/3, ces mutations sont toutefois incapables de surmonter la déficience au niveau de la réplication des réplicons contenant une protéine NS2/3 inactive pour l'autoclivage. Ces résultats suggèrent donc que NS2/3 ne peut accomplir le rôle de NS3 lors de la réplication génomique virale. De plus, nos résultats démontrent que la protéine NS2 est aussi dégradée rapidement dans plusieurs systèmes de réplication de l'ARN du virus. Cette dégradation est observée chez plusieurs génotypes, suggérant que le contrôle des niveaux de NS2 pourrait être important pour le cycle de vie d

Induction of the innate immune response by viral pathogens is characterized by a rapid production of Type I interferons (IFNβ/α). Recognition of viral components by Toll-like receptors (TLRs) or RIG-I-like receptors (RLRs), initiates multiple intracellular signalling cascades that culminate in the activation of the transcription factor NF-B and the interferon regulatory factors-3 and 7 (IRF-3 and IRF-7). As a consequence, these events lead to the production of immunoregulatory molecules, including Type I IFNs, pro-inflammatory cytokines and IFN-stimulated genes (ISGs), resulting in the inhibition of virus replication. Throughout evolution, viruses have developed strategies to subvert the innate immune response for their own benefit. Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1), the etiological agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), has been shown to evade the innate immune response, resulting in disease progression. Thus, understanding the distinct mechanisms by which HIV-1 modulates TLRs and RLRs signaling pathways will ultimately lead to the development of novel strategies to inhibit HIV-1 replication and propagation. Studies have indicated that TLRs that signal via NF-B enhance HIV-1 replication. However, TLR4 stimulation triggers both NF-B and the IFN pathway and thus may have inhibitory effects on HIV-1 replication. Our first study was aimed at better understanding the role of TLR4 in HIV-1 replication. Therefore, we first characterized IRF-3 and IRF-7 activation following TLR4 stimulation. Our results demonstrate that the non-canonical TBK1 and IKKε are activated with distinct kinetics resulting in the activation of IRF-3 and subsequent induction of Type I IFNs. Thus, activation of the IFN pathway via TLR4 stimulation can provide a novel strategy to inhibit HIV-1 replication. Our second study sought to further delineate the different signaling pathways activated by HIV-1. Accordingly, transcriptional changes induced by distinct HIV-1 subtypes in immature dendritic cells were examined by microarray analysis. Our findings demonstrate that during the late phase of HIV-1 infection, a subset of genes is differentially regulated by the subtypes. In addition, this study highlights the important role of immature dendritic cells in HIV-1 replication and dissemination. Finally, given the importance of RLRs in the recognition of RNA viruses, the objective of the final study was aimed at investigating the evasion mechanisms employed by HIV-1 to counteract the initial antiviral response. Our results reveal that HIV-1 RNA is detected by the cytosolic receptor RIG-I. However, the HIV-1 viral protease sequesters RIG-I to the lysosomes and thus inhibits RIG-I-mediated antiviral response. Overall, the research presented in this thesis provides new avenues for developing novel therapeutic and preventive strategies to combat HIV-1/AIDS. / L'induction de la réponse immunitaire innée par des pathogènes viraux est caractérisée par une production rapide des interférons de Type I (IFNβ/α). Les Toll-like (TLR) ou RIG-like (RLR) récepteurs détectent divers composants viraux induisant multiples voies de signalisation intracellulaire impliquées dans l'activation du factor de transcription-NF-B- ainsi que des facteurs de régulation de l'interféron-3 et -7 (IRF-3 et IRF-7). Ces évènements mènent à la synthèse de molécules immunorégulatrices, tel que les interférons (IFN) de Type I, les cytokines pro-inflammatoires et les gènes stimulés par l'IFN (ISG), qui jouent un rôle important dans l'inhibition de la réplication virale. Au cours de l'évolution, les virus ont développé des stratégies pour contrer la réponse immunitaire innée afin de se répliquer. Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1(VIH-1), l'agent infectieux du syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA), échappe à la réponse immunitaire innée, ce qui favorise la progression de la maladie. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le VIH-1 module les voies de signalisation des TLR et des RLR pourrait mener au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour empêcher la réplication et donc la propagation du VIH-1. Des études ont démontré que les TLR qui signalent par l'intermédiaire de NF-B augmentent la réplication du VIH-1. Cependant, la stimulation du TLR4 déclenche à la fois la voie de signalisation de NF-B et celle des IFN, pouvant avoir ainsi des effets inhibiteurs sur la réplication du VIH-1. L'objectif de notre première étude était de comprendre le rôle du TLR4 dans la réplication du VIH-1. Par conséquent, nous avons caractérisé la voie d'activation des IRF-3 et IRF-7 suite à la stimulation du TLR4. Nos résultats démontrent que les kinases non-canoniques TBK1et IKKε sont activées avec une cinétique distincte ayant pour conséquence l'activation de l'IRF-3 et l'induction subséquente des IFN de type I. Par conséquent, l'activation de la voie de signalisation des IFN par la stimulation du TLR4 pourrait offrir une nouvelle stratégie pour inhiber la réplication du VIH-1. Notre deuxième étude a eu pour but de définir les différentes voies de signalisation activées par le VIH-1. Les changements transcriptionels induits par les différents sous-types du VIH-1 dans les cellules dendritiques immatures ont été examinés par analyse de microréseaux. Nos résultats démontrent que pendant la phase tardive de l'infection VIH-1, un ensemble de gènes est différemment régulé par les différents sous-types du VIH-1. En plus, cette étude accentue le rôle important des cellules dendritiques immatures dans la réplication et la dissémination du VIH-1. En conclusion, étant donné l'importance des RLR dans la reconnaissance des virus à ARN, l'objectif de la dernière étude a été d'étudier les mécanismes d'évasion utilisés par VIH-1 pour contrer la réponse antivirale innée. Nos résultats démontrent que l'ARN du VIH-1 est détecté par le récepteur cytosolique RIG-I. Cependant, une protéine du VIH-1 -la protéase- séquestre le récepteur RIG-I dans les lysosomes et empêche l'activation de la réponse antivirale initié par le récepteur RIG-I. De façon générale, la recherche présentée dans cette thèse propose de nouvelles avenues pour développer des stratégies préventives et thérapeutiques afin de combattre le VIH-1/SIDA.

