O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

O sucesso da gestação depende da adequada comunicação materno-fetal, que em algumas espécies têm um contato mais íntimo devido à capacidade migratória de populações de células trofoblásticas. Nos bovinos esse mecanismo é realizado pelas células trofoblásticas gigantes (CTGs), com invasão limitada até a lâmina basal do epitélio materno. Apesar dessa leve invasão das CTGs, é possível encontrar células fetais circulantes no sangue periférico da vaca gestante, levando ao microquimerismo fetal. Além de toda uma sinalização local e sistêmica e mudanças conformacionais, a migração das CTGs também é dependente da tolerância imunológica do epitélio materno que possui uma baixa expressão de MHC de classe I. Em contrapartida, o trofoblasto expressa MHC de classe Ib para impedir a ativação das células natural killers uterinas (uNK) contra ele mesmo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a ocorrência e contribuir para o entendimento dos mecanismos da migração celular na placenta bovina, com marcadores exclusivos do cromossomo Y e de um modelo de clone transgênico expressando a proteína GFP. A hipótese testada foi que o microquimerismo fetal observado mediante a detecção do gene TSPY no sangue periférico da vaca gestante de embrião macho, e de GFP nos tecidos placentários maternos, associado à expressão de MHC classe 1b (Qa2) na interface materno-fetal. Para tanto, 153 embriões produzidos por fertilização in vitro (FIV) foram transferidos, resultando em 34 embriões machos e 31 fêmeas no dia 62 de gestação, quando foi realizada a coleta de sangue periférico da receptora. Dentre estas gestações, foram selecionadas de 25 machos, 4 fêmeas e 5 perdas gestacionais (confirmadas no D39 por ultrassonografia) para detecção de TSPY. Também foram produzidas gestações de clones transgênicos, expressando GFP com 30, 60 e 90 dias que foram utilizadas para a detecção de mRNA e a proteína GFP. Nas gestações de FIV 60% dos embriões machos, 50% das fêmeas e 40% das perdas gestacionais foram positivos para TSPY. A detecção de TSPY nas gestações de fêmeas possivelmente é resultante da persistência do microquimerismo de gestações anteriores. Nas gestações de clones transgênicos, observou-se a presença de mRNA e proteína GFP no endométrio, também indicando migração nesta região ou o transporte da GFP, e outros conteúdos do trofoblasto, para o epitélio materno. Nos placentônios, usando anticorpo anti-GFP pode-se ver a marcação positiva tanto no trofoblasto como no epitélio materno, possivelmente decorrente de liberação das CTGs no estroma endometrial após a fusão. As CTGs, quando em formação sincicial, têm a sua expressão de GFP diminuída, o que também foi observado, utilizando-se anticorpo anti-Qa2 (antígeno murino para MHC classe Ib). O epitélio materno e o trofoblástico também foram marcados para Qa2. Mediante as técnicas utilizadas, observamos que o microquimerismo pôde ser identificado nas gestações analisadas com o uso dos marcadores TSPY no sangue e o GFP nos tecidos placentários maternos. Este estudo mostra que na placenta bovina ocorre uma migração de células fetais além do epitélio materno e abre novas perspectivas para estudos das características da interação materno-fetal ainda pouco explorada nos bovinos. / The pregnancy success depends of adequate materno-fetal communication, that in some species are have a more intimate contact due migratory capacity of trophoblastic cells populations. In bovines, this mechanism is realized by trophoblast giant cells (TGC) with limited invasion until basal lamina of maternal epithelium. Besides this light invasion of TGCs, is possible to encounter circulate fetal cells in peripheral blood of pregnant cow, leading to fetal microchimerism. Beyond local and systemic sinalization and conformational changes, TGC migration is also dependent of immunologic tolerance of maternal epithelium that possess a downregulation of classe I MHC. In complement, the trophoblast express classe Ib MHC to inhibit natural killers cells activation. In this context, the objective of this work was to study the occurrence and contribute for knowledge