Les mécanismes physiopathologiques associés à la progression du rétrécissement aortique calcifié (RAC) restent mal étudiés. La calcification valvulaire étant une étape clé dans le développement du RAC nous avons testé les effets du calcium (Ca2+) sur la calcification des cellules interstitielles de la valve humaine (hVICs) et évalué l'implication du récepteur sensible au calcium (CaSR). Les résultats ont permis de montrer, et ce pour la première fois, que les hVICs expriment un CaSR fonctionnel. L'activation du CaSR stimule la transformation ostéogénique des hVICs via un mécanisme dépendant à la fois du BMP2 et de l'ostéopontine et son inhibition freine la progression de la calcification. Ces premiers résultats permettent d'identifier le CaSR comme une cible thérapeutique potentielle du RAC. Le magnésium (Mg2+) est un inhibiteur connu de la calcification vasculaire qui agit via le CaSR. Nous montrons dans ce travail que le Mg2+ inhibe la calcification des hVICs induite par le Ca2+ via un mécanisme indépendant du CaSR mais dépendant, au moins partiellement, du canal TRPM7. Ces résultats in vitro ont été complétés par une étude clinique dans laquelle nous démontrons que le Mg2+ sérique sous sa forme total ou ionisée n'est pas corrélé aux scores de calcification valvulaire et n'apparait pas comme un facteur protecteur contre la progression de la calcification valvulaire / The pathophysiological mechanisms associated with Calcific Aortic Valve Disease (CAVD) progression remain poorly understood. Valve calcification being a key step in the development of CAVD, we tested the effect of high extracellular concentration of calcium (Ca2+) on calcification of human interstitial valve cells (hVICs) and assessed the possible involvement of the calcium sensing receptor (CaSR). We demonstrated, for the first time, that hVICs expressed a functional CaSR. Its activation is associated with osteoblastic differentiation most likely via a BMP2 / OPN dependent mechanism while its inhibition limited the development of calcification. These first results identify the CaSR as a possible therapeutic target in CAVD. Magnesium (Mg2+) is a well- known inhibitor of vascular calcification that operates through the CaSR. In our work, we demonstrated that Mg2+ inhibit also the hVICs calcification induced by Ca2+ through a mechanism independent of the CaSR but dependent, at least partially, of TRPM7 channel. These in vitro results were completed by a clinical study demonstrating that the ionized and total form of Mg2+ are not protector factors against the progression of aortic valve calcification

Colon cancer is characterized by the progressive loss of E-cadherin, a Ca2+-dependent adherens junction component and epithelial marker. Furthermore, inhibition of the phosphatase SHP2, essential in the cell survival signaling via the epidermal growth factor receptor pathway, has been shown to upregulate E-cadherin in breast cancer cell lines. This suggests that unregulated increases in SHP2 may promote a cancer cell phenotype. The aim of this study was to define molecular mechanisms by which dietary Ca2+ is chemoprotective against colon cancer. The extracellular Ca2+-sensing receptor (CaSR) has been implicated in this process and we speculated that there was a relationship between CaSR activation and E-cadherin and SHP2 expression levels on colonic epithelia. A colonic adenocarcinoma cell line which lacks endogenous E-cadherin expression, SW480, was used as a model cell. CaSR levels were manipulated by transient transfection and E-cadherin and SHP2 expression levels were determined by Western blotting. The E-cadherin expression pattern was also assessed with RT-PCR and immunocytochemistry. We found that after CaSR activation via