Hintergrund: Die Anzahl von Knochenfrakturen im Zusammenhang mit Traumata, sowie osteoporosebedingten Fragilitätsfrakturen oder auch Knochendefekten in Folge von Tumorresektionen steigt stetig an. Die Nutzung autologen, aber auch allogenen und xenogenen Spendermaterials ist limitiert. Eine vielversprechende Alternative sind Knochenkonstrukte, die über einen Tissue Engineering-Ansatz hergestellt werden. Dabei werden resorbierbare Biomaterialien mit biologisch aktiven Substanzen wie Wachstumsfaktoren oder Zellen kombiniert. Diese funktionalisierten Konstrukte regen nach einer Implantation in den Patienten die gesunde Knochensubstanz zur Heilung an und resorbieren idealerweise zugunsten des nachwachsenden, natürlichen Knochens. Eine neuartige Form des Tissue Engineerings ist der 3D-Biodruck („Bioprinting“), bei dem biologisch aktive Proteine und/oder Zellen mit Biomaterialien vermischt werden und anschließend durch ein additives Fertigungsverfahren zu Konstrukten verarbeitet werden. Dies hat einige Vorteile: Z.B. die Fertigung eines patientenspezifischen Konstrukts, welches direkt an den Defekt angepasst ist, aber auch eine gute Einstellbarkeit der Porosität des finalen Konstrukts, was vorteilhaft für die Nährstoffversorgung und Vaskularisierung sein kann. Vor allem erlaubt es eine ortsaufgelöste Verteilung, wodurch beispielsweise Zellen in einem Konstrukt so positioniert werden können, dass diese zu einem gewebeähnlichen Knochenkonstrukt reifen können. Fragestellung: Im letzten Jahrzehnt wurden einige technologische Fragestellungen im Bereich des Bioprintings gelöst. Für das Knochen-Tissue Engineering sind bisher allerdings nur wenige Ansätze präsentiert wurden. Dies liegt unter anderem daran, dass im Bioprinting vor allem Hydrogele verarbeitet werden. Diese sind allerdings sowohl chemisch, als auch mechanisch weit von natürlichem Knochengewebe entfernt und daher weniger als Knochenersatz geeignet. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob (Bio-)printing eine für Knochen-Tissue Engineering-Strategien geeignete Methode ist. Dazu wurden zwei vielversprechende Ansätze verfolgt: (I) Mehrphasendruck von bioaktiven Calciumphosphatzementen in Kombination mit Zellen oder mit Wachstumsfaktoren funktionalisierten, biologisch aktiven Hydrogelen. (II) Entwicklung einer neuen Bioink, indem ein wachstumsfaktor- oder zellbeladenes Hydrogel mit einem bioaktiven Füllstoff geblendet wird. Die in der Doktorarbeit vorgestellten Studien sollen dabei insbesondere die Entwicklung dieser Ansätze darstellen, sowie deren Grenzen aufzeigen. Zusätzlich sollen grundlegende mechanische und biologische Eigenschaften der biogedruckten Knochenkonstrukte untersucht werden. Materialien und Methoden: Eine Technologie, die das Prinzip des Bioprintings ermöglicht, ist das sogenannte 3D-Plotten. Mit Hilfe eines Multikanal-Plotters können mehrphasige Konstrukte (Ansatz I), aber natürlich auch einphasige Konstrukte (Ansatz II) hergestellt werden. Für Ansatz I wurde ein klinisch zugelassener Calciumphosphatzement (CPC) als bioaktive Komponente verwendet. Für Ansatz II wurde ein bisher noch wenig erforschtes Nanomaterial namens Laponit verwendet, welches großes Potential für das Tissue Engineering besitzt. Die Biopoylmere Alginat und Methylcellulose bildeten die Grundlage für plottbare, wachstumsfaktor- und zellbeladene Pasten (Biomaterial-inks bzw. Bioinks). Zur Entwicklung einer spezifischen Bioink wurde humanes gefrorenes Frischplasma verwendet. Die rheologischen Eigenschaften neu entwickelter Biomaterial-inks und Bioinks, sowie die mechanischen Eigenschaften der geplotteten Hydrogele wurden charakterisiert. Weitere Untersuchungen schlossen die Quellung der Hydrogele und die Porosität der Konstrukte ein. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Formgenauigkeit der geplotteten Strukturen gelegt. Entsprechend der Untersuchungsansätze wurden verschiedene Zelltypen verwendet, insbesondere mesenchymale Stammzellen (MSC), die direkt mit der Paste verdruckt wurden. Als Modellwachstumsfaktor diente der angiogene vascular endothelial growth factor (VEGF). Dessen Freisetzung aus geplotteten Scaffolds wurde mittels ELISA überprüft; die biologische Aktivität wurde anhand des Wachstums von humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) untersucht. Ergebnisse: Zunächst wurde untersucht, ob Multikanal-Plotten geeignet ist, um CPC-Konstrukte patientenindividuell zu fertigen. Dies wurde mit Hilfe einer auflösbaren Methylcellulosepaste erreicht. Dieses Verfahren erlaubte die Herstellung von inneren Kavitäten, die mit anderen Herstellungsverfahren nicht möglich gewesen wären. Darüber hinaus konnte aus einem CT-Scan einer Hand ein Kahnbein extrahiert und virtuell modelliert werden, welches mit hoher Formgenauigkeit geplottet werden konnte. Es wurde gezeigt, dass dies auch auf biphasige Konstrukte aus CPC und einer Bioink anwendbar ist. Dies wurde durch die Entwicklung und Verarbeitung von Bioinks ermöglicht. Biogedruckte Zellen können in vitro und in vivo spezifische biologische Effekte bewirken. Dazu wurden innerhalb der Arbeit zwei Bioinks als plottbare Zellträgermaterialien entwickelt. Eine Bioink enthielt das Nanomaterial Laponit (Ansatz II), welches bereits in anderen Studien vorteilhafte Effekte für Knochen-Tissue Engineering-Ansätze gezeigt hat. Die neuentwickelte Laponit-haltige Bioink erlaubte die Fabrikation von Konstrukten mit hoher Formgenauigkeit. Darüber hinaus war die Zellviabilität, sowie die Zelldichteentwicklung erhöht im Vergleich zu einer Laponit-freien Kontrolle. Da Laponit eine heterogene Ladungsverteilung aufweist, wurde überprüft, inwieweit es ein geeignetes Freisetzungssystem für VEGF darstellt. Scaffolds, die aus einer VEGF-haltigen Paste hergestellt wurden, wiesen ein deutlich verändertes Freisetzungsprofil in Anwesenheit von Laponit auf, als Scaffolds ohne Laponit. So konnte eine initiale Freisetzung (Burstrelease) vermieden und gleichzeitig eine gleichmäßige Freisetzung beobachtet werden. VEGF war auch nach längerer Zeit im Scaffold noch biologisch aktiv. Die zweite Bioink wurde auf Basis gefrorenen, menschlichen Frischplasmas entwickelt. Blutplasma enthält Fibrinogen, das eine RGD-Sequenz für die Anheftung von MSC besitzt. Biogedruckte MSC, aber auch präosteoblastäre Zellen, zeigten eine hohe Neigung, sich in der Bioink aufzuspreizen, was für eingekapselte Zellen erschwert ist. Die plasmahaltige Bioink war dazu geeignet, zusammen mit CPC zu biphasigen Konstrukten (Ansatz I) verarbeitet zu werden. \par Dazu musste zunächst ein Postprozessierungsprotokoll für biphasige Konstrukte aus CPC und zellhaltigen Bioinks entwickelt werden. Aus vorherigen Studien ist bekannt, dass geplottete CPC-Konstrukte in wässrigen Lösungen Mikrorisse bilden, die die mechanischen Eigenschaften signifikant verschlechtern. Die Ausbildung der Mikrorisse kann durch eine Aushärtung in wasserdampfgesättigter Atmosphäre vermieden werden. In biphasigen Konstrukten mit Bioinks sollte diese Aushärtungsphase allerdings nur kurz sein, da eine lange Inkubation ohne wässrige Zellmedien zu einem Absterben der biogedruckten Zellen führen würde. Es konnte gezeigt werden, dass eine Inkubation für 20 min in wasserdampfgesättigter Atmosphäre ausreichend ist, um die Ausbildung von Mikrorissen im CPC zu vermeiden. Diese Zeitspanne konnte von den Zellen toleriert werden. In Kombination mit der plasmahaltigen Bioink wurde eine starke Proliferation und osteogene Reifung von biogedruckten präosteoblastären Vorläufern beobachtet. Schlussfolgerungen: In der vorliegenden Doktorarbeit wurde das Prinzip des extrusionsbasierten Biodrucks (3D-Plotten) verwendet, um biofunktionelle Konstrukte herzustellen. Dies erfolgte entweder durch die Beladung mit Wachstumsfaktoren oder mit Zellen vor der Fabrikation der Konstrukte. Bioaktive