O cão é um excelente modelo pré-clínico para o estudo de doenças, testes farmacológicos e novas terapias para futura aplicação em humanos. Desta forma, estudamos o modelo canino como fonte de células tronco de anexos fetais, o líquido amniótico, alantóide e conteúdo vitelino. Uma vez que hoje, as células tronco apresentam uma esperança na cura de diversas doenças tanto nos cães, como no ser humano. Sendo assim, caracterizamos e estudamos o potencial de diferenciação dessas células, isoladas após a técnica de ovário salpingo histerectomia, de cadelas em campanhas de castração. Após o isolamento e a caracterização, somente foi estabelecida a cultura do líquido amniótico e alantóide. Para caracterizar as células, isoladas no intuito de comprovar que são células tronco verdadeiras, os seguintes Imunomarcadores foram usados, vimentina, nestina, citoqueratina-18 e oct-4, sendo os três primeiros positivos para células do líquido amniótico e alantóide. Induzimos a diferenciação dessas células para osso, cartilagem e gordura, utilizando protocolos previamente estabelecidos. As células tronco do líquido amniótico limitaram-se à diferenciação condrogênica e osteogênica enquanto que as células tronco do alantóide, limitaram-se a diferenciação condrogênica. Ao mesmo tempo, ambos os tipos celulares, não prosseguiram à diferenciação adipogênica. Surpreendentemente, o meio de diferenciação para gordura, induziu a mudança morfológica nestas células que passaram a apresentar a morfologia típica de células neuronais. Podemos concluir que provavelmente para diferenciação adipogênica, é preciso desenvolver outro meio de cultura, por outro lado, esse resultado sugere que devemos explorar o potencial neurogênico desses tipos celulares. / The dog is an excellent preclinical model for the study of diseases, pharmacological tests and new therapies for future application in humans. Thus, we studied the canine model as a source of stem cells from fetal membranes, amniotic fluid, allantois and fluid yolk. Since today, stem cells have a hope in curing various diseases in both dogs and humans. Therefore, we characterize and study the differentiation potential of these cells, isolated after the technique of ovarian salpingo hysterectomy. After the isolation and characterization, was only established the culture of amniotic and allantois fluid. To characterize the cells isolated in order to demonstrate that they are true stem cells, the following were used antibodies, vimentin, nestin, cytokeratin-18 and oct-4. The cells were reactive positively to vimentin, nestin, cytokeratin. We induced the differentiation of these cells osteogenic, chondrogenic, adipogenic, using previously established protocols. Stem cells from amniotic fluid were restricted to chondrogenic and osteogenic differentiation while the stem cells of the allantois, limited to chondrogenic differentiation. At the same time, both cell types, were not able to adipogenic differentiation. Surprisingly, the means of adipogenic differentiation, induced the typical morphology of neuronal cells. We can conclude that probably for adipogenic differentiation, we must develop other culture media, on the other hand, this result suggests that we should explore the neurogenic potential these cell types.

O cão é um excelente modelo pré-clínico para o estudo de doenças, testes farmacológicos e novas terapias para futura aplicação em humanos. Desta forma, estudamos o modelo canino como fonte de células tronco de anexos fetais, o líquido amniótico, alantóide e conteúdo vitelino. Uma vez que hoje, as células tronco apresentam uma esperança na cura de diversas doenças tanto nos cães, como no ser humano. Sendo assim, caracterizamos e estudamos o potencial de diferenciação dessas células, isoladas após a técnica de ovário salpingo histerectomia, de cadelas em campanhas de castração. Após o isolamento e a caracterização, somente foi estabelecida a cultura do líquido amniótico e alantóide. Para caracterizar as células, isoladas no intuito de comprovar que são células tronco verdadeiras, os seguintes Imunomarcadores foram usados, vimentina, nestina, citoqueratina-18 e oct-4, sendo os três primeiros positivos para células do líquido amniótico e alantóide. Induzimos a diferenciação dessas células para osso, cartilagem e gordura, utilizando protocolos previamente estabelecidos. As células tronco do líquido amniótico limitaram-se à diferenciação condrogênica e osteogênica enquanto que as células tronco do alantóide, limitaram-se a diferenciação condrogênica. Ao mesmo tempo, ambos os tipos celulares, não prosseguiram à diferenciação adipogênica. Surpreendentemente, o meio de diferenciação para gordura, induziu a mudança morfológica nestas células que passaram a apresentar a morfologia típica de células neuronais. Podemos concluir que provavelmente para diferenciação adipogênica, é preciso desenvolver outro meio de cultura, por outro lado, esse resultado sugere que devemos explorar o potencial neurogênico desses tipos celulares. / The dog is an excellent preclinical model for the study of diseases, pharmacological tests and new therapies for future application in humans. Thus, we studied the canine model as a source of stem cells from fetal membranes, amniotic fluid, allantois and fluid yolk. Since today, stem cells have a hope in curing various diseases in both dogs and humans. Therefore, we characterize and study the differentiation potential of these cells, isolated after the technique of ovarian salpingo hysterectomy. After the isolation and characterization, was only established the culture of amniotic and allantois fluid. To characterize the cells isolated in order to demonstrate that they are true stem cells, the following were used antibodies, vimentin, nestin, cytokeratin-18 and oct-4. The cells were reactive positively to vimentin, nestin, cytokeratin. We induced the differentiation of these cells osteogenic, chondrogenic, adipogenic, using previously established protocols. Stem cells from amniotic fluid were restricted to chondrogenic and osteogenic differentiation while the stem cells of the allantois, limited to chondrogenic differentiation. At the same time, both cell types, were not able to adipogenic differentiation. Surprisingly, the means of adipogenic differentiation, induced the typical morphology of neuronal cells. We can conclude that probably for adipogenic differentiation, we must develop other culture media, on the other hand, this result suggests that we should explore the neurogenic potential these cell types.

O crescimento, desenvolvimento e manutenção do tecido ósseo são processos altamente regulados. Diversas proteínas como hormônios, fatores de crescimento e citocinas estão envolvidas nestes processos e exercem atividade direta sobre células osteoblástica e osteoclástica, atuando em sua diferenciação e ativação metabólica. O processo de regeneração óssea é iniciado por fatores estimuladores locais como as proteínas morfogenética óssea (BMP Bone Morphogenetic Proteins). As BMPs são um produto do metabolismo dos osteoblastos, odontoblastos e de várias células tumorais, sendo armazenadas na forma de concentrados no osso, dentina e em células neoplásicas do osteossarcoma e de certos tumores odontogênicos, tais como: fibroma cementificante, cementoblastoma benigno, dentinoma, fibroma odontogênico e odontoma. Esclarecer os mecanismos que controlam a remodelação óssea é uma questão bastante relevante. Nesse sentido, as células-tronco mesenquimais têm despertado grande interesse devido ao seu potencial envolvimento no processo de reparo tissular. A obtenção de osteoblastos funcionais a partir de células-tronco mesenquimais tem sido utilizada na engenharia de tecidos e terapia celular. Desse modo, no presente trabalho foi realizada uma análise proteômica das proteínas envolvidas nas diversas fases de diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato Wistar e humana, no sentido de obter maiores informações sobre a diferenciação celular e a biologia do tecido ósseo. Células-tronco mesenquimais obtidas de medula óssea foram cultivadas em meio osteogênico por diferentes períodos para obter células em diversas fases da diferenciação osteoblástica. Para análise proteômica foram utilizadas ferramentas como a estratégia de shotgun proteomics e quantificação relativa (iTRAQ - Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) para separação de proteínas e a espectrometria de massas para a identificação e quantificação relativa de proteínas e peptídeos. Neste contexto, os nossos resultados nos levam a concluir que: as CTMs de medula óssea de rato Wistar expressam genes que estão envolvidos na diferenciação osteogênica quando estimuladas in vitro formando matriz óssea no período de 14 dias, ou seja, o fator estimulante no microambiente é de fundamental importância; as CTMs de medula óssea humana apresentaram resultados semelhantes com as CTMs de ratos em nível genômico durante a diferenciação osteogênica, entretanto quando estimuladas in vitro formaram a matriz óssea no período de 21 dias; utilizando duas abordagens proteômicas, foi possível identificar proteínas importantes que estão envolvidas no processo de diferenciação. Mas cabe salientar que, embora tenham sido detectados genes que parecem envolvidos no processo de diferenciação, isso não teve reflexo no proteoma dessas células nos períodos de 7 e 14 dias da indução de diferenciação à osteogênese, o que indica que a maior parte da funcionalidade dessas células quanto aos outros processos biológicos estão preservados, como por exemplo a proliferação celular permaneceu sem grandes alterações. Isso indica que manipulações de isolamento, cultivo e indução da diferenciação dessas células não afetaram o proteoma, com aspectos positivos para a utilização de células-tronco mesenquimais em terapia celular. Do ponto de vista metodológico, esse trabalho abre perspectivas da utilização de estratégias proteômicas baseadas na marcação por isóbaros em combinação com separação de proteínas por eletroforese unidimensional SDS-PAGE para a análise de amostras biologicamente complexas e de quantidades limitadas de obtenção como células-tronco mesenquimais. O estudo da expressão de proteínas durante as fases de diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de medula óssea deve refletir seu estado funcional e contribuir para o entendimento das diversas vias envolvidas no processo de diferenciação. / The growth, development and maintenance of bone tissue are highly regulated processes. Several proteins such as hormones, growth factors and cytokines are actively involved in these processes and exert direct activity on osteoblastic and osteoclastic cells, acting in their differentiation and metabolic activation. The process of bone regeneration is initiated by local stimulating factors as bone morphogenetic proteins (BMP). BMPs are a product of the metabolism of osteoblasts, odontoblasts and various tumor cells and is stored in the form of concentrates in bone, dentin and neoplastic cells of osteosarcoma and certain odontogenic tumors such as fibroma cementifying, cementoblastoma benign dentinoma, odontogenic fibroma and odontoma. Clarify the mechanisms that control bone remodeling is a very relevant issue. Accordingly, the mesenchymal stem cells have attracted great interest because of its potential involvement in the process of tissue repair. Obtaining functional osteoblasts from mesenchymal stem cells has been used in tissue engineering and cell therapy. Thus, this present work performed a proteomic analysis of proteins involved in various stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow of Wistar rat and human, in order to obtain more information on the biology of cell differentiation and bone tissue. Mesenchymal stem cells obtained from bone marrow were cultured in osteogenic medium for different periods to obtain cells at different stages of osteoblast differentiation. For proteomics analysis tools were used as the strategy of shotgun proteomics and relative quantification (iTRAQ - isobaric Tag for Relative and Absolute quantitation) for protein separation and mass spectrometry to identify proteins. In this context, our results take us to conclude that the MSCs of Wistar rat bone marrow express genes that are involved in osteogenic differentiation in vitro when stimulated to form bone matrix during the 14 days, ie stimulating factor in the microenvironment is of fundamental importance, the MSCs from human bone marrow showed similar results with rat MSCs at the genomic level during osteogenic differentiation, however, when stimulated in vitro formed bone matrix within 21 days, using two proteomic approaches, we could identify proteins important that are involved in the process of differentiation. But it should be noted that although it has been identified genes that seem involved in the process of differentiation, it was not reflected in the proteome of these cells at 7 and 14 days after induction of the osteogenic differentiation, indicating that most of the functionality of these cells and other biological processes are preserved, such as cell proliferation remained without major changes. This indicates that manipulations of isolation, culture and induction of differentiation of these cells did not affect the proteome, with positive aspects to the use of mesenchymal stem cells in cell therapy. From the methodological point of view, this work opens up the use of proteomic strategies based on the score for isobars in combination with protein separation by electrophoresis, one-dimensional SDS-PAGE for the analysis of complex biological samples and limited quantities of production as mesenchymal stem cells. The study of protein expression during stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow should reflect their functional status and contribute to the understanding of pathways involved in the process of differentiation.

Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease

O crescimento, desenvolvimento e manutenção do tecido ósseo são processos altamente regulados. Diversas proteínas como hormônios, fatores de crescimento e citocinas estão envolvidas nestes processos e exercem atividade direta sobre células osteoblástica e osteoclástica, atuando em sua diferenciação e ativação metabólica. O processo de regeneração óssea é iniciado por fatores estimuladores locais como as proteínas morfogenética óssea (BMP Bone Morphogenetic Proteins). As BMPs são um produto do metabolismo dos osteoblastos, odontoblastos e de várias células tumorais, sendo armazenadas na forma de concentrados no osso, dentina e em células neoplásicas do osteossarcoma e de certos tumores odontogênicos, tais como: fibroma cementificante, cementoblastoma benigno, dentinoma, fibroma odontogênico e odontoma. Esclarecer os mecanismos que controlam a remodelação óssea é uma questão bastante relevante. Nesse sentido, as células-tronco mesenquimais têm despertado grande interesse devido ao seu potencial envolvimento no processo de reparo tissular. A obtenção de osteoblastos funcionais a partir de células-tronco mesenquimais tem sido utilizada na engenharia de tecidos e terapia celular. Desse modo, no presente trabalho foi realizada uma análise proteômica das proteínas envolvidas nas diversas fases de diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato Wistar e humana, no sentido de obter maiores informações sobre a diferenciação celular e a biologia do tecido ósseo. Células-tronco mesenquimais obtidas de medula óssea foram cultivadas em meio osteogênico por diferentes períodos para obter células em diversas fases da diferenciação osteoblástica. Para análise proteômica foram utilizadas ferramentas como a estratégia de shotgun proteomics e quantificação relativa (iTRAQ - Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) para separação de proteínas e a espectrometria de massas para a identificação e quantificação relativa de proteínas e peptídeos. Neste contexto, os nossos resultados nos levam a concluir que: as CTMs de medula óssea de rato Wistar expressam genes que estão envolvidos na diferenciação osteogênica quando estimuladas in vitro formando matriz óssea no período de 14 dias, ou seja, o fator estimulante no microambiente é de fundamental importância; as CTMs de medula óssea humana apresentaram resultados semelhantes com as CTMs de ratos em nível genômico durante a diferenciação osteogênica, entretanto quando estimuladas in vitro formaram a