Ca2+ or other known CaSR agonists (neomycin sulphate, spermine), E-cadherin expression was increased and SHP2 expression was decreased. However, the E-cadherin expression pattern was altered in the presence of a dominant-negative CaSR (R185Q). Furthermore, pharmacological inhibition of p38 MAPK inhibited CaSR-mediated increases of E-cadherin protein in SW480 cells. Inhibition of p38 MAPK had no effect on CaSR-stimulation of E-cadherin transcript or promoter activity. SHP2 decreases usually seen after Ca2+-treatment were reduced after pharmacological inhibition of JNK in the presence of high Ca2+. CaSR activation also increased cell-cell adherence as assessed by electronic cell sizing and this adherence was lost when both CaSR-mediated changes in E-cadherin and SHP2 expression were inhibited. We conclude that CaSR activation in colonic epithelial cancer cells stimulated E-cadherin increases, through a mechanism involving p38 MAPK, as well as inhibited SHP2 expression, through a JNK-mediated mechanism. Further, these protein changes post-CaSR activation cause an increase in cell-cell adherence. Our results suggest that the chemoprotective nature of dietary Ca2+ supplements may involve reciprocal regulation of E-cadherin and SHP2 via the CaSR. / Thesis (Master, Physiology) -- Queen's University, 2009-06-09 17:56:44.843

Nous avons montré un rôle d’un canal K+, le canal SK3, dans la migration des cellules cancéreuses de sein MDA-MB-435s et le développement de métastases ostéolytiques du cancer du sein. Lors de l’ostéolyse, la [Ca²+]ext augmente dans le microenvironnement osseux. Nous avons voulu déterminer si cette élévation de [Ca²+]ext, pouvait moduler l’expression et l’activité du canal SK3. Nous avons montré que l’augmentation de la [Ca²+]ext: i) favorise l’expression du canal SK3. Cet effet fait intervenir le récepteur au calcium (CaSR), qui en diminuant la [AMPc]int réduit l’activité de la PKA et lève ainsi son inhibition de la transcription du gène KCNN3 (codant pour SK3) ; ii) favorise la migration cellulaire dépendante du canal SK3, mécanisme impliquant également le CaSR ; iii) active le canal SK3 qui, par ailleurs, voit son activité réduite par l’élévation d’AMPc intracellulaire. De plus, l’augmentation d’AMPc délocalise un canal calcique partenaire de SK3, le canal Orai1, et diminue l’entrée constitutive de Ca²+ et la migration dépendantes du canal SK3. En conclusion, nos résultats montrent que l’expression et l’activité de SK3 sont régulées par l’AMPc et le Ca2+ extracellulaire. Ceci permet d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant l’AMPc pour le traitement des métastases osseuses du cancer du sein. / We showed that a K+ channel, SK3 channel, is a mediator of MDA-MB-435s breast cancer cells migration and of osteolytic bone metastasis development of breast cancer. Since [Ca²+]out rises during osteolysis, in bone microenvironment, we study if this [Ca²+]out elevation could modulate SK3 expression and activity. We show that [Ca²+]out elevation: i) increases SK3 expression threw CaSR activation which, in turn, decreases [cAMP]int and PKA activation, leading to loss of its inhibitory effect on KCNN3 transcription; ii) increases SK3-dependent migration threw CaSR activation; iii) increases SK3 channel activity that is in addition, decreased by [cAMP]int elevation. Furthermore, cAMP elevation moves the Ca2+ channel Orai1 (SK3 partner) outside of lipid rafts and reduces the SK3 dependent-constitutive Ca²+ entry and cell migration. Our results show that both SK3 expression and activity are regulated by cAMP and extracellular Ca²+. These results underscore an innovative opportunity to use therapeutic approaches targeting cAMP for the treatment of breast cancer bone metastasis.

