Proefschrift Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Marianne de Boer-van den Berg. Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Maastricht. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift (Med.) Maastricht. / Ten dele eerder verschenen art. Lit. opg. - Samenvattingen in het Engels en Nederlands.

No description available.

"June, 2003" / Includes bibliographical references (leaves 169-200) / viii, 215 leaves : ill. (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, School of Molecular and Biomedical Science, Discipline of Biochemistry, 2004

Ribulose 1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase is activated by incubation with CO₂ and Mg²⁺. Several compounds are known to mediate this CO₂ dependent activation, including several chloroplast metabolites. A search, based on structural similarities to known activators, encountered more than twenty previously unreported effectors. Activators appear to share several common characteristics, including two anionic groups which usually occupy terminal positions on the molecule. Terminal groups on activators include carboxylate, phosphate, phosphonate, and sulfonate. Activators which do not have at least one phosphate or phosphonate terminal group have a hydroxyl or carboxyl containing side chain. Positive effectors change the response of the carboxylase by allowing activation at lower levels of CO₂ and/or Mg²⁺, and at lower pH values. Higher CO₂ concentrations also allow activation at lower pH values. The ratio between the carboxylase and oxygenase functions of this enzyme at air levels of CO₂ and O₂ does not change with effector induced changes in enzyme activity, suggesting that they share the same active site. There is an apparent difference in the response of the enzyme before and after purification to incubation in phosphate, and to inhibition by the substrate ribulose 1,5-biphosphate. These observations suggest that the isolated protein is different from the native enzyme. Several carboxylase activators are taken up by isolated chloroplasts in an exchange for phosphate catalyzed by the phosphate translocator. Included in this group is phosphonopropionate, a non-metabolized analogue of phosphoglycerate. Addition of this effector to chloroplasts under conditions of photosynthesis results in increased carboxylase activity, but a decrease in both ribulose 1,5-biphosphate levels and CO₂ fixation. There is a slow leakage of phosphate from isolated chloroplasts at room temperature. This leakage does not occur during illumination, nor at ice temperature, but increases with increasing hydroxide ion over physiological pH values. This slow leakage is probably an artifact of chloroplast isolation procedures. In isolated chloroplasts, phosphate levels appear to control the partition of photosynthate between starch formation and sugar phosphate export. During periods of net accumulation of starch in the chloroplast, there is concomitant degradation occurring, such that the accumulation of label into the starch fraction may not reflect the actual rate of starch synthesis.

