A radioterapia é um dos principais tratamentos para pacientes com câncer de cabeça e pescoço e a cárie relacionada à radioterapia é um de seus efeitos colaterais, apresentando-se com alta taxa de ocorrência. Além disso, falhas precoces em restaurações realizadas em dentes de pacientes irradiados em cabeça e pescoço também são observadas. Como a degradação enzimática do colágeno ocorre principalmente através da atividade das metaloproteinases de matriz e das cisteínacatepsinas, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade enzimática da dentina hígida e restaurada de dentes submetidos à radioterapia in vivo e in vitro. Os dentes irradiados in vivo foram extraídos de pacientes submetidos à radioterapia com uma dose cumulativa que variou de 40 a 70 Gy. As extrações foram feitas de 3 a 12 meses após a RT devido a doenças periodontais. Para os dentes irradiados in vitro, as amostras foram submersas em água destilada com uma irradiação total e única de 70 Gy. O estudo foi dividido em 2 fases independentes: Fase 1: Dentina Não-Restaurada (avaliação de amostras não irradiadas, dentes submetidos à radioterapia in vitro e in situ). Fase 2: Dentina Restaurada (avaliação de amostras não irradiadas e dentes submetidos à radioterapia in vitro) com 3 adesivos. Para o ensaio de zimografia (fase 1), os grupos irradiados in vitro, in vivo e não irradiados foram divididos em dois subgrupos: 1) mineralizado; 2) desmineralizado com ácido fosfórico10%. As proteínas dentinárias foram extraídas e submetidas à análise zimográfica de acordo com Mazzoni et al., 2007. Para a zimografia in situ (fase 2), os espécimes foram divididos em 6 grupos, de acordo com a forma de irradiação (não irradiada e irradiada in vitro) e o sistema adesivo testado (Adper Single Bond, 3M ESPE, ClearFil SE Bond, Kuraray ou Scotchbond Universal, 3M ESPE). Uma gelatina conjugada com fluoresceína autoextinguível foi usada como substrato para as proteases endógenas. A atividade enzimática gelatinolítica foi observada em microscópio confocal (Zeiss LSM 780-NLO, Carl Zeiss Microscopy GmbH). Para a análise da microscopia eletrônica de varredura, amostras restauradas e hígidas foram submetidas a técnica de pré-imunomarcação usando anticorpo monoclonal primário anti-CT-K e anti-CT-B, e anticorpo secundário conjugado com nano-partículas de ouro de 15nm. Um aumento na atividade gelatinolítica pós radioterapia para ambos os substratos (dentina restaurada e hígida) pôde ser observada. Houve uma maior expressão das formas ativas das MMP-2 e MMP-9 pós radioterapia para ambas as formas de radioterapia em dentina não restaurada. Nenhuma diferença na imuno-marcação para CT-K e CT-B entre os grupos irradiados e não irradiados foi observada. Adesivos autocondicionantes apresentaram uma imuno-marcação mais fraca para CT-K quando comparado ao adesivo de condicionamento total. Com isso, pode-se concluir que a radiação ionizante foi capaz de influenciar a atividade enzimática das proteínas endógenas da dentina restaurada e não restaurada. Palavras-chave: Radioterapia, metaloproteinases de matriz, MMP, cisteinocatepsinas, CT, Cárie relacionada à radiação. / Radiotherapy is one of the main treatments for head and neck cancer patients. Radiation-related caries and early restorations failures are side-effects with high rate of recurrence. As enzymatic degradation of collagen occurs mainly through the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine-cathepsins (CTs), the objective of this study was to evaluate the influence of in vivo and in vitro radiotherapy on endogenous proteases of the restored and non-restored dentin. In vivo irradiated teeth were extracted from patients who underwent clinical radiation protocols with a cumulative dose of radiation that ranged from 40 to 70 Gy. Extractions were performed 3 to 12 months after radiotherapy conclusion due to periodontal reasons. For the in vitro irradiated teeth, samples were submerged in distilled water with a total and single irradiation dose of 70 Gy. For gelatin zymography assay, irradiated in vivo, in vitro and non-irradiated groups were divided in two subgroups: 1) mineralized or 2) demineralized with 10% phosphoric acid. Dentin proteins were extracted and submitted to zymographic analysis in accordance to Mazzoni et al., 2007. For in situ zymography, specimens were divided into 6 groups, according to its irradiation form (non-irradiated and irradiated in vitro) and the adhesive system tested (Adper Single Bond, 3M ESPE, ClearFil SE Bond, Kuraray or Scotchbond Universal, 3M ESPE) using a self-quenched fluorescein-conjugated gelatin as the endogenous proteases substrate. The endogenous gelatinolytic enzyme activity was assessed by confocal laser-scanning microscope (Zeiss LSM 780-NLO, Carl Zeiss Microscopy GmbH). For SEM analysis of the HL, restored specimens were submitted to a pre-embedding immunolabeling technique using primary monoclonal antibody anti-CT-K and anti-CTB and a secondary antibody conjugated with 15nm gold nanoparticles. Radiotherapy groups presented increased gelatinolytic activity on both restored and non-restored dentin. MMP-2 and MMP-9 active form presented higher expression on both irradiated groups for non-restored dentin. Labeling for CT-K and CT-B did not differ from irradiated to non-irradiated groups. SE adhesives presenter weaker labeling for CT-K when compared to the E&R adhesive. Herewith, ionizing radiation may be able to influence the enzymatic activity of the endogenous proteins of restored and unrestored dentin