A hallmark of HIV infection is the gradual decline in CD4 T cells leading to AIDS and failure of the immune system. Depletion of CD4 T cells has been attributed to direct viral cytopathogenicity and hyperimmune activation which all lead to accelerated apoptosis. More recently, impaired thymic function has been shown to contribute to the numerical decline of CD4 T cells. The thymus is the primary source of de novo T cells that bear a broadly diverse T cell receptor (TCR) repertoire. In adults, the thymus produces every day approximately 50 million new T cells termed recent thymic emigrants (RTEs). Following their exit from the thymus, RTEs join the naive T cell compartment and upon antigen encounter differentiate into effector and memory T cells. / Abstract

BST-2 (tetherin/CD317/HM1.24) is an interferon-inducible cellular factor that is able to retain fully formed viral particles at the cell surface. This effectively prevents the release of a wide range of viruses including HIV-1 and SIV. Viruses in turn have evolved mechanisms to overcome this restriction, for example, HIV-1 uses Vpu to promote viral release and SIV uses Nef and/or Env. These evasion mechanisms are not fully understood and elucidating these mechanisms may lead to the development of therapies to combat AIDS and other viral infections. Our study focuses on two aspects of BST-2 antagonism: 1) mechanism employed by SIV to overcome BST-2 and 2) mapping the interaction site between BST-2 and Vpu. In part one, we demonstrate that SIV infection of COS-7 cells can downregulate simian BST-2 at the mRNA level in a species-specific manner. Further experiments indicate that this may be part of a broadly neutralizing mechanism to silence not only BST-2, but also other interferon-induced antiviral factors. In the second part of our study we use a bioluminescence energy transfer (BRET) technique to identify essential residues that contribute to the interaction between Vpu and BST-2, and viral release. Overall, this study provides important insight into mechanisms employed by viruses to evade BST-2 restriction. / BST-2 (tetherin/CD317/HM1.24) est un facteur cellulaire dont l'expression peut être induite par l'interféron et qui a la propriété de retenir les particules virales à la surface de la cellule. BST-2 est capable d'empêcher la relâche de particules virales matures et infectieuses d'un large groupe de virus incluant le VIH-1 et le VIS. Par conséquent, les virus se sont adaptés en développant leur propre mécanisme pour combattre cette restriction. Par exemple, le VIH-1 utilise la protéine virale u (Vpu). Une meilleure connaissance de ces mécanismes d'évasion est indispensable afin de permettre le développement de nouveaux médicaments pour combattre le SIDA et les autres infections virales. Cette étude est centrée sur deux aspects de l'antagonisme de BST-2: 1) les mécanismes utilisés par le VIS pour combattre BST-2 et 2) l'interaction entre BST-2 et Vpu. Dans la première partie, on démontre que l'infection des cellules COS-7 par le VIS réduit l'expression de BST-2 au niveau de l'ARNm. De plus, ce mécanisme ne semble être qu'une partie d'un mécanisme général ciblant les gènes stimulés par l'interféron (ISGs). Dans la deuxième partie de l'étude, on utilise une technique de transfert d'énergie bioluminescent (BRET) pour déterminer les résidus responsables de l'interaction entre BST-2 et Vpu. Dans son ensemble, cette étude apporte à une meilleure compréhension des mécanismes utilisés par les virus pour échapper à la restriction par BST-2.

The Gag protein of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) contains a 14 amino acid region termed SP1 that is located between the capsid (CA) and downstream nucleocapsid (NC) sequences, and plays an active role in Gag assembly. This activity of SP1 involves its amino-terminal residues that, together with adjacent CA residues, constitute a putative (x-helical structure spanning Gag residues from positions 359 to 371. However, the underlying mechanisms are mostly unclear. The major goal of this PhD study was to understand the role of SP1 in HIV-1 Gag multimerization, membrane binding and viral RNA packaging. In addition to the reported function of the SP1 region in virus assembly, we further mapped the assembly determinants within SP1 to H359, K360, L364, A367, and M368. Detailed analysis of the L364A and M368A mutations revealed that they not only affected Gag multimerization, but also Gag-membrane association. We propose that the latter defect is a result of the former. Interestedly, the membrane binding defect associated with M368A can be corrected either by changing NC to the leucine zipper (LZ) motif derived from the yeast transcription factor GCN4 or by a L364A second-site mutation, although neither of them restored wild-type levels of particle production to the M368A Gag. These results suggest that SP1 may affect events of virus assembly subsequent to Gag-membrane binding such as capsid morphogenesis or virus budding. We also studied the R362A mutation that is located within a short 359-HKAR-362 basic fragment. Results of RNase protection assay, native Northern blots as well as filter-binding assays showing reduced packaging of viral RNA into the R362A mutated viruses. These data reveal the function of the C-terminal disordered sequence of CA in HIV-1 RNA packaging. Further analysis of the BIV CA/NC spacer region demonstrated the key role of this region in BIV Gag assembly. In summary, our results demonstrate that the SP1 sequence regulates Gag multimerization, Gag-membrane binding as well as viral RNA packaging.