matriz óssea no período de 21 dias; utilizando duas abordagens proteômicas, foi possível identificar proteínas importantes que estão envolvidas no processo de diferenciação. Mas cabe salientar que, embora tenham sido detectados genes que parecem envolvidos no processo de diferenciação, isso não teve reflexo no proteoma dessas células nos períodos de 7 e 14 dias da indução de diferenciação à osteogênese, o que indica que a maior parte da funcionalidade dessas células quanto aos outros processos biológicos estão preservados, como por exemplo a proliferação celular permaneceu sem grandes alterações. Isso indica que manipulações de isolamento, cultivo e indução da diferenciação dessas células não afetaram o proteoma, com aspectos positivos para a utilização de células-tronco mesenquimais em terapia celular. Do ponto de vista metodológico, esse trabalho abre perspectivas da utilização de estratégias proteômicas baseadas na marcação por isóbaros em combinação com separação de proteínas por eletroforese unidimensional SDS-PAGE para a análise de amostras biologicamente complexas e de quantidades limitadas de obtenção como células-tronco mesenquimais. O estudo da expressão de proteínas durante as fases de diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de medula óssea deve refletir seu estado funcional e contribuir para o entendimento das diversas vias envolvidas no processo de diferenciação. / The growth, development and maintenance of bone tissue are highly regulated processes. Several proteins such as hormones, growth factors and cytokines are actively involved in these processes and exert direct activity on osteoblastic and osteoclastic cells, acting in their differentiation and metabolic activation. The process of bone regeneration is initiated by local stimulating factors as bone morphogenetic proteins (BMP). BMPs are a product of the metabolism of osteoblasts, odontoblasts and various tumor cells and is stored in the form of concentrates in bone, dentin and neoplastic cells of osteosarcoma and certain odontogenic tumors such as fibroma cementifying, cementoblastoma benign dentinoma, odontogenic fibroma and odontoma. Clarify the mechanisms that control bone remodeling is a very relevant issue. Accordingly, the mesenchymal stem cells have attracted great interest because of its potential involvement in the process of tissue repair. Obtaining functional osteoblasts from mesenchymal stem cells has been used in tissue engineering and cell therapy. Thus, this present work performed a proteomic analysis of proteins involved in various stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow of Wistar rat and human, in order to obtain more information on the biology of cell differentiation and bone tissue. Mesenchymal stem cells obtained from bone marrow were cultured in osteogenic medium for different periods to obtain cells at different stages of osteoblast differentiation. For proteomics analysis tools were used as the strategy of shotgun proteomics and relative quantification (iTRAQ - isobaric Tag for Relative and Absolute quantitation) for protein separation and mass spectrometry to identify proteins. In this context, our results take us to conclude that the MSCs of Wistar rat bone marrow express genes that are involved in osteogenic differentiation in vitro when stimulated to form bone matrix during the 14 days, ie stimulating factor in the microenvironment is of fundamental importance, the MSCs from human bone marrow showed similar results with rat MSCs at the genomic level during osteogenic differentiation, however, when stimulated in vitro formed bone matrix within 21 days, using two proteomic approaches, we could identify proteins important that are involved in the process of differentiation. But it should be noted that although it has been identified genes that seem involved in the process of differentiation, it was not reflected in the proteome of these cells at 7 and 14 days after induction of the osteogenic differentiation, indicating that most of the functionality of these cells and other biological processes are preserved, such as cell proliferation remained without major changes. This indicates that manipulations of isolation, culture and induction of differentiation of these cells did not affect the proteome, with positive aspects to the use of mesenchymal stem cells in cell therapy. From the methodological point of view, this work opens up the use of proteomic strategies based on the score for isobars in combination with protein separation by electrophoresis, one-dimensional SDS-PAGE for the analysis of complex biological samples and limited quantities of production as mesenchymal stem cells. The study of protein expression during stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow should reflect their functional status and contribute to the understanding of pathways involved in the process of differentiation.

Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease