O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva das células pancreáticas produtoras de insulina. A imunossupressão em altas doses seguida do transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TACTH) constitui uma alternativa terapêutica recente e promissora para o DM-1 recém-diagnosticado, impedindo a progressão da destruição das células pancreáticas produtoras de insulina e induzindo independência insulínica por um período prolongado na maioria dos pacientes. O princípio dessa terapia baseia-se na eliminação das células autorreativas pela imunossupressão intensa e na reconstituição de um sistema imunológico novo e tolerante após o transplante. Com o objetivo de avaliar a função do timo e sua contribuição na geração do repertório de células T nos pacientes com DM-1 após o TACTH, nesse trabalho foram avaliados os níveis de T cell receptor excision circles (TRECs) em células T do sangue periférico e a diversidade do repertório de células T dos pacientes com DM-1 (n=23) antes e em diversos períodos após o transplante. A quantificação absoluta dos níveis de TRECs (número de moléculas de TRECs/100g de DNA) foi realizada pela técnica de PCR em tempo real e a avaliação do repertório de células T foi realizada pela técnica de TCRBV CDR3 Spectratyping. Dentre os vinte e três pacientes, vinte alcançaram a independência insulínica por períodos variáveis de tempo e três não responderam ao tratamento. Não foi observada a restrição do repertório de células T nos pacientes com DM-1 no período pré-transplante, ou seja, quando recém-diagnosticados. Foram identificadas cinco famílias V (7, 18, 19, 20 e 22) em expansão clonal nos pacientes com DM-1. As famílias V 7, 18, 19, 20 apresentaram-se em expansão clonal antes do transplante e se mantiveram com frequência elevada após o transplante, enquanto a família V 22 apresentou aumento da frequência somente nos períodos mais tardios após o transplante. Nos primeiros meses após o transplante, houve redução do número de moléculas de TRECs e restrição do repertório de células T. Contudo, um ano após o transplante, o número de moléculas de TRECs atingiram valores normais e o repertório de células T apresentou-se com ampla diversidade. Nossos resultados mostraram que o TACTH foi capaz de induzir mudanças na composição do repertório de células T dos pacientes com DM-1 após a terapia de IAD/TACTH, evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dos picos de CDR3 do TCR, sugerindo a reconstituição de um repertório de células T diverso até dois anos pós-transplante. Embora tenha ocorrido reativação da função tímica após o transplante, evidenciada pelo aumento dos níveis de TRECs de um ano e meio a cinco anos pós-transplante, a diversidade do repertório das células T diminuiu a partir de dois anos e meio pós-transplante, sugerindo uma reconstituição tímica de novo de células T naive que expressam preferencialmente algumas cadeias V. Estas evidências imunológicas poderiam explicar a melhora clínica (independência insulínica) temporária observada na maioria dos pacientes após a terapia de IAD/TACTH. / Type 1 diabetes mellitus (T1D) is an organ-specific autoimmune disease characterized by insulin-producing pancreatic cell destruction. High-dose immunosuppression followed by autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) is a recent and promising therapeutic approach for treatment of T1D, preventing the progress of destruction of pancreatic cells and inducing insulin independence for a prolonged period in most patients. The rationale of the AHSCT is based on the elimination of autoreactive cells by the intense immunosuppression and on the reconstitution of a new and tolerant immune system after transplantation. Aiming at assessing the thymic role in the production of new T cell repertoire in T1D patients after AHSCT, in this study was evaluated the levels of T cell receptor excision circles (TRECs) in T cells of peripheral blood as well as the clonality and diversity of T cell repertoire in T1D patients (n=23) before and several periods after transplantation. The absolute quantification of TRECs levels (number of molecules of TRECs/100ng of DNA) was performed by real-time PCR and the analysis of T cell repertoire was performed by TCRBV CDR3 Spectratyping. Among the twenty-three patients, twenty achieved insulin independence for variable periods and three did not respond to the treatment. The T cell repertoire in T1D patients was not restricted in pre-transplantation, i.e., when newly diagnosed. It was identified five V families (7, 18, 19, 20 e 22) in the clonal expansion in T1D patients. The V families 7, 18, 19, 20 were in clonal expansion before transplantation and maintained with high frequency after transplantation, whereas the V 22 family increased its frequency only in the later periods after transplantation. It was observed that the numbers of molecules of TRECs decreased and the T cell repertoire was restricted in the early months after transplantation. However, the levels of TRECs were normalized and the T cell repertoire showed diversity one year after transplantation. Our results indicate that AHSCT was able to induce changes in the composition of the T cell repertoire of patients after AHSCT, evidenced by qualitative and quantitative changes in the composition of T-cell receptor -chain CDR3 peaks, suggesting the reconstitution of diverse T cell repertoire up to two years after transplantation. Although there was reactivation of thymic function after transplantation, as evidenced by increased levels of TRECs from one and a half year to five years after transplantation, the diversity of the T cells repertoire decreased from two and a half years after transplantation, suggesting a reconstruction of new naive T cells that preferentially express some V chains. These immunological evidences could explain the temporary clinical improvement (insulin independence) observed in most patients after IAD / AHSCT therapy.

O Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é reconhecido como agente causador de infecção nosocomial entre receptores de pacientes de células-tronco hematopoéticas causando morbidade e mortalidade consideráveis nesses pacientes. O objetivo desse estudo foi caracterizar as cepas do RSV isoladas de receptores de transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo durante sua estação. As cepas do RSV foram tipadas (em grupo A ou B) e genotipadas. Das sete cepas analisadas dos receptores de TCTH durante o ano de 2001, somente duas pertenciam ao grupo B, as outras cinco eram pertencentes ao grupo A. Dessas sete cepas, três eram altamente relacionadas e haviam infectados pacientes que freqüentavam o ambulatório. Em 2002, das doze cepas analisadas, três pertenciam ao grupo A e as outras nove pertenciam ao grupo B. Sete cepas eram altamente relacionadas entre elas e eram também de pacientes de ambulatório sugerindo que a transmissão em hospital-dia era mais provável. Enfim, múltiplços genótipos do RSV co-circularam nas unidades de TCTH (ambulatório e enfermaria) do Hospital das Clínicas entre 2001 e 2002. A transmissão nosocomial foi mais provável ocorrer no ambulatório da unidade de TCTH quando comparada à enfermaria. Políticas de controle de infecção devem ser também implementadas em ambulatórios para evitar transmissão nosocomial do RSV e outros vírus respiratórios em pacientes de ambulatório. / Respiratory Syncytial Virus is recognized as the leading cause of nosocomial respiratory infection among recipients of hematopoietic stem cell transplant (HSCT) causing considerable morbity and mortality among theses patients. The aim this study was characterize the strains of Respiratory Syncytial Virus in recipients Hematopoietic Stem Cell Transplant Unit (HSCT) at Hospital das Clínicas, University of São Paulo Medical School during RSV season in symptomatic HSCT recipients at Hospital das Clínicas. The strains of RSV was typed (in group A or B) and genotyped. Of the seven strains analyzed from HSCT recipients during 2001, only two belonged to group B, the other five belonged to group A. Of these seven strains, three were closely related and were from outpatients. In 2002 , of the twelve strains analyzed, three belonged to group A and the other nine belonged to group B. Seven strains were closely related and were also from outpatients suggesting that nosocomial transmission in hospital-day was more likely. In conclusion, multiples genotypes of RSV co-circulated in the Hematopoietic Stem Cell Transplant units (ward and dayhospital) of Hospital das Clínicas between 2001 and 2002. Nosocomial transmission was more likely to occur at the HSCT Day-hospital as compared to the HSCT ward. Infection control practices should be also implemented at Day-hospital Units to avoid nosocomial transmission of RSV and other respiratory viruses in outpatient units.

O transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) consiste em um procedimento complexo e relacionado à ocorrência de diversas complicações, dentre elas os processos infecciosos decorrentes do longo período de imunossupressão vivenciado após a instituição do regime de condicionamento. Inúmeras medidas têm sido empregadas visando à prevenção e controle de infecções, porém, observam-se divergências em relação à utilização das mesmas; sendo que o emprego da prática baseada em evidências possibilita ao profissional tomar decisões em relação à sua prática fundamentadas em resultados de pesquisas científicas atuais. Esta revisão integrativa da literatura teve como objetivo identificar e avaliar as evidências disponíveis na literatura e publicadas nos últimos 20 anos em relação ao uso de três medidas de prevenção de infecção em pacientes submetidos ao TCTH durante o período de internação: uso de filtros de ar de alta eficiência, isolamento protetor e máscaras. Para a seleção dos artigos foram utilizadas as bases de dados LILACS, PUBMED, CINAHL, EMBASE e a Biblioteca Cochrane. A amostra foi composta por 15 estudos, sendo que apenas um apresentou nível de evidência forte (nível I), dois apresentaram nível de evidência moderado (nível IV e V) e doze consistiram em estudos com evidências fracas (nível VI e VII). Dez estudos abordaram a utilização dos filtros HEPA, sendo recomendado seu emprego para pacientes submetidos ao transplante alogênico durante o período de neutropenia. A necessidade de seu uso para pacientes submetidos ao transplante autólogo ainda é controversa. Nove trabalhos abordaram o uso do isolamento protetor e, embora alguns autores relatem que o emprego do mesmo parece apresentar benefícios quando não se dispõe de filtros HEPA, a utilização desta medida já não é mais indicada tanto pelos Centers for Disease Control and Prevention (CDC) quanto pela maioria dos estudos analisados. Em relação à utilização de máscaras por pacientes, profissionais de saúde ou visitantes dentro das unidades de internação para TCTH, não foram encontrados estudos com evidências fortes que justifiquem o seu uso. No entanto, recomenda-se que sejam seguidas as diretrizes dos CDC quanto ao uso de respiradores especiais (como as máscaras N95) pelos pacientes imunocomprometidos submetidos ao TCTH ao deixar a unidade de transplante provida de filtro HEPA quando próximo a ela houver áreas de construção/reforma ou atividades geradoras de poeira. Embora os dados evidenciados auxiliem na tomada de decisão para a implementação da assistência de enfermagem a estes pacientes, verificou-se a necessidade de realização de estudos com nível de evidência forte que comprovem ou refutem a efetividade destas medidas. / Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a complex procedure related to the occurrence of different complications, including infectious processes deriving from the long period of immunosuppression experienced after the establishment of the conditioning regimen. Countless measures have been used for infection prevention and control, but divergences are observed with regard to their use; evidence-based practice allows professionals to make decisions for practice based on current scientific research results. This integrative literature review aimed to identify and assess evidence available in literature and published in the last 20 years about the use of three infection prevention measures in patients submitted to HSCT during hospitalization: use of high-efficiency air filters, protective isolation and masks. LILACS, PUBMED, CINAHL, EMBASE and the Cochrane Library were used to select the articles. The sample comprised 15 studies, only one of which presented strong evidence (level I), while two presented moderate evidence (levels IV and V) and twelve were studies with weak evidence (levels VI and VII). Ten studies discussed the use of HEPA filters, recommended for patients submitted to allogeneic transplantation during the neutropenia period. It remains controversial whether these filters need to be used for patients submitted to autologous transplant. Nine studies addressed the use of protective isolation and, although some authors report that using this measure can be beneficial when HEPA filters are unavailable, neither the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) nor by most of the studies under analysis indicate it any longer. With regard to the use of masks by patients, health professionals or visitors inside HSCT hospitalization units, no studies with strong evidence were found that justify its use. However, it is recommended that CDC recommendations be followed regarding the use of special respirators (like N95 masks) by immunocompromised patients submitted to HSCT when they leave the transplantation unit with a HEPA filter in case of nearby construction/reform areas or activities that generate dust. Although the evidenced data support decision making with a view to nursing care delivery to these patients, research with strong evidence is needed to prove or reject the efficacy of these measures.

