Orientador: Vadim Viviani / Banca: Márcia Regina Brochetto Braga / Banca: Jonas Contiero / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Banca: Leonardo Fernandes Fraceto / Resumo: Neste trabalho foi feita a expressão e purificação das luciferases recombinantes do elaterídeo Pyrearinus termitilluminans e dos fengodídeos Phrixotrix hirtus e Phrixotrix viviani, e a determinação e comparação de suas propriedades físico-químicas. Estimamos os Kms para luciferina e ATP, as constantes catalíticas, pH ótimo e outros dados cinéticos nas três luciferases. Através do uso de sondas fluorescentes, fizemos uma inspeção da polaridade dos sítios de ligação da luciferina. Além disso, foi feita a modelagem molecular para complementar os estudos experimentais e identificar os resíduos do sítio-ativo que afetam a polaridade e os espectros de bioluminescência nestas luciferases. Os dados sugerem que a luciferase de Pyrearinus termitilluminans tem o sítio ativo mais hidrofóbico entre as luciferases estudadas e a luciferase de Phrixotrix hirtus o mais polar. Estes dados suportam a importância da polaridade e polarizabilidade orientada na determinação dos espectros de bioluminescência. Além disto, os resultados de termoestabilidade e cinética de luminescência da luciferase de Pyrearinus termitilluminans sugerem que esta enzima seja particularmente apropriada para aplicações de bioimageamento. / Abstract: In this work, purification and comparative physical-chemical characterization of the recombinant luciferases from the elaterid Pyrearinus termitilluminans and from the phengodids Phrixotrix hirtus and Phrixotrix viviani was performed. The Kms for luciferin and ATP, the Kcat, optimum pH and other kinetics data were estimated in the three luciferases. Through fluorescent probes, we assessed the active-site polarity. Furthermore, molecular modeling was performed in order to support the experimental studies and suggest putative active site residues that could be responsible for changes of polarity. These data suggest that the luciferin binding site is more hydrophobic for Pyrearinus luciferase than in the other luciferases studied and support the polarity hypothesis as a mechanism for modulation of bioluminescence colors. / Doutor

Orientador: Vadim R. Viviani / Banca: Marcia Regina Brochetto Braga / Banca: Mauricio Bacci Junior / Banca: Etelvino José Henriques Bechara / Banca: Cleide Costa / Resumo: A partir dos coleópteros luminescentes, mais de 20 luciferases já foram clonadas e seqüenciadas. Dessas, a maioria é de lampirídeos das regiões Neártica e Paleártica, quatro de elaterídeos jamaicanos e uma de um fengodídeo asiático. Apenas outras cinco são oriundas da América do Sul, o continente mais rico em espécies de coleópteros luminescentes e o provável berço evolutivo de Lampyridae, a família com maior número de coleópteros luminescentes. Espécies desta região apresentam a maior variedade de cores de bioluminescência. No presente trabalho clonamos e seqüenciamos luciferases dos gêneros Brasilocerus sp., Phrixothrix sp. e Taximastinocerus sp., da família Phengodidae. Com base na análise filogenética dessas luciferases e outras já publicadas, concluímos que as luciferases das lanternas laterais e cefálicas são codificadas por genes parálogos, e propusemos um modelo para a evolução das cores da bioluminescência nessa família. Também determinamos o genoma mitocondrial de Pyrophorus divergens, membro da família Elateridae. A partir desse genoma e outros já publicados, analisamos a evolução da bioluminescência na superfamília Elateroidea sensu Lawrence e Newton (1995) e concluímos que essa pode ter surgido três vezes independentemente nesse grupo. / Abstract: From luminescent Coleopteran's, more than 20 luciferases have already been cloned and sequenced. Among them, most part is from lampyrids of Neartic and Paleartic regions, four are from Jamaican elaterids and one is from Asiatic phengodids. Just five are from South American species, the richest continent in luminescent Coleopteran's and, probably, the evolutionary cradle of Lampyridae. Species from this region display the greatest range of bioluminescence colors. At the present work, we cloned and sequenced luciferases from the genera Brasilocerus sp., Phrixothrix sp. and Taximastinocerus sp., from Phengodidae family. Based on the phylogenetic analysis of these genes and other already published, we concluded that head and lateral lantern luciferases are coded by paralogous genes, and we also proposed a model for bioluminescence color evolution in this family. We also sequenced the mitochondrial genome of Pyrophorus divergens, an Elateridae member. Based on this genome and other already published, we analysed the evolutionary history of bioluminescence in Elateroidea superfamily sensu Lawrence e Newton (1995) and concluded that it could have appeared three times independently in this group. / Doutor

Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Lucilaine Ferrazoli / Banca: Carmo Elias Andrade Melles / Banca: Wagner Vilegas / Banca: Antonio Carlos Massabini / Resumo: O aumento de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes às drogas utilizadas no esquema de tratamento convencional, principalmente por falha terapêutica, têm levado os pesquisadores à busca de novas drogas. Entretanto, faz-se necessário desenvolver novas metodologias para a determinação da atividade bactericida destes compostos. Este estudo descreve a padronização de uma metodologia rápida para triagem de atividade intra e extracelular de novos compostos, empregando Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 e Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801, ambas contendo o plasmídio pSMT1 com o gene luxA e luxB proveniente do Vibrio harveyi. A rifampicina e a isoniazida foram empregadas como droga de referência na padronização da técnica da luciferase extracelular, obtendo-se resultados de Concentração Inibitória Mínima de 0,03 μg/mL, para ambas as drogas, valores estes compatíveis com os da técnica de Alamar Blue. Para a padronização da técnica da luciferase intracelular foi utilizado o M. tuberculosis Erdman ATCC 35801 contendo o plasmídio pSMT internalizado em células de macrófagos J774. A droga de referência empregada foi a rifampicina obtendo-se um...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There has been an increase of Mycobacterium tuberculosis strains that are resistant to the current anti-TB agents, mainly through acquired resistance by therapeutic failure. This fact has underscored the need of a quick development of antimycobacterial drugs that are more effective than those currently in use. Moreover, new methodologies to determine the bactericidal activity of these compounds have been proposed. This study describes the use of bioluminescent strains of Mycobacterium tuberculosis H37Rv - ATCC 27974 and Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801 both containing the plasmid pSMT1 constructed with luxA and luxB genes from Vibrio harveyi in a screening to evaluate the antimycobacterial activities of anti-TB agents. Standardization of the technique was performed using isoniazid and rifampicin, as drugs standard. The results of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) were 0.03 μg/mL and 0.03 μg/mL, respectively. These values were totally compatible with those obtained by Microplate Alamar Blue Assay (MABA). Standardization of bioluminescence measurements of intracellular antimycobacterial activity was performed using the J774 murine...(Complete abstract, click electronic access below) / Doutor