As a highly versatile signal, Ca2+ operates over a wide temporal range to regulate many different cellular processes, impacting nearly every aspect of cellular life including excitability, exocytosis, motility, apoptosis, and transcription. While it has been well recognized that Ca2+ acts as both a second messenger to regulate cell-cell communication upon external stimuli and as a first messenger to integrate extracellular with intracellular signaling in various cell types. Molecular bases for such regulation and related human diseases are largely hampered by the challenges related to key membrane proteins. In the present study, we first investigated the regulatory role of intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) on Connexin45 (Cx45) gap junction through a ubiquitous Ca2+ sensor protein-Calmodulin (CaM). Using bioluminescence resonance energy transfer assay, this study provides the first evidence of direct association of Cx45 and CaM in a Ca2+-dependent manner in cells. Complementary approaches including bioinformatics analysis and various biophysical methods identified a putative CaM-binding site in the intracellular loop of Cx45 with high Ca2+/CaM-binding affinity and Ca2+-dependent binding mode that is different from alpha family of connexins. To understand the role of extracellular calcium in regulation of gap junction hemichannels, we would like to prove a possible Ca2+-binding site predicted by our computational algorithm MUGSR in Connexin 26 (Cx26) through mutagenesis study, metal binding affinity measurement, conformational changes examination of purified Cx26 protein from Sf9; however, we failed to achieve this goal due to either the limitation of available methods or lethal effect of mutating the predicted Ca2+-binding ligand. Additionally, in this study, we identified a putative Ca2+-binding site in metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) and demonstrated the importance of this Ca2+-binding site in activation of mGluR5 and modulating the actions of other orthosteric ligands on mGluR5. In addition, we successfully solved the first crystal structure of the extracellular domain of Ca2+-sensing receptor (CaSR) bound with Mg2+ and an unexpected Trp derivative. The extensive study of mechanism of CaSR function specifically through Mg2+-binding site and the unexpected ligand-binding site was done using several cell-based assays in wild type CaSR and mutants. Studies in this dissertation provides more information on how Ca2+ regulates gap junction channels, modulates mGluR5 activities and structural basis for regulation of CaSR by Mg2+ and an unexpected Trp derivative co-agonist.

This thesis is mainly focused on FRC (Frame Rate Control) method which can be used for LCD panels, where a new algorithm is proposed to improve the flicker problem. The proposed algorithm can be implemented by simple digital circuits with low power consumption. The proposed design can be applied in both mono- and color- STN panels. It can generate 32768 colors in a panel without any flicker and motion line problems, which can only allow 8 colors originally. The major contribution in this thesis is to add a location number to each pixel of the panel.Notably, the numbers for all the pixels can not be a regular pattern. Otherwise, the flicker problem is resolved at the expense of a serious motion line issue. The consequence is poor display quality. To resolve both the flicker and motion line problem, we propose to employ a PRSG (Pseudo Random Sequence Generator) which generates a non-regular number sequence for all the pixels. Therefore, all the ON pixels can be dispersed on the panel in all frames.