cellular migration mechanisms in bovine palcenta, with Y-specific markers and a model of transgenic clone expressing GFP. The tested hypothesis was that fetal microchimerism observed by detection od TSPY gene in peripheral blood of cow pregnant of male embryo, and of GFP in maternal placental tissues associated by expression of class Ib MHC (Qa2) in materno-fetal interface. For this, 153 embryos produced by in vitro fertilization (IVF) were trasnfered, resulting in 34 male embryos and 31 female in day 62 of pregnancy, when recipient peripheral blood was collected. Among these pregnancies, 25 males, 4 females and 5 pregnancy losses (confirmed at 39 days of pregnancy by ultrassonography) was selected for TSPY detection. Also were produced pregnancies of transgenic cloned, embryos expressing GFP, with 30, 60 and 90 days of pregnancy that utilized for GFP mRNA and protein detection. In IVF pregnancies, 60% of male embryos, 50% of females and 40% of pregnancy losses were positive for TSPY. The detection of TSPY in female pregnancies possible is resultant of persistence of microchimerism of anterior pregnancies. In transgenic cloned pregnancies, was observed presence of GFP mRNA and protein in endometrium, also indicating migration in this region or GFP transport, and another trophoblast content, to maternal epithelium. In placentomes, using anti-GFP antibody, could be observed positive immunolabeling in trophoblast and maternal epithelium, possible due CTGs liberation in endometrial stroma after fusion. The CTGs, in syncytium formation, have a downregulation of GFP, that also be observed, utilizing anti-Qa2 antibody (murine antigen of classe Ib MHC). The maternal and trophoblastic epithelium also was Qa2 immunolabed. By utilized techniques, microchimerism could be indentified in analyzed pregnancies with use of markers for TSPY in maternal blood and GFP in maternal placental tissues. This study show that in bovine placenta occurs fetal cell migration further maternal epithelium and show new perspectives for studies of materno-fetal interaction characteristics until under explored in bovines.

O sucesso da gestação depende da adequada comunicação materno-fetal, que em algumas espécies têm um contato mais íntimo devido à capacidade migratória de populações de células trofoblásticas. Nos bovinos esse mecanismo é realizado pelas células trofoblásticas gigantes (CTGs), com invasão limitada até a lâmina basal do epitélio materno. Apesar dessa leve invasão das CTGs, é possível encontrar células fetais circulantes no sangue periférico da vaca gestante, levando ao microquimerismo fetal. Além de toda uma sinalização local e sistêmica e mudanças conformacionais, a migração das CTGs também é dependente da tolerância imunológica do epitélio materno que possui uma baixa expressão de MHC de classe I. Em contrapartida, o trofoblasto expressa MHC de classe Ib para impedir a ativação das células natural killers uterinas (uNK) contra ele mesmo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a ocorrência e contribuir para o entendimento dos mecanismos da migração celular na placenta bovina, com marcadores exclusivos do cromossomo Y e de um modelo de clone transgênico expressando a proteína GFP. A hipótese testada foi que o microquimerismo fetal observado mediante a detecção do gene TSPY no sangue periférico da vaca gestante de embrião macho, e de GFP nos tecidos placentários maternos, associado à expressão de MHC classe 1b (Qa2) na interface materno-fetal. Para tanto, 153 embriões produzidos por fertilização in vitro (FIV) foram transferidos, resultando em 34 embriões machos e 31 fêmeas no dia 62 de gestação, quando foi realizada a coleta de sangue periférico da receptora. Dentre estas gestações, foram selecionadas de 25 machos, 4 fêmeas e 5 perdas gestacionais (confirmadas no D39 por ultrassonografia) para detecção de TSPY. Também foram produzidas gestações de clones transgênicos, expressando GFP com 30, 60 e 90 dias que foram utilizadas para a detecção de mRNA e a proteína GFP. Nas gestações de FIV 60% dos embriões machos, 50% das fêmeas e 40% das perdas gestacionais foram positivos para TSPY. A detecção de TSPY nas gestações de