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:34Z : No. of bitstreams: 1 Publico-018.pdf: 1910669 bytes, checksum: a40b61267560276f1db47642341c6e56 (MD5) / Introdução: Polimorfismos genéticos estão associados com um aumento do risco de tromboembolismo venoso (TEV) e outras doenças cardiovasculares. Estudos prévios sugerem que a doença venooclusiva hepática (DVOH), que se desenvolve intra transplante de medula óssea pode ser atribuída à polimorfismos gênicos. Objetivos: Avaliar a correlação entre polimorfismos genéticos e o risco de doença venooclusiva hepática no transplante de medula óssea e a associação com a presença de variáveis como o uso de vancomicina, drogas citotóxicas usadas no regime de condicionamento, presença de disfução hepática anterior ao transplante, presença de infecção por citomegalovírus, e grupos de doenças avaliáveis. Pacientes e métodos: Este estudo caracteriza-se por um estudo clinico observacional multicêntrico. Foram avaliados 120 pacientes, submetidos a transplante alogênico de medula óssea. Cada paciente foi avaliado propectivamente para DVOH, confirmado pelo critério de Seattle modificado, idade variando de 2 a 65 anos. Fatores de risco para DVOH severo foram analisados usando modelos estatisticos de avaliação. Detectamos simultaneamente através de PCR seguido de digestão e detecção através de eletroforese em gel de agarose, mutação do HFE C282Y, H63D, S65C; MTHFR C677T; Fator V de Leiden, Protrombina 20210A e glutationa S-tranferase. Resultados: Neste estudo observacional de pessoas, submetidas a transplante de medula óssea alogênico, a presença de disfução hepática pré transplante foi um fator de risco significante para DVOH. Nós tambem observamos uma associação entre a presença de mutação HFE S65C e disfunção hepática. Conclusões: Em resumo, nossos dados sugerem que disfunção hepatica observada pré transplante de medula óssea é um fator de risco estatisticamente significante para DVOH e que a presença da mutação do HFE S65C apresenta uma tendência ao desenvolvimento de dano hepático. Contudo, não evidenciamos associação dos polimorfismos estudados com DVOH. / TEDE

O Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é reconhecido como agente causador de infecção nosocomial entre receptores de pacientes de células-tronco hematopoéticas causando morbidade e mortalidade consideráveis nesses pacientes. O objetivo desse estudo foi caracterizar as cepas do RSV isoladas de receptores de transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo durante sua estação. As cepas do RSV foram tipadas (em grupo A ou B) e genotipadas. Das sete cepas analisadas dos receptores de TCTH durante o ano de 2001, somente duas pertenciam ao grupo B, as outras cinco eram pertencentes ao grupo A. Dessas sete cepas, três eram altamente relacionadas e haviam infectados pacientes que freqüentavam o ambulatório. Em 2002, das doze cepas analisadas, três pertenciam ao grupo A e as outras nove pertenciam ao grupo B. Sete cepas eram altamente relacionadas entre elas e eram também de pacientes de ambulatório sugerindo que a transmissão em hospital-dia era mais provável. Enfim, múltiplços genótipos do RSV co-circularam nas unidades de TCTH (ambulatório e enfermaria) do Hospital das Clínicas entre 2001 e 2002. A transmissão nosocomial foi mais provável ocorrer no ambulatório da unidade de TCTH quando comparada à enfermaria. Políticas de controle de infecção devem ser também implementadas em ambulatórios para evitar transmissão nosocomial do RSV e outros vírus respiratórios em pacientes de ambulatório. / Respiratory Syncytial Virus is recognized as the leading cause of nosocomial respiratory infection among recipients of hematopoietic stem cell transplant (HSCT) causing considerable morbity and mortality among theses patients. The aim this study was characterize the strains of Respiratory Syncytial Virus in recipients Hematopoietic Stem Cell Transplant Unit (HSCT) at Hospital das Clínicas, University of São Paulo Medical School during RSV season in symptomatic HSCT recipients at Hospital das Clínicas. The strains of RSV was typed (in group A or B) and genotyped. Of the seven strains analyzed from HSCT recipients during 2001, only two belonged to group B, the other five belonged to group A. Of these seven strains, three were closely related and were from outpatients. In 2002 , of the twelve strains analyzed, three belonged to group A and the other nine belonged to group B. Seven strains were closely related and were also from outpatients suggesting that nosocomial transmission in hospital-day was more likely. In conclusion, multiples genotypes of RSV co-circulated in the Hematopoietic Stem Cell Transplant units (ward and dayhospital) of Hospital das Clínicas between 2001 and 2002. Nosocomial transmission was more likely to occur at the HSCT Day-hospital as compared to the HSCT ward. Infection control practices should be also implemented at Day-hospital Units to avoid nosocomial transmission of RSV and other respiratory viruses in outpatient units.