Parathyroid hormone (PTH) secretion maintains free-ionised extracellular calcium (Ca2+o) homeostasis under the control of the calcium-sensing receptor (CaR). In humans and dogs, blood acidosis and alkalosis is associated with increased or suppressed PTH secretion respectively. Furthermore, large (1.0 pH unit) changes in extracellular pH (pHo) alter Ca2+o sensitivity of the CaR in CaR-transfected HEK-293 cells (CaR-HEK). Indeed, it has been found in this laboratory that even pathophysiological acidosis (pH 7.2) renders CaR less sensitive to Ca2+o while pathophysiological alkalosis (pH 7.6) increases its Ca2+o sensitivity, both in CaR-HEK and parathyroid cells. If true in vivo, then CaR’s pHo sensitivity might represent a mechanistic link between metabolic acidosis and hyperparathyroidism in ageing and renal disease. However, in acidosis one might speculate that the additional H+ could displace Ca2+ bound to plasma albumin, thus increasing free-Ca2+ concentration and so compensating for the decreased CaR responsiveness. Therefore, I first demonstrated that a physiologically-relevant concentration of albumin (5% w/v) failed to overcome the inhibitory effect of pH 7.2 or stimulatory effect of pH 7.6 on CaR-induced intracellular Ca2+ (Ca2+i) mobilisation. Determining the molecular basis of CaR pHo sensitivity would help explain cationic activation of CaR and permit the generation of experimental CaR models that specifically lack pHo sensitivity. With extracellular histidine and free cysteine residues the most likely candidates for pHo sensing (given their sidechains’ pK values), all 17 such CaR residues were mutated to non-ionisable residues. However, none of the resulting CaR mutants exhibited significantly decreased CaR pHo sensitivity. Even co-mutation of the two residues whose individual mutation appeared to elicit modest reductions (CaRH429V and CaRH495V) failed to exhibit any change in CaR pHo sensitivity. I conclude therefore, that neither extracellular histidine nor free cysteine residues account for CaR pHo sensitivity. Next, it is known that cytosolic cAMP drives PTH secretion in vivo and that cAMP potentiates Ca2+o-induced Ca2+i mobilisation in CaR-HEK cells. Given the physiological importance of tightly controlled PTH secretion and Ca2+o homeostasis, here I investigated the influence of cAMP on CaR signalling in CaR-HEK cells. Agents that increase cytosolic cAMP levels such as forskolin and isoproterenol potentiated Ca2+o-induced Ca2+i mobilisation and lowered the Ca2+o threshold for Ca2+i mobilisation. Indeed, forskolin lowered the EC50 for Ca2+o on CaR (2.3 ± 0.1 vs. 3.0 ± 0.1 mM control, P<0.001). Forskolin also potentiated CaR-induced ERK phosphorylation; however protein kinase A activation appeared uninvolved in any of these effects. Pertussis toxin, used to block CaR-induced suppression of cAMP accumulation, also lowered the Ca2+o threshold for Ca2+i mobilisation though appeared to do so by increasing efficacy (Emax). Furthermore, mutation of the CaR’s two putative PKA consensus sequences (CaRS899 and CaRS900) to a non-phosphorylatable residue (alanine) failed to alter the potency of Ca2+o for CaR or attenuate the forskolin response. In contrast, phosphomimetic mutation of CaRS899 (to aspartate) did increase CaR sensitivity to Ca2+o. Together this suggests that PKA-mediated CaRS899 phosphorylation could potentiate CaR activity but that this does not occur following Ca2+o treatment in CaR-HEK cells. Together, these data show that cAMP regulates the Ca2+o threshold for Ca2+i mobilisation, thus helping to explain differential efficacy between CaR downstream signals. If true in vivo, this could help explain how multiple physiological signal inputs may be integrated in parathyroid cells.

