Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2007.

Augsburg, Univ., Diss., 2009.

Techn. Hochsch., Diss., 2004--Aachen.

Guanosine tetraphosphate (ppGpp) is a bacterial signaling molecule involved in activating the stringent response, a cellular reaction to environmental stress that downregulates cell division and metabolism processes to conserve nutrients. The stringent response is implicated in some instances of antibiotic resistance, so broadening the current understanding of ppGpp signaling is useful. This experiment seeks to generate a ppGpp biosensor that will bind ppGpp and emit fluorescent light in its presence which will allow for improved research into the pathways and functions of the signaling molecule. To generate a novel ppGpp biosensor, I converted a biosensor previously used to detect cyclic di-GMP (a different signaling molecule) to contain a binding site transformed to now bind specifically with ppGpp. The genetic sequence for the cyclic di-GMP binding site was replaced with the ppGpp hydrolase domain which has a specific affinity for ppGpp; however, hydrolase activity would provide unwanted breakdown of the ppGpp, so it is mutated further to neutralize hydrolase activity. The desired outcome of this experiment results in a biosensor with an active site that has a specific and sufficient binding affinity for the ppGpp molecule. This sensor is designed to have the active site (ppGpp binding site) flanked by two fluorescent proteins that will interact more closely and transfer fluorescent light. When the first fluorescent protein is activated and the second fluorescent protein is in close proximity, emitted light can be transferred to the second. Binding of ppGpp will cause a conformational shift in the biosensor’s structure, causing the two fluorescent proteins to move further apart. This results in them losing the ability to transfer the fluorescent energy between fluorescent proteins. Using a fluorescent microscope or fluorescent plate reader, I will be able to determine the level of transferred fluorescent energy, and in turn measure the amount of ppGpp in the sample. Having generated the biosensor, I must now determine the ppGpp detection level, intensity of change in fluorescent transfer upon ppGpp binding, and the binding affinity for other nucleotides that might give me an incorrect signal. Using this, we can determine how ppGpp levels are regulated in bacteria under conditions of stress.

Green fluorescent protein (GFP) fusion tags are commonly used to study protein expression and cellular localization in vivo. But, GFP must undergo an autogenic post-translational modification, known as chromophore maturation, to become fluorescent, a process that can have a half-time longer than 30 minutes inside research model organisms. The timescale of chromophore maturation in GFP is thus slower than many key biological processes, limiting its usefulness in measuring those processes. In this thesis, we discuss the creation and engineering of a sensor for transiently expressed proteins (STEP) based on a fully matured but dim GFP. Upon specific binding of STEPtag, a small (15.5 kDa) protein to the sensor, full fluorescence is restored. Thus, by genetically fusing STEPtag to a protein of interest, it can be detected as soon as folding is complete, without any maturation delay. Through a combination of rational design and targeted directed evolution, we describe the improvement of the original sensor, gSTEP0, into an optimized version, gSTEP1. The sensor has been validated in vitro and in E. coli cells, and we have found that for gSTEP1, the fluorescence signal increases more than three-fold upon binding, with a Kd of 120 ± 30 nM and a kon of 1.7 x 105 M-1s-1, allowing detection of the protein of interest on the second timescale. We have also created a yellow version of the biosensor, and provide preliminary attempts at developing orthogonal binding pairs, as well as red- and cyan-coloured STEPs, which could eventually be used in multiplex experiments. Our biosensor opens the door to the study of short-timescale processes in research model organisms, such as Drosophila and zebrafish embryogenesis, as well as in host-pathogen interactions, which we are currently investigating.

Early detection is crucial in delivering timely treatment and improving patient outcomes. Point-of-care (POC) biosensors play an essential role in early detection, allowing for rapid and accurate diagnosis of diseases at the patient’s bedside without the need for expensive equipment or specialized personnel. By performing the analysis on-site, POC diagnostics can offer continuous monitoring and real-time data acquisition of a patient's health status. Thus, there is strong incentive in creating POC biosensors to provide healthcare professionals with greater access to diagnostic information, ultimately improving outcomes and reducing healthcare costs. Herein, the development of a POC lab-in-a-tube biosensor that utilizes simple and scalable fabrication techniques is presented. Electrodes are patterned on low-cost plastic substrates, which can be subsequently rolled and heat-shrunk into miniaturized tubing for flow-through analysis of liquid samples. Heat-shrinking of the device results in 3-dimensional, hierarchically wrinkled electrodes with morphological feature that span several orders of magnitude in size. These wrinkled electrodes demonstrate dramatically increased surface area in a given footprint compared to traditional planar electrodes. Incorporation of modified gold and silver wires allows for sensitive and stable electrochemical detection, enabling fast and quantitative results. These devices are capable of millilitre-per-minute flow rates to allow for rapid sample processing and for increased mass-transport to the electrode surface. The ability to capture analytes was characterized with nucleic acid sequences using pump-driven and blood-collection tube induced flow for rapid and accurate detection. Overall, this work demonstrates the successful development of an electrochemical platform integrated into a plastic tubing capable of rapid detection of flowing analytes. With its ease-of-use and compatibility with a wide range of flow rates, the device has the potential to be incorporated with existing medical tubing and procedures to achieve POC diagnostics. / Thesis / Master of Applied Science (MASc) / Early detection is critical for timely treatment and better patient outcomes. Point-of-care (POC) biosensors allow for disease diagnosis and real-time monitoring of a patient's health status directly at the patient's bedside without the need for expensive equipment or specialized personnel. A lab-in-a-tube biosensor was developed using sensing surfaces on low-cost plastic that is rolled and heat-shrunk into miniaturized tubing for analysis of liquid samples. The wrinkled sensing surface that results from heat-shrinking dramatically increase surface area and interaction with the sample, enabling sensitive detection that is fast and quantitative. These devices are capable of capturing samples at high flow rates, allowing for rapid analysis of large samples. Overall, this work demonstrates the successful creation of a biosensor platform that could be incorporated with existing medical tubing for POC diagnostics.

Ti3C2Tx MXene has gained significant attention for biosensor and supercapacitor applications because of 1) its metallic conductivity, large surface area, and reversible surface redox reactions led to high pseudocapacitance and high-rate performance; 2) the unique 2D morphology and high biocompatibility drive great motivation to design advanced nanohybrid systems with bio-receptors; 3) the high density of surface functional groups offers improved biomolecule loading and flexibility for further functionalization. In this thesis, biosensors and electrochemical energy storage devices based on Ti3C2Tx MXene are proposed. Specifically, Ti3C2Tx nanosheets were uniformly functionalized with aminosilane to provide a covalent binding for the immobilized bio-receptor (anti-CEA) for label-free ultrasensitive detection of cancer biomarker (CEA). [Ru(NH3)6]3+ is discovered as the preferable redox probe for biosensing. The fabricated MXene-based sensor exhibits a more comprehensive linear detection range and high sensitivity. Further, Ti3C2Tx nanosheets were introduced as the transducer, and Ti3C2Tx /Prussian blue (Ti3C2Tx/PB) composite was synthesized for sensitive detection of hydrogen peroxide. Meanwhile, a one-step patterning process for highly conductive nitrogen-doped laser-scribed graphene (N-LSG) has been developed. Working electrodes (Ti3C2Tx/PB/N-LSG) were extended by using different enzymes for corresponding biomarker detection, namely glucose, lactate, and alcohol. The enzyme/Ti3C2Tx/PB/N-LSG electrodes exhibit significantly improved electrocatalytic activity and outperform previously reported on-chip graphene-based biosensors. Further, a stretchable, wearable, and multifunctional Ti3C2Tx-based biosensor were designed for durable and sensitive detection of biomarkers in sweat. A unique modular design enabled a simple exchange of the specific sensing electrode to target the desired analytes, while an implemented three-phase interface design for the constant supply of oxygen led to superior sensor performance and stability. As expected, during in-vitro perspiration monitoring of human subjects, the physiochemistry signals (glucose and lactate level) could be measured simultaneously with high sensitivity and good repeatability, outperforming traditional reported graphene/PB- and CNTs/PB-based biosensors. Finally, we developed an in-plane hybrid microsupercapacitor, employing battery-type CuFe-Prussian blue analog (CuFe-PBA) as the positive electrode and pseudocapacitive Ti3C2Tx as the negative electrode. Due to the excellent match of the two types of high-rate performance materials in proton-based electrolyte, the designed on-chip device achieved excellent electrochemical performance.

Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology. / Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen.

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Submitted by RAPHAEL MAZZINE BARBOSA DE OLIVEIRA (mazzine.r@gmail.com) on 2018-08-31T12:54:04Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_RMAZZINE.pdf: 2481284 bytes, checksum: e17b453dc770c4f6b899c9c0a5de342a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-09-05T12:38:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_rmb_me_araiq_int.pdf: 2195098 bytes, checksum: 013fbe713d5edbed6ff4d629e660b906 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-05T12:38:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_rmb_me_araiq_int.pdf: 2195098 bytes, checksum: 013fbe713d5edbed6ff4d629e660b906 (MD5) Previous issue date: 2018-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Desde a primeira descrição de biossensor reportada por Clark e Lyons em 1962, houve um extenso trabalho no desenvolvimento e aprimoramento de novas técnicas de biossensoriamento para detecção de biomarcadores com relevância médica. Destaca-se nesse processo o estudo de superfície de eletrodos, pois esse influencia diretamente em aspectos como; sensibilidade, estabilidade e qualidade do sinal. Portanto, este projeto consiste em avaliar comparativamente três superfícies de eletrodos baseadas em nanoestruturas contendo nanopartículas de azul da Prússia, funcionando com sonda redox do sistema, e materiais carbonáceos (como óxido de grafeno e nanotubos de carbono) para aplicação em biossensores. Foram avaliados aspectos como composição, características capacitivas redox e estabilidade de sinal. A técnica de análise utilizada é a espectroscopia de capacitância eletroquímica (ECE) que apresenta vantagens como não usar amplificadores de sinal (sondas redox) em solução, configuração esta, importante para métodos de diagnóstico point-of-care. Das superfícies analisadas, a composta por nanopartículas de azul da Prússia e óxido de grafeno (PBNP+GO) apresentou os melhores parâmetros de estabilidade e compatibilidade com os aspectos teóricos da técnica de ECE, sendo então selecionada para realização de testes de biossensoriamento que, através da funcionalização da superfície com anticorpos Anti-IL-6, detectaram seletivamente a presença do biomarcador IL-6. / Since the first description of biosensor reported by Clark and Lyons in 1962, numerous works related to the development and enhancement of novel medical biosensing techniques have been published. In that context, it must be highlighted the study of electrode surfaces as it has direct influence in aspects like; sensitivity, stability and signal quality. Therefore, this project aims to evaluate three electrode surfaces based on nanostructures with Prussian blue nanoparticles, as redox probe, and carbonaceous materials (like graphene oxide and carbon nanotubes) and their application in biosensors. It was evaluated aspects like composition, redox capacitive characteristics and signal stability. The electrochemical capacitance spectroscopy technique (ECE) was used as it offers several advantages like no need of signal amplifiers (redox probes) in solution and, then, making this technique more adequate for point-of-care diagnosis. Among the analysed surfaces, the one composed by Prussian blue nanoparticles and graphene oxide (PBNP+GO) was identified as the best surface in terms of stability and compatibility to the theoretical aspects of ECE. Therefore, that structure was selected to further biosensing essays, by functionalizing the surface with Anti-IL-6 antibodies, that indicated the selective detection of the IL-6 biomarker. / 1583843