Materialien wurden entweder durch Multikanal-Plotten oder durch Supplementierung einer Bioink eingebracht. Beide Ansätze können prinzipiell sogar miteinander kombiniert werden. Die erzielten Ergebnisse belegen, dass Bioprinting eine geeignete Methode für das Knochen-Tissue Engineering darstellt. Patientenindividualisierte Konstrukte können mit dieser Technologie gefertigt werden. Auf diesen Ergebnissen aufbauend können weitere Untersuchungen in vivo die Wirksamkeit der vorgestellten Ansätze überprüfen und neue Therapieansätze für die Heilung von Knochendefekten entwickelt werden.:Abstract 9 Zusammenfassung 13 Index of Abbreviations 19 List of Figures 20 Preface 23 i generalis 1 introduction to the topic 29 1.1 Background 29 1.2 Terminology 29 1.3 Physiological Properties of Bone Tissue 31 1.3.1 Composition of Bone 31 1.3.2 Bone Cytology 33 1.3.3 Crosstalk 34 1.4 Bone Grafting 34 1.4.1 Biopolymers 35 1.4.2 Calcium Phosphates 38 1.4.3 Nanoclays 41 1.5 Additive Manufacturing in Medicine & Bioprinting 43 1.5.1 Additive Manufacturing in Tissue Engineering 43 1.5.2 Bioprinting Techniques 44 1.6 Bioinks & Biomaterial Inks 48 1.6.1 Rheology 48 1.6.2 Plottability & Shape Fidelity 49 1.6.3 Post-Processing 52 1.6.4 Biocompatiblity & Biodegradation 53 1.6.5 The Biofabrication Window 53 2 aim of the thesis 55 2.1 Preliminary Studies 55 2.2 Research Questions 57 ii specialis 3 A methylcellulose hydrogel as support for 3D plotting of complex shaped calcium phosphate scaffolds 61 4 Development of a clay based bioink for 3D cell printing for skeletal application 77 5 Bioprinting of mineralized constructs utilizing multichannel plotting of a self-setting calcium phosphate cement and a cell-laden bioink 97 6 A novel plasma-based bioink stimulates cell proliferation and differentiation in bioprinted, mineralized constructs 113 iii conclusio 7 Summary & Conclusion 133 7.1 Bioprinting of bone tissue constructs 133 7.2 Technological Improvements 134 7.3 Bioink Development 136 7.4 Limitations & Future Research Directions 138 Bibliography 140 Danke 155 Appendix Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 165 Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen 166 Auszug aus dem Journal Citation Report 166 Conferences 167 / Background: The number of trauma-related bone fractures, fragility fractures resulting from osteoporosis or bone defects after tumor resections is increasing. The usability of autologous, but also allogenous and xenogenous bone grafts is limited. Bone grafts being manufactured using a tissue engineering approach are a promising alternative. For this, resorbable biomaterials are combined with biological components such as cells and growth factors. These functionalized constructs stimulate the formation of novel bone tissue after implantation in the patient and resorb in favor of regrowing, native bone. A new form of tissue engineering is 3D bioprinting. Biologically active proteins and/or cells are mixed with biomaterials and get fabricated to constructs by a convenient additive manufacturing technology. This offers great advantages. For example, the patient-specific tissue engineered constructs can be manufactured fitting exactly to the respective defect. Further, it allows full control about the porosity of the final construct which is considered to be advantageous for nutrient supply and vascularization. Most crucial, it allows the spatial distribution of cells within the three-dimensional construct, which facilitate the maturation of the construct to the tissue-like graft. Research Questions: In the last decade some technological challenges in the field of bioprinting have been solved. Nevertheless, for bone tissue engineering only a small number of approaches had been developed. One of the reasons for this is that bioprinting technologies usually enable the processing of materials that are chemically and mechanically