O vírus respiratório sincicial (RSV) é responsável por importante morbidade em receptores de transplante de células tronco-hematopoéticas (TCTH), especialmente no período que antecede a enxertia. A imunidade induzida pela infecção pelo RSV é transitória e as reinfecções são freqüentes. O comportamento e papel dos anticorpos anti-RSV em receptores de TCTH é desconhecido. Em amostras de soro estocadas, ensaio imunoenzimático (ELISA) foi aplicado para detecção de anticorpos anti-RSV para avaliar a dinâmica desses anticorpos antes e após o TCTH, em pacientes com e sem infecção pelo RSV, bem como a resposta de anticorpos específicos nos pacientes com infecção pelo RSV diagnosticada por imunofluorescência direta. A mediana do tempo de coleta das amostras pré-TCTH foi de -35 e -44 dias nos casos e controles, respectivamente, com média de títulos de anticorpos anti-RSV de 2490 UA/mL e 2872 UA/mL, respectivamente. Após o transplante, as medianas de tempo das 3 amostras analisadas dos pacientes com infecção pelo RSV foram d+14, d+52 e d+89 e os respectivos títulos de anticorpos foram 2457 UA/mL, 2715 UA/mL e 2950 UA/mL. Nos pacientes sem infecção pelo RSV (controles), as medianas de tempo das 3 amostras analisadas foram d+9, d+69 e d+93 e os respectivos títulos de anticorpos foram 2738 UA/mL, 2794 UA/mL e 2642 UA/mL. Não houve diferença estatística entre os dois grupos. Nenhum dos pacientes com infecção pelo RSV apresentou elevação de quatro vezes nos títulos de anticorpos / Respiratory syncytial virus (RSV) infection can cause significant morbidity and mortality in haematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients, especially when upper respiratory tract infection (RTI) progresses to lower RTI, which is expected to occur in more than 50% of the patients. The humoral immunity induced by RSV infection is transient and reinfections are frequent. The dynamics and role of anti-RSV antibodies in HSCT recipients are unknown. In stored serum samples, an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) was applied to evaluate the dynamics of anti-RSV antibodies in HSCT recipients with and without RSV infection, as well as the specific humoral response in HSCT recipients with RSV infection diagnosed by direct immunofluorescent assay in nasal wash samples. Pre-transplant samples were selected at a median time of 35 and 44 days and the mean concentration of RSV antibodies were 2490 AU/mL and 2872 AU/mL, in cases and controls, respectively. After HSCT, serum samples from patients with RSV infection (cases) were evaluated at median time of 14, 52 and 89 days, and the respective mean concentrations of anti- RSV antibodies were 2457 AU/mL, 2715 AU/mL and 2950 AU/mL. In patients without RSV (controls), serum samples were evaluated at median time of 9, 69 and 93 days, and the respective mean concentrations of anti-RSV antibodies were 2738 AU/mL, 2794 AU/mL e 2642 AU/mL. Difference was not statistically significant. No patient developed a four-fold rise in RSV antibody titers

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) e estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) isoladas da medula óssea vêm sendo utilizadas como fonte autóloga no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). As CTHs dão origem a todas as células dos sistemas hematopoético e imunológico e as CTMs possuem propriedades imunomoduladoras pela liberação de fatores solúveis e interação célula-célula. Existem trabalhos que sugerem que as doenças autoimunes sejam provenientes de defeitos intrínsecos nas células-tronco precursoras da medula óssea. Com o intuito de avaliar se as CTHs e CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica diferencial por microarrays de CTHs e CTMs de pacientes com EM, além de avaliar o perfil de expressão gênica de CTMs após o transplante autólogo de CTHs e a capacidade imunomoduladora in vitro das CTMs de pacientes. As CTHs e CTMs foram isoladas da medula óssea de pacientes com EM e doadores saudáveis, após consentimento informado. As CTHs foram isoladas por colunas imunomagnéticas e as CTMs foram isoladas por gradiente de densidade e submetidas à caracterização morfológica, imunofenotípica e capacidade de diferenciação em adipócitos e osteócitos. O RNA das CTHs e CTMs foi extraído e purificado e o perfil de expressão gênica foi avaliado por microarrays, utilizando hibridações em lâminas contendo 44.000 sondas. A capacidade imunomoduladora das CTMs de pacientes e controles foi avaliada por ensaios de cocultivo com linfócitos alogênicos e as citocinas foram quantificadas no sobrenadante por CBA flex e ELISA. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os resultados mostraram que as CTHs de pacientes possuem perfis de expressão gênica diferentes dos controles, com 2.722 genes diferencialmente expressos, envolvidos em vias de sinalização importantes para manutenção/proliferação das CTHs e diferenciação em linhagens específicas durante a hematopoese. Dentre essas sinalizações estão incluídas as vias da apoptose, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt e Ca/NFAT, sugerindo que as CTHs de pacientes com EM possuam alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença autoimune. As CTMs isoladas de pacientes com EM exibiram aparência senescente e reduzida expressão de marcadores imunofenotípicos. Com relação à expressão gênica, as CTMs de pacientes possuem perfil diferente das CTMs controle, sendo detectados 618 genes diferencialmente expressos, incluindo genes relacionados à sinalização FGF, HGF, sinalização de moléculas de adesão e moléculas envolvidas nos processos de imunorregulação, como IL10, IL6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 e HGF. O perfil de expressão gênica das CTMs de pacientes pós-transplante assemelhou-se ao perfil das CTMs pré-transplante. Ensaios de cocultivo de CTMs com linfócitos alogênicos mostraram que as CTMs de pacientes possuem capacidade antiproliferativa reduzida em relação às CTMs controle, e ainda, secreção reduzida de TGF- e IL-10 no sobrenadante das coculturas. Esses dados sugerem que as CTMs isoladas de pacientes com EM possuam alterações fenotípicas, transcricionais e funcionais. Embasados nesses achados, concluímos que as CTHs e as CTMs de pacientes com EM possuem alterações intrínsecas que podem estar relacionadas com a patogenia da doença. Uma vez que as CTMs sejam células com grande potencial terapêutico para controle da EM em pacientes refratários aos tratamentos convencionais, as alterações encontradas sugerem que CTMs de doadores saudáveis sejam mais adequadas em aplicações clínicas. / Bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stromal cells (MSCs) have been used as an autologous source to treat autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS). HSC give rise to all hematopoietic and immune system cells, and MSCs exhibit immunomodulatory properties by releasing soluble factors and by cell-cell interactions. Evidence indicates that bone marrow stem cells obtained from patients with autoimmune diseases may present intrinsic defects. To assess whether or not HSC and MSC of MS patients have intrinsic defects, the main objective of this study was to evaluate the differential gene expression profiles of HSC and MSC from MS patients before and after autologous HSC transplantation, and additionally, to evaluate the in vitro immunomodulatory ability of patient MSCs. Bone marrow HSC and MSCs were isolated from MS patients and healthy donors. HSCs were isolated by immunomagnetic columns and MSCs were isolated by gradient density and cultured until the third passage. MSCs were characterized according to morphology, immunophenotypic markers and cell differentiation into adipocytes and osteocytes. HSC and MSCs mRNAs were extracted, purified, and the gene expression profile was evaluated by microarray hybridizations, using a platform containing 44.000 probes. The immunomodulatory activity of patient and control MSCs was assessed by coculture assays with allogeneic lymphocytes. Cytokines were quantified in coculture supernatants by ELISA and CBA flex. This study was approved by the Ethics Committee of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirão Preto. The results showed that the patient HSCs exhibited a distinctive gene expression profile when compared to healthy HSCs, yielding 2.722 differentially expressed genes, involved in essential HSC signaling pathways for maintenance, proliferation and differentiation into specific lineages during hematopoiesis. Among these signaling pathways were included, apoptosis, Wnt, Notch, mTOR, PI3K/Akt and Ca/NFAT, suggesting that patient HSCs have significant intrinsic transcriptional alterations that may be associated with MS pathogenesis. Regarding MSCs isolated from MS patients, they exhibited senescence appearance, decreased expression of immunophenotypic markers, and also exhibited a distinctive gene expression profile in relation to healthy MSCs, yielding 618 genes differentially expressed genes, included in FGF and HGF signaling pathways, adhesion molecules, and genes involved in immunoregulation processes, such as IL-10, IL-6, TGFB1, IFNGR1, IFNGR2 and HGF. Coculture assays of control or patient MSCs with allogeneic lymphocytes showed that patient cells exhibited reduced antiproliferative activity as compared with controls, and also exhibited reduced secretion of TGF- and IL-10 cytokines in coculture supernatants. These data suggest that MSCs isolated from MS patients have phenotypic, functional and transcriptional defects, highlighting genes related to MSC maintenance, adhesion and immunomodulatory effects. According to these results, we concluded that patient HSCs and MSCs have intrinsic defects that may be associated with the disease per se. Considering that MSCs exhibit great therapeutic potential to control MS patients refractory to conventional treatment, the major MSCs alterations observed in this study indicate that healthy MSCs may be more suitable for MS cell therapy.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva das células pancreáticas produtoras de insulina. A imunossupressão em altas doses seguida do transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TACTH) constitui uma alternativa terapêutica recente e promissora para o DM-1 recém-diagnosticado, impedindo a progressão da destruição das células pancreáticas produtoras de insulina e induzindo independência insulínica por um período prolongado na maioria dos pacientes. O princípio dessa terapia baseia-se na eliminação das células autorreativas pela imunossupressão intensa e na reconstituição de um sistema imunológico novo e tolerante após o transplante. Com o objetivo de avaliar a função do timo e sua contribuição na geração do repertório de células T nos pacientes com DM-1 após o TACTH, nesse trabalho foram avaliados os níveis de T cell receptor excision circles (TRECs) em células T do sangue periférico e a diversidade do repertório de células T dos pacientes com DM-1 (n=23) antes e em diversos períodos após o transplante. A quantificação absoluta dos níveis de TRECs (número de moléculas de TRECs/100g de DNA) foi realizada pela técnica de PCR em tempo real e a avaliação do repertório de células T foi realizada pela técnica de TCRBV CDR3 Spectratyping. Dentre os vinte e três pacientes, vinte alcançaram a independência insulínica por períodos variáveis de tempo e três não responderam ao tratamento. Não foi observada a restrição do repertório de células T nos pacientes com DM-1 no período pré-transplante, ou seja, quando recém-diagnosticados. Foram identificadas cinco famílias V (7, 18, 19, 20 e 22) em expansão clonal nos pacientes com DM-1. As famílias V 7, 18, 19, 20 apresentaram-se em expansão clonal antes do transplante e se mantiveram com frequência elevada após o transplante, enquanto a família V 22 apresentou aumento da frequência somente nos períodos mais tardios após o transplante. Nos primeiros meses após o transplante, houve redução do número de moléculas de TRECs e restrição do repertório de células T. Contudo, um ano após o transplante, o número de moléculas de TRECs atingiram valores normais e o repertório de células T apresentou-se com ampla diversidade. Nossos resultados mostraram que o TACTH foi capaz de induzir mudanças na composição do repertório de células T dos pacientes com DM-1 após a terapia de IAD/TACTH, evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dos picos de CDR3 do TCR, sugerindo a reconstituição de um repertório de células T diverso até dois anos pós-transplante. Embora tenha ocorrido reativação da função tímica após o transplante, evidenciada pelo aumento dos níveis de TRECs de um ano e meio a cinco anos pós-transplante, a diversidade do repertório das células T diminuiu a partir de dois anos e meio pós-transplante, sugerindo uma reconstituição tímica de novo de células T naive que expressam preferencialmente algumas cadeias V. Estas evidências imunológicas poderiam explicar a melhora clínica (independência insulínica) temporária observada na maioria dos pacientes após a terapia de IAD/TACTH. / Type 1 diabetes mellitus (T1D) is an organ-specific autoimmune disease characterized by insulin-producing pancreatic cell destruction. High-dose immunosuppression followed by autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) is a recent and promising therapeutic approach for treatment of T1D, preventing the progress of destruction of pancreatic cells and inducing insulin independence for a prolonged period in most patients. The rationale of the AHSCT is based on the elimination of autoreactive cells by the intense immunosuppression and on the reconstitution of a new and tolerant immune system after transplantation. Aiming at assessing the thymic role in the production of new T cell repertoire in T1D patients after AHSCT, in this study was evaluated the levels of T cell receptor excision circles (TRECs) in T cells of peripheral blood as well as the clonality and diversity of T cell repertoire in T1D patients (n=23) before and several periods after transplantation. The absolute quantification of TRECs levels (number of molecules of TRECs/100ng of DNA) was performed by real-time PCR and the analysis of T cell repertoire was performed by TCRBV CDR3 Spectratyping. Among the twenty-three patients, twenty achieved insulin independence for variable periods and three did not respond to the treatment. The T cell repertoire in T1D patients was not restricted in pre-transplantation, i.e., when newly diagnosed. It was identified five V families (7, 18, 19, 20 e 22) in the clonal expansion in T1D patients. The V families 7, 18, 19, 20 were in clonal expansion before transplantation and maintained with high frequency after transplantation, whereas the V 22 family increased its frequency only in the later periods after transplantation. It was observed that the numbers of molecules of TRECs decreased and the T cell repertoire was restricted in the early months after transplantation. However, the levels of TRECs were normalized and the T cell repertoire showed diversity one year after transplantation. Our results indicate that AHSCT was able to induce changes in the composition of the T cell repertoire of patients after AHSCT, evidenced by qualitative and quantitative changes in the composition of T-cell receptor -chain CDR3 peaks, suggesting the reconstitution of diverse T cell repertoire up to two years after transplantation. Although there was reactivation of thymic function after transplantation, as evidenced by increased levels of TRECs from one and a half year to five years after transplantation, the diversity of the T cells repertoire decreased from two and a half years after transplantation, suggesting a reconstruction of new naive T cells that preferentially express some V chains. These immunological evidences could explain the temporary clinical improvement (insulin independence) observed in most patients after IAD / AHSCT therapy.

Em estudos anteriores desenvolvidos por este grupo de pesquisa uma expressão mais elevada de alvos transcricionais e componentes da via NF-kB, bem como altos níveis de NOTCH1, foi identificada em células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) quando comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO). Este grupo verificou ainda, por comparação das células CD34+ com as CD133+ (mais primitivas) que diversos fatores de transcrição (FT) envolvidos com o potencial de hemangioblasto, com a autorenovação das CTH, e com a diferenciação linfóide; como: RUNX1/AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXA9 e HOXB4 apresentaram-se mais expressos em células mais primitivas. A potencial participação das vias Notch e NF-kB na regulação destes FT tem importância conceitual e prática no entendimento da biologia das CTH, e dos processos envolvidos na diferenciação destas células. Com isto em vista, este projeto teve como objetivo, estudar o papel da via NF-kB e da via Notch na regulação destes FT. Para isso, um modelo experimental in vitro, de diferenciação de CTH CD34+ em linfócitos T, foi utilizado e a influência de fatores agonistas e inibidores farmacológicos destas vias, foram avaliados por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Nossos resultados evidenciam o papel da via Notch na regulação transcricional de HOXB4 e GATA3 em células-tronco hematopoéticas CD34+ humanas, o que foi confirmado com base na expressão dos alvos diretos de Notch (HEY1 e HES1). Notamos ainda, que a expressão dos transcritos HES1, GATA3 e HOXB4 é prejudicada pela síntese protéica das CTH, uma vez que quando empregamos o prétratamento com a droga CHX há aumento da transcrição dos mesmos. Também podemos inferir que a ação do TNF- é positiva sobre esses transcritos, já que quando o utilizamos há elevação do nível de expressão desses transcritos, com exceção a HES1. Em relação ao cocultivo das CTH com as células estromais de camundongos, verificamos que apenas a linhagem OP9-DL1 detém a capacidade de promover a diferenciação celular T, e isso foi comprovado pelo surgimento de células comprometidas com a linhagem linfocítica T, através da presença dos marcadores de superfície específico CD7+ e CD1a+. Esses resultados auxiliarão na compreensão dos mecanismos moleculares de regulação transcricional envolvidos não apenas na diferenciação de linfócitos T, mas também na manutenção de um estado mais primitivo das CTH. Este conhecimento pode vir a contribuir com o desenvolvimento ou otimização de protocolos laboratoriais visando à expansão de CTH ou geração de células T para usos terapêuticos. / In previous studies by this research group a higher expression of transcriptional targets and components via NF-kB, as well as high levels of NOTCH1, was identified in hematopoietic stem cells (HSC) CD34 + cells from umbilical cord blood (UCB) compared to CD34 + hematopoietic stem cells from bone marrow (BM). This group also found, by comparing the CD34 + cells with CD133 + (more primitive) that several transcription factors (TF) involved in the potential of hemangioblast, with self-renewal of hematopoietic stem cells and to differentiated lymphocytic; as Runx1 / AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXB4 and HOXA9 were more expressed in more primitive cells. The potential involvement of Notch signaling pathways and NF-kB in the regulation of FT has conceptual and practical importance in understanding the biology of HSC, and the processes involved in differentiation of these cells. With this in mind, this project aimed to study the role of NF-kB pathway and Notch signaling in the regulation of FT. For this, an experimental model in vitro differentiation of CD34 + hematopoietic stem cells into T lymphocytes, was used and the influence of pharmacological agonists and inhibitors of these pathways were evaluated by flow cytometry and real-time PCR. Our results highlight the role of Notch signaling in the transcriptional regulation of GATA3 and HOXB4 in hematopoietic stem cells CD34 + human, which was confirmed based on the expression of direct targets of Notch (HES1 and HEY1). We also note that the expression of transcripts HES1, GATA3 and HOXB4 protein synthesis is hampered by the HSC, since when we use the pre-treatment with the drug there CHX increased transcription thereof. We can also infer that the action of TNF- is positive about these transcripts, since when we use it for raising the level of expression of these transcripts, except the HES1. In relation to the HSC coculture with stromal cells of mice, we found that only the line-DL1 Op9 has the ability to promote T cell differentiation, and this was evidenced by the appearance of cells committed to the T lymphocyte lineage, through the presence of specific surface markers CD7 + and CD1a +. These results will help understand the molecular mechanisms of transcriptional regulation involved not only in the differentiation of T lymphocytes, but also in maintaining a more primitive state of HSC. This knowledge may contribute to the development or optimization of laboratory protocols aimed at the expansion of HSC or generation of T cells for therapeutic use.