fêmeas possivelmente é resultante da persistência do microquimerismo de gestações anteriores. Nas gestações de clones transgênicos, observou-se a presença de mRNA e proteína GFP no endométrio, também indicando migração nesta região ou o transporte da GFP, e outros conteúdos do trofoblasto, para o epitélio materno. Nos placentônios, usando anticorpo anti-GFP pode-se ver a marcação positiva tanto no trofoblasto como no epitélio materno, possivelmente decorrente de liberação das CTGs no estroma endometrial após a fusão. As CTGs, quando em formação sincicial, têm a sua expressão de GFP diminuída, o que também foi observado, utilizando-se anticorpo anti-Qa2 (antígeno murino para MHC classe Ib). O epitélio materno e o trofoblástico também foram marcados para Qa2. Mediante as técnicas utilizadas, observamos que o microquimerismo pôde ser identificado nas gestações analisadas com o uso dos marcadores TSPY no sangue e o GFP nos tecidos placentários maternos. Este estudo mostra que na placenta bovina ocorre uma migração de células fetais além do epitélio materno e abre novas perspectivas para estudos das características da interação materno-fetal ainda pouco explorada nos bovinos. / The pregnancy success depends of adequate materno-fetal communication, that in some species are have a more intimate contact due migratory capacity of trophoblastic cells populations. In bovines, this mechanism is realized by trophoblast giant cells (TGC) with limited invasion until basal lamina of maternal epithelium. Besides this light invasion of TGCs, is possible to encounter circulate fetal cells in peripheral blood of pregnant cow, leading to fetal microchimerism. Beyond local and systemic sinalization and conformational changes, TGC migration is also dependent of immunologic tolerance of maternal epithelium that possess a downregulation of classe I MHC. In complement, the trophoblast express classe Ib MHC to inhibit natural killers cells activation. In this context, the objective of this work was to study the occurrence and contribute for knowledge cellular migration mechanisms in bovine palcenta, with Y-specific markers and a model of transgenic clone expressing GFP. The tested hypothesis was that fetal microchimerism observed by detection od TSPY gene in peripheral blood of cow pregnant of male embryo, and of GFP in maternal placental tissues associated by expression of class Ib MHC (Qa2) in materno-fetal interface. For this, 153 embryos produced by in vitro fertilization (IVF) were trasnfered, resulting in 34 male embryos and 31 female in day 62 of pregnancy, when recipient peripheral blood was collected. Among these pregnancies, 25 males, 4 females and 5 pregnancy losses (confirmed at 39 days of pregnancy by ultrassonography) was selected for TSPY detection. Also were produced pregnancies of transgenic cloned, embryos expressing GFP, with 30, 60 and 90 days of pregnancy that utilized for GFP mRNA and protein detection. In IVF pregnancies, 60% of male embryos, 50% of females and 40% of pregnancy losses were positive for TSPY. The detection of TSPY in female pregnancies possible is resultant of persistence of microchimerism of anterior pregnancies. In transgenic cloned pregnancies, was observed presence of GFP mRNA and protein in endometrium, also indicating migration in this region or GFP transport, and another trophoblast content, to maternal epithelium. In placentomes, using anti-GFP antibody, could be observed positive immunolabeling in trophoblast and maternal epithelium, possible due CTGs liberation in endometrial stroma after fusion. The CTGs, in syncytium formation, have a downregulation of GFP, that also be observed, utilizing anti-Qa2 antibody (murine antigen of classe Ib MHC). The maternal and trophoblastic epithelium also was Qa2 immunolabed. By utilized techniques, microchimerism could be indentified in analyzed pregnancies with use of markers for TSPY in maternal blood and GFP in maternal placental tissues. This study show that in bovine placenta occurs fetal cell migration further maternal epithelium and show new perspectives for studies of materno-fetal interaction characteristics until under explored in bovines.