rather distant from the bone, particularly hydrogels. These materials are less suitable as bone substitutes. The aim of this work was to research new approaches of extrusion-based (bio-)printing for bone tissue engineering strategies. For this purpose two promising approaches were investigated: (I) Multichannel printing of bioactive calcium phosphate cements in combination with biologically active hydrogels which were loaded either with growth factors or cells. (II) Development of a new bioink by supplementation of growth factor- or cell-laden hydrogels with a bioactive filler material. The presented studies of this thesis demonstrate the feasibility of these approaches as well as their limits. In addition, fundamental mechanical and biological properties of the bioprinted bone constructs are investigated. Materials and Methods: A technology that makes the principle of bioprinting possible is the so-called 3D plotting. With the aid of a multichannel plotter, multiphasic constructs can be fabricated (approach I), but of course also monophasic constructs are possible (approach II). For approach I, a clinically certified calcium phosphate cement (CPC) was used as bioactive component. For approach II, a less investigated nanomaterial called Laponite was used which was shown before to hold great potential for tissue engineering applications. The biopolymers alginate and methylcellulose formed the basis for plottable, growth factor-laden (biomaterial inks) and cell-laden (bioinks) pastes. For the development of one specific bioink, human fresh frozen plasma was used. Rheological properties of the newly developed biomaterial inks and bioinks were characterized, additionally mechanical properties of plotted constructs were investigated. Further studies investigated the swelling of the hydrogels and the porosity of the constructs. Particular attention was payed to the shape fidelity of the plotted structures. Different cell types were used according to the aim of the subject of research; special attention was payed to the use of mesenchymal stem cells which were plotted directly in combination with the biomaterial, forming the bioink. The angiogenic vascular endothelial growth factor (VEGF) was used as model protein for release studies from bioprinted structures; its biological activity was investigated by proliferation studies of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Results Firstly, it was investigated whether multichannel plotting is a suitable technology for the fabrication of patient-specific CPC constructs. This was achieved by plotting of a fugitive methylcellulose support ink. This procedure allowed the manufacturing of inner cavities which would not have been possible with other scaffold fabrication methods. Moreover, it was possible to extract a scaphoid bone from a CT scan of a human hand which was modeled virtually and fabricated subsequently with high shape fidelity. Later it was demonstrated that this procedure can be adapted to biphasic constructs consisting of CPC and cell-laden hydrogels. This was achieved by developing and processing bioinks. Bioprinted cells can evoke biological effects in vitro and in vivo. For this purpose two bioinks were developed within this work acting as cell carrier materials. The first bioink contained the nano material Laponite (approach II) which has demonstrated positive effects for bone tissue engineering before. The novel Laponite-based bioink enabled the fabrication of constructs with high shape fidelity. Furthermore, cell viability and cell density were increased compared to a Laponite-free control. Since Laponite offers a heterogeneous charge distribution, it was investigated whether it is a suitable delivery system for VEGF. Scaffolds with Laponite demonstrated a distinct different release profile compared to Laponite-free scaffolds. Thus an initial burst-like release could be avoided and at the same time a uniform release could be observed. The released VEGF was biologically active also after longer time in the scaffold. The second bioink was developed using fresh frozen human blood plasma. Plasma contains fibrinogen which holds a RGD motif for the attachment of MSC. Bioprinted MSC and preosteoblastic cells showed a high affinity to spread within the bioink, which is difficult to achieve for encapsulated cells. The plasma-based bioink was suitable for the combined fabrication of biphasic constructs with CPC (approach I). To achieve this, firstly a suitable post-processing for biphasic constructs consisting of CPC and cell-laden bioinks had to be developed. From previous studies it is known that plotted CPC constructs form microcracks in aqueous media during setting, which impair mechanical properties. The formation of the microcracks can be avoided by setting in water-saturated atmosphere. In biphasic constructs with bioinks this phase should only be short since a long incubation in absence of aqueous cell culture media would lead to cell death within the bioink. It could be shown that incubation for 20 min in water-saturated atmosphere is convenient to avoid the formation of microcracks in CPC strands. This time could be tolerated by the cells. In combination with the plasma-based bioink, a strong proliferation and osteogenic maturation of bioprinted preosteoblastic cells could be observed. Conclusion: In this thesis, the principle of extrusion-based bioprinting (3D plotting) was used to fabricate biofunctionalized constructs. This was achieved by loading cells or growth factors before manufacturing of the constructs. Bioactive materials could be embedded into the constructs by either multichannel plotting or by supplementation of a bioink with a bioactive filler material. In principle both approaches even could be combined with each other. The results obtained prove that bioprinting is a suitable method for bone tissue engineering. Patient-specific constructs can be fabricated by this technology. Based on these results, further studies should be performed in vivo to investigate the potency of the approaches for the development of new regenerative therapies to treat bone defects.:Abstract 9 Zusammenfassung 13 Index of Abbreviations 19 List of Figures 20 Preface 23 i generalis 1 introduction to the topic 29 1.1 Background 29 1.2 Terminology 29 1.3 Physiological Properties of Bone Tissue 31 1.3.1 Composition of Bone 31 1.3.2 Bone Cytology 33 1.3.3 Crosstalk 34 1.4 Bone Grafting 34 1.4.1 Biopolymers 35 1.4.2 Calcium Phosphates 38 1.4.3 Nanoclays 41 1.5 Additive Manufacturing in Medicine & Bioprinting 43 1.5.1 Additive Manufacturing in Tissue Engineering 43 1.5.2 Bioprinting Techniques 44 1.6 Bioinks & Biomaterial Inks 48 1.6.1 Rheology 48 1.6.2 Plottability & Shape Fidelity 49 1.6.3 Post-Processing 52 1.6.4 Biocompatiblity & Biodegradation 53 1.6.5 The Biofabrication Window 53 2 aim of the thesis 55 2.1 Preliminary Studies 55 2.2 Research Questions 57 ii specialis 3 A methylcellulose hydrogel as support for 3D plotting of complex shaped calcium phosphate scaffolds 61 4 Development of a clay based bioink for 3D cell printing for skeletal application 77 5 Bioprinting of mineralized constructs utilizing multichannel plotting of a self-setting calcium phosphate cement and a cell-laden bioink 97 6 A novel plasma-based bioink stimulates cell proliferation and differentiation in bioprinted, mineralized constructs 113 iii conclusio 7 Summary & Conclusion 133 7.1 Bioprinting of bone tissue constructs 133 7.2 Technological Improvements 134 7.3 Bioink Development 136 7.4 Limitations & Future Research Directions 138 Bibliography 140 Danke 155 Appendix Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 165 Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen 166 Auszug aus dem Journal Citation Report 166 Conferences 167