Η μεγάλη σημασία και ο ρόλος της PEPCase στην φωτοσύνθεση και γενικότερα στην φυσιολογία φυτών φαίνεται από το ότι έχει χαρακτηριστεί από πολλούς ερευνητές ένζυμο κλειδί. Η μελέτη του έχει γίνει στόχος πολλών εργαστηρίων, όμως ο μηχανισμός της λειτουργίας του παραμένει εν μέρει ασαφής. Το ένζυμο είναι διαδεδομένο σε όλους τους φυτικούς οργανισμούς και πέρα από το κεντρικό ρόλο του στην C4 φωτοσύνθεση και στην CAM φωτοσυνθετική οδό, φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο και σε άλλες επιμέρους φυσιολογικές διαδικασίες. Από προηγούμενη εμπειρία του εργαστηρίου μας είναι γνωστό ότι η PEPCase παρουσιάζει διαφορές στις καταλυτικές ιδιότητες της στα διάφορα είδη των C4 φυτών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα από το φυτό σόργο Sorghum bicolor (L) Moench. Στόχος αυτής της εργασίας είναι η μελέτη των παραμέτρων που επηρεάζουν την σταθερότητα του ενζύμου καθώς και οι καταλυτικές του ιδιότητες του. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων συνοψίζονται παρακάτω: 1. Το άριστο pΗ της ενζυμικής αντίδρασης είναι σημαντικός παράγοντας για την ρύθμιση της δραστικότητας του ενζύμου in vitro. Το άριστο pΗ της ενζυμικής αντίδρασης για τα φυτά του αγροκτήματος ήταν κοντά στο 7.0 και για τα φυτά που καλλιεργήθηκαν στα δοχεία 7,2. Παρατηρούμε επίσης ότι η ενεργότητα της PEPCase στα φύλλα από φυτά που καλλιεργήθηκαν στον ελεγχόμενο χώρο είναι πολύ χαμηλότερη εκείνης των φυτών του αγρού. 2. H δραστικότητα του ενζύμου εξαρτάται από την ηλικία των φυλλών και συνεπώς με το ύψος έκφυσης τους πάνω στο βλαστό. 3. Από την καμπύλη κορεσμού του ενζύμου (φυτά από το αγρόκτημα) ως προς το ΡΕΡ απουσία μεταβολιτών φαίνεται ότι σε pH 7,0 το ένζυμο παρουσιάζει το ένζυμο παρουσιάζει κανονική κινητική Michaelis-Menten (ορθογώνια υπερβολή) με Umax =15,38 μM CO2 min-1g-1 ν.β.φύλλων και Km = 0,36 mM. 4. Οι G6-P και Gly είναι επαγωγείς του ενζύμου PEPCase. Η G6-P αυξάνει την δραστικότητα του ενζύμου όταν η συγκέντρωση της αυξάνει από 0,5 εώς 2,0 mM, όπου παρατηρείται το μέγιστο. Όσον αφορά την επίδραση της γλυκίνης στο ένζυμο, παρατηρούμε ότι έως τα 2 mM, η επίδραση της είναι θετική στο ένζυμο, δηλαδή αυξάνει την δραστικότητα του ενώ περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωση της γλυκίνης δεν έχει καμιά επίδραση στην ενεργότητα του ενζύμου. 5. Το L-μηλικό οξύ είναι ισχυρός αναστολέας της PEPCase αφού μειώνει την δραστικότητα της PEPCase καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του, με μέγιστη επίδραση σε συγκέντρωση 5 mM. 6. Τόσο η γλυκίνη όσο η 6-φωσφορογλυκόζη, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό δεν επιδρούν σημαντικά στο Umax του ενζύμου PEPCase (από φυτά που έχουν αναπτυχθεί στον ελεγχόμενο θάλαμο). Και οι δύο μεταβολίτες όμως μείωσαν το Κm ενζύμου. Η μεγαλύτερη μείωση παρατηρήθηκε όταν επέδρασαν μαζί οι δύο μεταβολίτες. Επιπλέον παρατηρούμε ότι παρουσία και των δύο επαγωγεών, (μεμονωμένα ή συνδυαστικά) η κινητική του ενζύμου συγκλίνει περισσότερο σε κινητική Michaelis-Menten (ορθογώνια υπερβολή). 7. Η PEPCase είναι ένα φωτορυθμιζόμενο ένζυμο μέσω μίας διαδικασίας η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του Vmax του ενζύμου και την μείωση της ευαισθησίας του στο μηλικό στο ημέρας. 8. Υπάρχουν κάποιες διαφοροποιήσεις μεταξύ του ενζύμου που εκχυλίζεται από φυτά που έχουν φωτιστεί και εκείνου που εκχυλίζεται από φυτά που έχουν παραμείνει στο σκοτάδι για πολλές ώρες. Με βάση τις καμπύλες κορεσμού το ένζυμο ημέρας εμφανίζει μεγαλύτερο Umax και στις τρείς περιπτώσεις. Το ένζυμο νύχτας φαίνεται περισσότερο ευαίσθητο στην επίδραση του μηλικού από το ένζυμο της ημέρας. Όσον αφορά το Km παρατηρούμε ότι στην καμπύλη κορεσμού απουσία μεταβολιτών (control) το Km είναι μικρότερο στο ένζυμο ημέρας ενώ στην καμπύλη κορεσμού παρουσία G6-P, το Km είναι παρόμοιο και στα δύο ένζυμα. Από την καμπύλη κορεσμού παρουσία μηλικού, παρατηρούμε ότι το Km επηρεάστηκε (αυξήθηκε) περισσότερο στο ένζυμο ημέρας. 9. Η ολική δραστηριότητα του ενζύμου που εκχυλίζεται κάθε φορά παρουσιάζει μεγάλες διακυμάνσεις που προφανώς οφείλονται σε διάφορους παράγοντες όπως οι συνθήκες εκχύλισης του ενζύμου και η συμπεριφορά του σε αραιά διαλύματα. Αυτό πιθανόν να είναι και το αίτιο της ψεύδοσιγμοειδικοτητας που παρουσιάζουν οι καμπύλες κορεσμού του ενζύμου (ειδικά με την επίδραση του μηλικού). / PEPCase has been characterised as a key-enzyme because of its important role in photosynthesis and generally in plant physiology. It has been the subject of study of many laboratories but until now the properties and its biochemical operations are unclean. This enzyme exists in all plants and plays a central role in C4 and CAM photosynthesis. From our laboratory previous experience, it is known that PEPCase shows different properties and regulation among C4 plants. In the present study, leaves from Sorghum bicolor (L) Moench were used for the isolation of the enzyme and the experiment plants were grown in University farm and a shadehouse with balanced conditions. The aim of this thesis was the study of PEPCase enzyme properties and catalytic behaviour. The conclusions are presented below: 1. The optimum pH of the enzyme reaction is a very impotant factor of enzyme activity and was 7,0 for the enzyme extracted from plants cultivated in farm and 7,2 for the enzyme extracted from plants grown in the shadehouse. 2. The enzymic activity is affected by leave height on the plant and thus the age of the leaves. 3. The enzyme seems to follow Michaelis-Menten kinetics in vitro with Vmax= 15,38 μM CO2 min-1g-1 of wet weight of leaves and Km= 0,36 mM. 4. G6-P and Gly stimulate the enzyme at low concentrations near to 2 mM. 5. L-malate is a strong inhibitor of the enzyme with maximum inhibition at 5 mM. 6. G6-P and Gly, separately or together, do not affect the Vmax of the enzyme but decrease its Km. The presence of these metabolites in the solution of the reaction, does not affect enzyme kinetics, which appears more as Michaelis-Menten kinetics than sigmoidical kinetics. 7. PEPCase activity is light-dependent and exerted by post-translational regulation. The effect of this mechanism is that the light-enzyme is more activated and less malate sensitive by dark-enzyme. 8. There are differencies between the enzyme extracted from light-induced plants and the enzyme extracted from plants remained in dark for several hours. Light-enzyme has higher Vmax and lower Km than the dark-enzyme. L-malate affects more the dark-enzyme. 9. Enzyme activity varries possibly because of the enzyme extraction and experiment conditions and in less concentrated solutions.

Bibliography: leaves 153-198. / viii, 198, [117] leaves, [14] leaves of plates : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1999?

Bibliography: leaves 148-157 / viii, 157, [126] leaves : ill ; 28 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1985

Thesis (Doctoral)--Justus-Liebig-Universität Giessen, 1983.