Resumo: A caracterização da estrutura genética de populações clonais de patógenos bacterianos tem sido feita, entre outros métodos, por "Southern blot" empregando-se como sondas seqüências de inserção ou genes avr. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de DNA baseadas em genes de patogenicidade para estudo da diversidade genética de isolados de Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii e Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. Observou-se a presença dos genes avrXacE1, avrXacE2 e lrp em todos isolados das subsp. citri e aurantifolii e a ausência do gene avrXacE2 no isolado da subsp. citrumelonis. Os perfis de restrição gerados por PCR-RFLP não revelaram polimorfismo nos genes amplificados e o uso de genes avr como sondas para "Southern blot" mostrou-se efetiva na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros e na identificação de relativo polimorfismo entre isolados da mesma espécie. A diversidade haplotípica foi maior com o gene avrXacE1. Com exceção à sonda correspondente ao gene lrp, o número de haplótipos identificados (17) variou de acordo com a endonuclease utilizada em "Southern blot". Os isolados da subsp. citri apresentaram um maior número de cópias dos genes avr em comparação com isolados das subsp. aurantifolii e citrumelonis. O estado de São Paulo, que adota uma campanha de erradicação do cancro cítrico, apresentou a menor diversidade haplotípica, provavelmente em decorrência do curto período em que o patógeno interage com o hospedeiro. / Abstract: The genetic structure of clonal populations of bacterial pathogens has been characterized, among other methods, by Southern blot using insertion sequences or avr genes as probes. The present work aimed the development of DNA primers and probes based on pathogenicity genes to study the genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis strains. The presence of avrXacE1, avrXacE2 and leucine rich protein (lrp) genes was observed in all citri and aurantifolii strains, as well as the absence of the avrXacE2 gene in citrumelonis isolate. The restriction profiles generated by PCR-RFLP did not show polymorphism in the amplified genes and the use of avr genes as Southern blot probes showed to be effective to differentiate Xanthomonas species pathogenic to citrus and to identify a relative polymorphism between strains belonging to the same species. The haplotype diversity was higher with the avrXacE1 gene. Excepting the probe corresponding to lrp gene, the number of haplotypes identified (17) varied according to the endonuclease used on Southern blot. The strains of the citri species presented a higher number of copies of the avr genes compared to aurantifolii and citrumelonis. The state of São Paulo, that adopts a campaign of eradication of the citrus canker, presented the smaller haplotype diversity, probably as result of the short period where the pathogen interacts with the host. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: João Martins Pizauro Junior / Banca:Julio Cezar Franco de Oliveira / Mestre

Orientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Caris Maroni Nunes / Banca: Maria Conceição Zocoller Seno / Resumo: Toxocara vitulorum é um parasita nematódeo de alta freqüência no trato intestinal de búfalos, particularmente em bezerros búfalos de um a três meses de idade. Devido à sua alta morbidade e mortalidade, causa consideráveis prejuízos a bubalinocultura. A pesquisa objetivou a obtenção de antígenos de extrato larval solúvel bruto (Ex), do material excretor-secretor (ES) de larvas infectantes e do líquido perientérico (Pe) de adultos de T. vitulorum, bem como a separação das frações protéicas na mistura pelo SDS-PAGE, seguida da análise imunológica por "Western blot" (WB), utilizando-se soros imunes e colostros de búfalos naturalmente infectados com T. vitulorum além de camundongos imunes. O acompanhamento do quadro parasitário dos bezerros búfalos também foi realizado. Pôde-se verificar que os três antígenos, Pe, Ex e ES, apresentaram mobilidades eletroforéticas pelo SDS-PAGE revelando nove (11,5, 14,2, 31, 38, 58, 76, 88, 112 e 165 KDa), onze (11,2, 13,3, 16,5, 22, 25, 32, 43, 53, 68, 82 e 96 KDa) e oito (19, 48, 56, 64, 90, 110, 150 e 190 KDa) bandas protéicas, respectivamente. A maioria dessas frações separadas pela eletroforese, foi reconhecida por todos as amostras de soros e pelo colostro, quando analisada pelo WB. No entanto, somente as bandas de alto peso molecular (68 - 190 KDa) persistiram nos grupos de bezerros búfalos que se encontravam no pico, declínio ou expulsão e na ausência ou autocura, à exceção do antígeno ES, que desapareceu durante o processo de autocura. Já os soros de bezerros búfalos com um de vida, que mamaram o colostro e os daqueles que se encontravam em fase de aparecimento ou ascensão, revelaram com as mesmas frações detectadas no soro e no colostro das búfalas. Os três antígenos reagiram de forma cruzada entre si, quando foram testados com soros homólogos e heterólogos de camundongos imunizados experimentalmente com estes antígenos de T. vitulorum / Abstract: Toxocara vitulorum is a nematode parasite of small intestine of cattle and water buffaloes particularly buffalo calves with one to three months of age, causing high morbidity and mortality. The purpose of this research was the antigen obtaintion and characterization of crude soluble larval extract (Ex), excretory-secretory (ES) of infective larvae, and perienteric fluid (Pe) from adults of T. vitulorum, as well as the separation of protein fractions from the antigenic mixture by SDS-PAGE and analysis of each band by Western blot (WB), using immune sera and colostrum of buffaloes naturally infected by T. vitulorum, and mice experimentally immunized. The parasitological status of the buffalo calves was also evaluated using sequentially coprological examinations. The results showed that three antigens, Pe, Ex and ES, revealed nine (11,5, 14,2, 31, 38, 58, 76, 88, 112, and 165 KDa), eleven (11,2, 13,3, 16,5, 22, 25, 32, 43, 53, 68, 82, and 96 KDa) and eight (19, 48, 56, 64, 90, 110, 150, and 190 KDa) protein bands by SDS-PAGE, respectively. The majority of these isolated bands were recognized by sera and colostrum of all groups of infected animals (buffalo cows one day post parturition and buffalo calves in five different periods of T. vitulorum infection) analyzed by WB. However, only the fractions of high molecular weight (68 - 190 KDa) persisted in the groups of buffalo calves at maximum peak of infection, expulsion and post-expulsion of the parasite or self-cure process, excepting ES antigen, that was not detected during the self-cure process. Sera of buffalo calves at one day of age, after suckling the colostrum and at the beginning of infection reacted with the same bands detected by serum and colostrum of the buffalo cows. The three antigens showed crossed reaction among themselves, when they were tested with homologous and heterologous sera of mice experimentally immunized with them / Mestre

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Renata Fuganti Pagliarini / Banca: Francismar Corrêa Marcelino / Banca: Sonia Marli Zingaretti / Resumo: No cenário atual de mudanças climáticas, com o aumento da população mundial e crescente demanda por alimentos, as ferramentas biotecnológicas veem sendo utilizadas na obtenção de plantas mais tolerantes a estresse ambientais como a seca, que provoca perdas financeiras e de produção significativas aos produtores. Os fatores de transcrição, são genes potenciais na estratégia de reduzir os prejuízos decorrentes de períodos de déficit hídrico, pois atuam controlando a expressão de genes estresse-induzidos e têm sido estudados na planta modelo Arabidopsis thaliana e em culturas de interesse agronômico. O fator de transcrição AtAREB1ΔQT, consiste na forma constitutivamente ativa de AREB1, (ABA Responsive Element Binding - elemento de ligação de resposta ao ABA) que está envolvido, na via de sinalização ABA (ácido abcísico) dependente de resposta ao estresse hídrico em plantas. O objetivo do presente trabalho foi introduzir em soja, via biobalística, a construção gênica pBI35SΩ:AtAREB1ΔQT e caracterizar molecularmente os eventos quanto ao número de cópias inseridas, e análise da expressão gênica do transgene. Para a caracterização molecular, foram utilizadas as metodologias de Southern blot e RT-qPCR. Um total de 12 linhagens independentes foram obtidas na geração T0, com uma eficiência de transformação de 0,59%. Somente três eventos (2651, 2639 e 2654) segregaram e passaram o gene para a geração T1. O número de cópias do transgene quantificado via qPCR, foi diferente, para cada linhagem geneticamente modificada (GM) analisada, variando de poucas cópias (1 a 2) a várias (17 cópias). Estes dados foram corroborados pelos resultados obtidos via Southern blot. O nível de expressão gênica relativa do transgene foi variável entre os eventos e a análise da segregação em plantas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the actual scenario of climatic changes, with world population increase and growing food demand, biotechnological tools are being used to develop plants more tolerant to environmental stresses such as drought, which causes to producers, significant financial losses and yield production. The transcription factors are potential genes to be strategically used to reduce damage due to water deficit conditions, because they acts controlling the expression of numerous stress-induced genes and has been studied in the model plant Arabidopsis thaliana as well as in agronomic crops. The transcription factor, AtAREB1ΔQT, consists in the constitutively active form of AREB1, (ABA Responsive Element Binding) that is involved, ABA signaling pathway (abscisic acid) dependent response pathway to drought in plants. The objective of this study was to insert the construction pBI35SΩ: AtAREB1ΔQT in soybean, via biolistics, and molecularly characterization of the events on the number of inserted copies, and analyze the relative expression level of transgene. Twelve independent lines were identified in T0 generation, with a transformation efficiency of 0.59%. Only three events (2651, 2639 and 2654) segregated and transmitted the gene for T1 generation. The number of copies quantified using qPCR was different for each modified genetically (GM) line, ranging from a few copies (1 to 2 copies) to many copies (17 copies). These data were corroborated by Southern blot results. The relative expression level of transgene was variable between events and segregation analysis in T2 generation showed that he transgene did not follow the Mendelian laws. Aiming to obtain more information on the effect of the transgene in response to water stress... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre