Els brassinoesteroides són fitohormones que actuen com a reguladors del creixement vegetal. En aquest camp, davant dels elevats costos necessaris per obtenir-los resulta rellevant la síntesi de mimètics. En aquest treball s'ha desenvolupat una estratègia per transformar l'inhibidor dels brassinoesteroides, el KM-01, en una nova família d'anàlegs amb activitat brassinoesteroide. Per sintetitzar tres mimètics del KM-01, ha estat necessari posar a punt un mètode per a produir microbiològicament el producte de partida (PR toxina) a escala de grams i, definir mitjançant tècniques computacionals, entre les quals destaca la nova metodologia SHOP, l'estructura d'aquests mimètics del KM-01. Finalment, s'ha posat a punt un bioassaig per avaluar-ne l'activitat antiestrès. / Los brasinoesteroides son fitohormonas que actúan como reguladores del crecimiento vegetal. En este campo, delante de los elevados costes necesarios para obtenerlos resulta relevante la síntesis de miméticos. En este trabajo, se ha desarrollado una estrategia para transformar el único inhibidor conocido de los brasinoesteroides, el KM-01, en una nueva familia de análogos con actividad brasinoesteroide. Para sintetizar tres miméticos del KM-01 ha sido necesaria la puesta a punto de un método para producir microbiológicamente el producto de partida (PR toxina) a escala de gramos y, definir, mediante técnicas de química computacional entre las que destaca la nueva metodología SHOP, la estructura de estos miméticos del KM-01. Finalmente, se ha puesto a punto un bioensayo para evaluar su actividad antiestrés. / Brassinosteroids are fitohormones that act as growth plant regulators. However, the high costs to obtain them drives to the relevance of synthesizing brassinosteroid mimetics. In this work, it has been developed a strategy in order to transform the only known brassinosteroids inhibitor, KM-01, into a new family of analogues with brassinosteroid activity. The synthesis of three KM-01 mimetics has required the microbiologic production of the starting material (PR toxin) in gram quantities and, the structure definition of KM-01 analogues by computational methods (SHOP methodology). Finally, a new bioassay has been developed in order to evaluate their antistress activity.

Aquesta tesi és una continuació dels estudis iniciats en l'equip en el camp de les relacions estructura-activitat (SAR i QSAR) dels brassinoesteroides (BRs) mitjançant mètodes computacionals. L'objectiu general és centrar l'atenció en la cadena lateral, ja que la influència dels hidroxils depenia del tipus d'estudi (quantitatiu o qualitatiu) i la influència de l'extrem final de la cadena lateral era molt genèrica. El desenvolupament d'aquest objectiu principal ha portat a: 1. Estudiar les cadenes laterals d'anàlegs BRs androstànics: Basant-se en l'aproximació a l'anàleg actiu (AAA) prenent com a referència l'estructura de la brassinolida, s'ha vist que els anàlegs α-hidroxiester i α-aminoester són computacionalment bons candidats per presentar activitat brassinoesteroide. Un cop sintetitzats (en una tesi paral·lela), tres anàlegs amb la funcionalitat lliure han donat inactius mentre que quatre anàlegs amb la funcionalitat protegida han donat actius o moderadament actius. Basant-se novament en l'AAA, no ha estat possible explicar computacionalment i de forma inequívoca l'activitat i/o inactivitat d'aquests anàlegs. 2. Revisar i redefinir la conformació activa dels BRs: S'ha conclòs que la conformació activa in silico és l'anomenada HIP. Aquesta és la que explica amb més coherència la distribució tridimensional tan dels hidroxils com de l'extrem final de la cadena lateral de cara a explicar la unió de les cinc cadenes laterals tipus dels BRs amb el receptor. La raó per la qual s'han trobat diverses conformacions actives es troba en l'anàlisi conformacional dels BRs i no pas en els processos de selecció de la conformació activa. 3. Estudiar la influència de la conformació activa dels BRs sobre els models de QSAR: Conformacions actives estructuralment diferents han donat lloc a models quantitati-vament similars, però qualitativament diferents. Quantitativament similars perquè les parts dels BRs que correlacionen amb l'activitat són les mateixes. Qualitativament diferents perquè la contribució a l'activitat d'aquestes parts, especialment de cadena lateral, i la variació de la predictibilitat en funció de l'estructura són diferents en cada cas. Els models reduïts i el model HOMO han posat de manifest que no es pot extreure més informació dels models degut als desequilibris estructurals del conjunt de BRs que formen part del data set. El model a 1 μg/planta explica els requeriments estructurals que fan que un BR sigui actiu o inactiu. El model HIP explica els requeriments estructurals que determinen el grau d'activitat dels BRs actius. Fora de l'objectiu principal, però íntimament relacionat amb els estudis de QSAR s'ha volgut: 4. Determinar l'error experimental de la resposta i de les dades d'activitat: Comparant-los amb els errors dels models, s'observa que el model a 1 μg/planta està força ben ajustat i no té gaire marge de millora. En canvi, que el model HIP pot millorar considerablement sobretot en la predictibilitat, sempre i quan s'arreglin els desequilibris estructurals. D'altre banda, s'ha vist que els diferents tractaments estadístics realitzats en el bioassaig no afecten significativament al valor d'activitat. / Esta Tesis es una continuación de los estudios iniciados por el equipo en el campo de las relaciones estructura-actividad (SAR y QSAR) de los brasinoesteroides (BRs) mediante métodos computacionales. El objetivo general es centrar la atención en la cadena lateral, ya que la influencia de los hidroxilos dependía del tipo de estudio (cuantitativo o cualitativo) y la influencia del extremo final de la cadena lateral era muy genérica. El desarrollo de este objetivo principal ha llevado a: 1. Estudiar las cadenas laterales de los análogos BRs androstánicos: Basándose en la apro-ximación al análogo activo tomando como referencia la estructura de la brasinolida, se ha observado que los análogos α-hidroxiester i α-aminoester son computacionalmente buenos candidatos para presentar actividad brassinoesteroide. Una vez sintetizados (en una tesis paralela), tres análogos con la funcionalidad libre han resultado inactivos mientras que cuatro análogos con la funcionalidad protegida han resultado activos o moderadamente activos. Basándose nuevamente en la AAA, no ha sido posible explicar computacionalmente y de forma inequívoca la actividad o inactividad de estos análogos. 2. Revisar y redefinir la conformación activa de los BRs: Se ha llegado a la conclusión que la conformación activa in silico es la llamada HIP. Esta es la que explica con más coherencia la distribución tridimensional tanto de los hidroxilos como del extremo final de la cadena lateral a fin de explicar la unión de las cinco cadenas laterales tipo de los BRs con el receptor. La razón por la cual se han encontrado diversas conformaciones activas se encuentra en el análisis conformacional y no en los procesos de selección de la conformación activa. 3. Estudiar la influencia de la conformación activa de los BRs en los modelos de QSAR: Conformaciones activas estructuralmente diferentes han dado lugar a modelos cuantita-tivamente similares, pero cualitativamente diferentes. Cuantitativamente similares porque las partes de los BRs que correlacionan con la actividad son las mismas. Cualitativamente diferentes porque la contribución a la actividad de dichas partes, especialmente de la cadena lateral, y la variación de la predictibilidad en función de la estructura son diferentes en cada caso. Los modelos reducidos y el modelo HOMO han puesto de manifiesto que no se puede extraer más información de los modelos debido a los desequilibrios estructurales del conjunto de BRs que conforman el "data set". El modelo a 1 μg/planta explica los requisitos estructurales que hacen que un BR sea activo o inactivo. El modelo HIP explica los requisitos estructurales que determinan el grado de actividad de los BRs activos. Fuera del objetivo principal, pero íntimamente relacionado con los estudios de QSAR se ha querido: 4. Determinar el error experimental de la respuesta y de los datos de actividad: Compa-rándolos con los errores de los modelos, se observa que el modelo a 1 μg/planta está bastante bien ajustado y tiene poco margen de mejora. En cambio, el modelo HIP puede mejorar considerablemente sobretodo en la predictibilidad, siempre y cuando se solucionen los desequilibrios estructurales. Por otro lado, se ha observado que los diferentes tratamientos estadísticos realizados en el bioensayo no afectan significativamente al valor de actividad. / This Thesis is the continuation of the studies started by our laboratory in the field of brassinosteroids (BRs) structure activity relationships (SAR and QSAR) using computational methods. The main aim is to focus the study on the side chain, due to the influence of hydroxyl groups depends on the study (quantitative or qualitative) and the influence of the side chain end is very generic. The development of this goal has leaded to: 1. Study the side chain of androstanic BRs analogues: Based on active analogue approach (AAA) taking brassinolide as the reference structure, it has been shown that α-hydroxyester and α-aminoester analogues are computationally good candidates to elicit brassinosteroid activity. Once synthesized (in a parallel thesis), three analogues with free functionality have result inactive but four analogues with protected functionality have result active or mild active. Based once again on AAA it has not been possible explain computationally and unequivocally the activity and/or inactivity of these analogues. 2. Revise and redefine the active conformation of BRs: It has been concluded that in silico active conformation is the named as HIP. This explains more consistently the tridimensional distribution of both the hydroxyls and the end of the side chain in order to explain the union of the five side chain types with BRs receptor. The reason for having found several active conformations is in BRs conformational analysis not in the active conformation selection procedures. 3. Study the influence of BRs active conformation in QSAR models: Active conformations structurally different has lead to models which are quantitatively similar but qualitatively different. Quantitatively similar due to the parts of BRs that correlate with activity are the same. Qualitatively different due to this parts contribution, especially the side chain, and the structure depending variation of predictability are different on each model. Reduced models and HOMO model has shown that get more information from the models is not possible due to a structural imbalance in BRs data set. The 1 μg/plant model explains the structural requirements that make BRs active or inactive. The HIP model explains the structural requirements that determine the activity degree of active BRs. Out of the main aim, but close related to QSAR studies I wanted to: 4. Determine the experimental error of both the response and the activity data: Compared with models error, it is observed that the 1 μg/plant model is really well adjusted and has little improvement margin, but the HIP model can be considerably improved, overall in predictability. On the other hand, it has been shown that the different statistical treatments done in bioassay do not affect in a significant way the activity value.

Els brassinoesteroides són fitohormones naturals que presenten un potencial molt prometedor per a ser aplicats a l’agricultura. L’elevat cost d’obtenció d’aquests compostos ha estimulat la recerca d’anàlegs que ofereixin una bona relació entre la seva activitat biològica i el seu cost. En aquest sentit, es creu interessant abordar la cerca de compostos d’estructura no esteroïdal amb activitat brassinosteroide mitjançant mètodes computacionals. Per assolir aquest objectiu s’han plantejat dos enfocaments: per una banda, buscar estructures totalment noves i, per l’altra, buscar estructures que puguin mimetitzar només l’esquelet esteroidal d’anàlegs brassinoesteroides androstànics actius per a, posteriorment, ancorar hi la cadena addient. Amb la primera aproximació s’han realitzat processos de virtual screening sobre bases de dades de screening compounds comercials mitjançant dues estratègies: un model de QSAR, desenvolupat amb descriptors independents de l’alineament amb el programa ALMOND, i l’aplicació de la metodologia FLAP. Després d’un procés de filtració, a partir dels dos mètodes s’han proposat una serie de candidats, l’activitat dels quals ha estat avaluada amb el test d’inclinació de la làmina d’arròs (RLIT). En total, s’han trobat 7 hits, 4 dels quals formen una sèrie en la que comparteixen l’estructura de N (2 hidroxietil)piperazina. Aquests compostos es plantegen com a nous referents per obtenir estructures no esteroidals amb activitat brassinoesteroide. Per altra banda, amb la segona aproximació, s’ha aplicat la metodologia de scaffold hopping amb el programa SHOP per trobar estructures que puguin mimetitzar esquelets androstànics brassinoesteroides. Aquesta metodologia s’ha aplicat sobre dues bases de dades: una de building blocks comercials i una disenyada ad hoc prenent com a referència estructures basades en coneixements previs. Després d’una etapa de selecció mitjançant alineaments flexibles efectuats amb el programa MOE, 11 estructures han estat proposades per a la síntesis d’anàlegs. S’ha intentat la síntesis de 3 compostos a partir d’estructures anàlogues de l’esquelet androstànic escollides preliminarment. Els grups protectors escollits i les condicions de reacció assajades no han rendit els compostos desitjats però han proporcionat informació per afrontar la síntesi de futurs anàlegs brassinoesteroides amb estructures no esteroïdals. / Los brasinoesteroides son fitohormonas naturales que presentan un potencial muy prometedor para ser aplicados en la agricultura. El elevado coste de obtención de estos compuestos ha estimulado la búsqueda de análogos que ofrezcan una buena relación entre su actividad y su coste. En este sentido, se cree interesante abordar la búsqueda de compuestos de estructura no esteroidal con actividad brasinoesteroide mediante técnicas computacionales. Para lograr este objetivo se han planteado dos enfoques: por un lado, buscar estructuras totalmente nuevas y, por el otro, buscar estructuras que puedan mimetizar solo el esqueleto esteroidal de análogos brasinoesteroides androstánicos activos para, posteriormente, anclar la cadena adecuada. Con la primera aproximación se han realizado procesos de virtual screening sobre bases de datos de screening compounds comerciales mediante dos estrategias: un modelo de QSAR, desarrollado con descriptores independientes del alineamiento con el programa ALMOND, y la aplicación de la metodología FLAP. Después de un proceso de filtrado, a partir de los dos métodos se han propuesto una serie de candidatos, la actividad de los cuales ha sido evaluada con el test de inclinación de la lámina de arroz (RLIT). En total, se han encontrado 7 hits, 4 de los cuales forman una serie que comparte la estructura de N (2 hidroxietil)piperazina. Estos compuestos se plantean como nuevos referentes para obtener estructuras no esteroidales con actividad brasinoesteroide. Por otro lado, con la segunda aproximación, se ha aplicado la metodología de scaffold hopping con el programa SHOP para encontrar estructuras que puedan mimetizar esqueletos androstánicos brasinoesteroides. Esta metodología se ha aplicado sobre dos bases de datos: una de building blocks comerciales y otra diseñada ad hoc tomando como referencia estructuras basadas en conocimientos previos. Después de una etapa de selección mediante alineamientos flexibles realizada con el programa MOE, 11 estructuras han sido propuestas para la síntesis de análogos. Se ha intentado la síntesis de 3 nuevos compuestos a partir de estructuras análogas del esqueleto androstánico escogidas preliminarmente. Los grupos protectores escogidos i las condiciones de reacción ensayadas no han rendido los compuestos deseados pero han proporcionado información para afrontar la síntesis de futuros análogos brasinoesteroides con estructuras no esteroidales. / Brassinosteroids are natural phytohormones that present a promising potential in agricultural applications. The high cost to obtain these compounds has promoted the research of analogues that offer a good relationship between their biological activity and their cost. Keeping this idea in mind, the search of compounds with non-steroidal structure with brassinosteroid activity using computational methods was considered an interesting goal. To achieve this objective two approaches has been proposed: on one side, to search completely new structures and, on the other, to search structures mimetic to the steroidal skeleton of active androstane brassinosteroid analogues, where the adequate side chain has to be anchored. With the first approach, virtual screening processes over commercial screening compound databases have been performed using two strategies: a QSAR model developed with alignment-free descriptors with the program ALMOND, and the application of FLAP methodology. After a filtering process, some structures have been proposed as candidates, whose biological activity in the Rice Lamina Inclination Test (RLIT) has been measured. Totally, 7 hits have been found, from which 4 form a series sharing the N (2 hidroxiethyl)piperazine. These compounds are proposed as new referents to find non steroidal structures with brassinosteroid activity. With the second approach, the scaffold hopping methodology has been applied with SHOP program to find structures mimetic to androstane brassinosteroid skeletons. This methodology has been applied over two databases: a commercial building blocks one and an ad hoc designed one, taking as reference structures based on previous knowledge. After a filtering step with flexible alignments performed with the program MOE, 11 structures have been proposed for the synthesis of new compounds. The synthesis of 3 new compounds has been tried starting from preliminary selected structures analogous to the androstane skeleton. The chosen protecting groups and the tested reaction conditions have not yielded the desired compounds but have given information to face the future synthesis of brassinosteroid analogues with non-steroidal structures.