Die Prävalenz von Adipositas, definiert durch einen BMI >30 kg/m2, und assoziierter Erkrankungen wie Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM), kardiovaskulärer Erkrankungen, und einiger Krebsentitäten nimmt weltweit dramatisch zu und bedingt das erhöhte Mortalitätsrisiko dieser Patientengruppe (Kopelman 2000; Stevens et al. 2012). Daneben lässt sich oft eine Adipositas-assoziierte, geringgrade, chronische Entzündung beobachten, die in den letzten Jahren als entscheidender Faktor in der Pathogenese dieser Komorbiditäten erkannt wurde (Spranger et al. 2003). Als Reaktion auf metabolische Veränderungen im viszeralen Fettgewebe (VAT) wird das Immunsystem aktiviert und Immunzellen mobilisiert (Strissel et al. 2007; O’Rourke et al. 2011). Besonders die Zahl der Fettgewebsmakrophagen (ATM) nimmt durch lokale Proliferation und vermehrte Einwanderung von Monozyten um ein Vielfaches zu, bis sie die dominante Immunzellpopulation im VAT darstellen (Weisberg et al. 2003). Sie sind durch einen proinflammatorischen M1-Phänotyp gekennzeichnet und sezernieren Zytokine wie Il-1β und IL-18, die nach Ausschwemmung in den peripheren Blutkreislauf eine systemische Immunantwort auslösen und die Sensitivität der Gewebe für Insulin über molekulare Wechselwirkungen erheblich abschwächen (Rui et al. 2002; Castoldi et al. 2016). Die daraus entstehende Insulinresistenz und schließlich T2DM wird deshalb nunmehr als Folge einer entzündlichen Fettgewebsdysfunktion verstanden, in deren Pathogenese die aktivierten ATM eine Schlüsselrolle einnehmen (Donath und Shoelson 2011). Die Produktion von IL-1β und IL-18 wird über einen zytosolischen Proteinkomplex, das Inflammasom, reguliert. Die Aktivierung dessen erfolgt nach initialer Sensitivierung durch Bindung eines Botenstoffs an den Rezeptor NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) (Groslambert und Py 2018). Zu den diversen Faktoren, die NLRP3 aktivieren, gehört die G-Protein-vermittelte Aktivierung durch extrazelluläres Kalzium (exCa2+) bei Bindung an den Calcium-sensing Rezeptor (CaSR) (Lee et al. 2012; Rossol et al. 2012). In einem Zellmodell mit humanen, aus peripheren Monozyten differenzierten Makrophagen (MDM) konnte nach Stimulation der Zellen mit exCa2+ eine dosisabhängige Steigerung der IL-1β-Produktion verzeichnet werden (Thrum et al. 2019, Manuskript eingereicht). Der erste Teil dieser Arbeit widmete sich deshalb der Frage, ob MDM bei Adipositas stärker als im schlanken Zustand auf exCa2+ reagieren und dieses Ion in der Folge als Faktor diskutiert werden müsste, der maßgeblich zur Entzündung im VAT beiträgt. Im Rahmen einer klinischen Studie wurden 31 adipöse und 23 nichtadipöse Probanden rekrutiert, die sich einer klinischen Untersuchung und Blutentnahme unterzogen. Als Zellmodell dienten MDM, die über sieben Tage in Medium mit 10 % autologem humanem Serum gereift waren, um eine phänotypische Differenzierung wie im Milieu des VAT zu gewährleisten. Nach einem Priming mit Lipopolysaccharid (LPS) wurden die Zellen mit exCa2 stimuliert und anschließend die IL-1β-Konzentration im Überstand mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ermittelt. Tatsächlich ließ sich eine deutlich höhere Zytokinexpression in der adipösen Kohorte nachweisen. Von diesen Probanden wiesen 20 erhöhte Werte des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein (CRP) im Blut auf (> 5 mg/l), was nach Ausschluss anderer Ursachen als Zeichen einer geringgradigen, Adipositas-induzierten Entzündung gewertet wurde. Elf der adipösen Probanden zeigten CRP-Werte < 5 mg/l. Eine im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich erhöhte IL-1β-Konzentration auch in dieser Gruppe ließ darauf schließen, dass die gesteigerte entzündliche Aktivität der MDM einer klinisch messbaren systemischen Aktivierung des Immunsystems vorausgeht und somit wahrscheinlich nicht Folge, sondern Mitverursacher der Adipositas-assoziierten Entzündung ist. Die sensitivere Reaktion der MDM in der adipösen Kohorte kann unterschiedlich interpretiert werden. Zum einen ist es möglich, dass eine bei Adipositas erhöhte Expression der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms die zelluläre Antwort auf aktivierende Reize wie exCa2+ verstärkt (Stienstra et al. 2010; Vandanmagsar et al. 2011). Zum anderen könnte ein höherer CaSR-Besatz an der Oberfläche der MDM bei Adipositas speziell das exCa2+ zum Gefahrensignal rangieren lassen (Malecki et al. 2013). Dafür spricht, dass sich die Werte des ionisierten Kalziums im Plasma zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschieden, sich jedoch ausschließlich in der adipösen Kohorte eine positive Korrelation zwischen ionisiertem Plasma-Kalzium und IL-1β-Sekretion nach Stimulation mit exCa2+ abzeichnete. In einem nächsten Schritt wäre es nötig, die Expression des CaSR und der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms der ATM bei Adipositas und im schlanken Zustand zu untersuchen. Ein weiteres Augenmerk lag auf der Beeinflussung der Aktivierung der ATM durch Faktoren, die das Milieu im VAT bestimmen. Hier wurden in den letzten Jahren besonders Mikrogewebshypoxie und Adipokine (wie Chemerin, Leptin, Progranulin oder FABP4) als proinflammatorische Mediatoren beschrieben (O’Rourke et al. 2011; Jung und Choi 2014). Um zu untersuchen, ob ein kostimulatorischer Einfluss dieser Faktoren auf die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ vorliegt, wurden MDM nichtadipöser Probanden mit und ohne Hypoxie bzw. ausgewählte Adipokine stimuliert. Während es unter dem Einfluss von Hypoxie zwar nicht absolut, aber dafür schon bei geringeren exCa2+-Konzentrationen zu einem Anstieg der IL-1β-Sekretion kam, konnte für die Adipokine weder nach Differenzierung mit ebenjenen und anschließender Stimulation, noch bei Kostimulation eine signifikante Veränderung in der Reaktion der MDM festgestellt werden. Für Zellen in hypoxischer Umgebung wurde eine erhöhte Expression proinflammatorischer Zytokine oder auch von CaSR beschrieben, was die Steigerung der Sensitivität gegenüber exCa2+ erklären würde (Yu et al. 2011; Pak et al. 2016). Auch hier sind weitere Studien mit komplexeren Systemen nötig, um die Abläufe in ihrer Gänze darzustellen. Ein dritter Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der fluoreszenzmikroskopischen Darstellung der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ und von ASC-Specks. Das Protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) ist Komponente des NLRP3-Inflammasoms und akkumuliert nach dessen Aktivierung im Zellplasma. Dort formt es einen Komplex, der Speck genannt wird und nach dem Zelltod umliegende Zellen stimulieren und eine Ausbreitung der Entzündung vorantreiben kann (Masumoto et al. 1999; Franklin et al. 2014). Leider gelang es im Rahmen dieser Doktorarbeit nicht, die Entstehung eines Specks zu zeigen. Nach Anfärbung von mit LPS und exCa2+ stimulierten MDM durch fluoreszenz-markierte Antikörper gegen ASC und NLRP3, konnten neben einer über die Zeit zunehmenden Expression dieser Proteine auch Strukturen gesehen werden, bei denen es sich um Specks handeln könnte. Auch wenn der Beweis dafür fehlt, stellt dies einen interessanten Ansatz dar, der in zukünftigen Studien weiter verfolgt werden sollte, besonders mit Hinblick auf die Fragen, ob im VAT bei Adipositas mehr ASC-Specks vorhanden sind, ob die Zellen adipöser und schlanker Organismen unterschiedlich darauf reagieren und ob ggf. eine Kostimulation von ASC-Specks und exCa2+ vorliegt. Diese Arbeit trägt dazu bei, unser Verständnis der komplexen Abläufe bei Adipositas zu verbessern und die entscheidende Funktion der Fettgewebsmakrophagen in der Entstehung der Adipositas-assoziierten Entzündung zu belegen. Es konnte gezeigt werden, dass extrazelluläres Kalzium bei Adipositas einen wichtigen Einflussfaktor für die Aktivierung der Makrophagen darstellt. In Zukunft kann dies als Anknüpfungspunkt für weitere Forschungsprojekte dienen und so bei der Entwicklung neuer Medikamente und innovativer Biomarker zur Bekämpfung der stetigen Zunahme von Adipositas und der Adipositas-assoziierten Mortalität helfen.

Monocytes and macrophages are mediator cells of cartilage and bone erosion in the synovia of rheumatoid arthritis (RA) patients due to secretion of the inflammatory cytokine Interleukin-1β (IL-1β). Calcium, phosphate and fetuin are liberated from the affected bone matrix, and the formation of calciproteinparticles (CPPs) is likely. IL-1β production in monocytes in vitro is stimulated by high concentrations of extracellular calcium. Additionally, the rise of extracellular calcium concentrations leads to increased macropinocytosis in mononuclear phagocytes. Flow cytometry analyses in this study show that peripheral blood monocytes from patients with RA perform more calcium stimulated macropinocytosis of the fluorescent dye calcein than monocytes from healthy donors. Stimulation of monocytes with calcium and preformed CPPs leads to more IL-1β production, quantified using ELISA, by monocytes from RA patients. Experiments with macrophages show similar results. Furthermore calcium-stimulated macropinocytosis and IL-1β secretion are significantly positively correlated. However, there was no connection of in vitro findings and the severity of RA in patients.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatoide Arthritis 1 1.1.1 Epidemiologie und Klinik der rheumatoiden Arthritis 1 1.1.2 Ätiopathogenese der rheumatoiden Arthritis 1 1.2 Monozyten und Makrophagen 3 1.2.1 Inflammasomaktivierung und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen 4 1.2.2 Makropinozytose in Monozyten und Makrophagen 6 1.2.3 Beitrag der Monozyten und Makrophagen zur rheumatoiden Arthritis 7 1.3 Kalzium – lokale Dysregulation trotz systemischer Regulation 9 1.3.1 Entstehung von Kalziumproteinpartikeln 10 1.3.2 Kurzportrait des G-Protein-gekoppelten Kalziumrezeptors CaSR 11 2 Fragestellungen 13 3 Forschungsdesign, Material und Methoden 15 3.1 Forschungsdesign 15 3.2 Materialien 15 3.2.1 Laborgeräte 16 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 17 3.2.3 Materialien und Chemikalien 17 3.2.4 Medien, Lösungen und Puffer 19 3.2.5 Stimulanzien und Inhibitoren 20 3.2.6 Fluoreszenzfarbstoffe 20 3.2.7 Software 20 3.3 Methoden 21 3.3.1 Separation von PBMCs mittels Ficolldichtegradientenzentrifugation 21 3.3.2 Separation von Monozyten mittels negativer Magnetseparation 22 3.3.3 Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in Zellkulturbeuteln 23 3.3.4 Makropinozytose von Monozyten und Makrophagen in der Durchflusszytometrie 23 3.3.4.1 Makropinozytose von Calcein in Monozyten 24 3.3.4.2 Makropinozytose fluoreszenzgefärbter Kalziumproteinpartikel in Monozyten und Makrophagen 25 3.3.4.3 Inhibition der Makropinozytose in Monozyten 26 3.3.4.4 Auswertung der am Durchflusszytometer generierten Rohdaten mit FlowJo 26 3.3.5 Makropinozytose von Monozyten in der Fluoreszenzmikroskopie 28 3.3.6 Bestimmung der Interleukin-1β-Produktion von Monozyten und Makrophagen mittels ELISA 29 3.3.7 Erhebung des DAS28 33 3.3.8 Bestimmung von Laborparametern 33 3.4 Statistische Auswertung 33 4 Ergebnisse 35 4.1 Charakterisierung der Kohorten 35 4.2 Vorversuche zur Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffes für die Detektion der Makropinozytose 37 4.3 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 39 4.3.1 Kalziumstimulierte Calceinaufnahme von Monozyten 39 4.3.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion von Monozyten 44 4.4 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 47 4.4.1 Kalziumstimulierte Aufnahme fluoreszierender Kalziumproteinpartikel 47 4.4.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion in Monozyten unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 51 4.5 Stimulation von Makrophagen mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 53 4.5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytose von fluoreszierenden Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 53 4.5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion mit und ohne Zugabe von Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 54 4.5.3. Visualisierung von Monozyten und Makrophagen nach 16 Stunden Inkubation 57 4.6 Korrelation zwischen kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion 59 5 Diskussion 61 5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytoseaktivität von Monozyten und Makrophagen 61 5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 64 5.2.1 Auswirkung der Phosphatkonzentration im Zellkulturmedium auf die kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 65 5.2.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 66 5.3 Zusammenhang von kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 70 5.4 Ausblick und offene Fragen 71 6 Zusammenfassung der Arbeit 73 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 88 9 Danksagung 89