Denne oppgaven har hatt som mål å finne egnete multicolor antistoffkombinasjoner for identifisering av B-cellepopulasjoner i blod og benmarg ved hjelp av flowcytometrisk immunfenotyping. B-cellepopulasjoner av interesse er maligne B-cellekloner ved ulike typer B-cellelymfomer, og i tillegg normale B-cellepopulasjoner i blod som undersøkes i forhold til immunsvikttilstander. Dette innebærer å velge ut passende antistoffkloner og fluorokromer som kan benyttes sammen i antistoffkombinasjoner. For å stadfeste dette er det blitt utført titrering av alle antistoffer og annen kvalitetssikring av kombinasjonene, noe som har vært vellykket med noen få unntak. I tillegg er de nye multicolor-kombinasjonene sammenlignet med gammel metode. De to metodene viser ingen signifikant forskjell fra hverandre på 5 % nivå. For å identifisere maligne B-cellekloner er det tatt utgangspunkt i europeiske retningslinjer utarbeidet av EuroFlow-konsortiumet. Fem multicolor-kombinasjoner er testet ut og tatt i bruk, og ved hjelp av avanserte analysestrategier med spesialtilpasset softwareprogram er det oppnådd å skille mellom seks ulike typer B-cellelymfomer på grunnlag av unike immunfenotypeprofiler ut fra opptil 29 parametre. Diagnose kan settes for fire av de seks B-cellelymfomene ut fra immunfenotypeprofil.Det er også blitt utarbeidet og tatt i bruk to multicolor-kombinasjoner for identifisering av B-cellepopulasjoner i perifert blod. Design av disse kombinasjonene er gjort med utgangspunkt i publikasjoner. Kombinasjonene har vist seg å være egnet for å skille mellom alle B-cellepopulasjoner som er nødvendige for klassifisering av ulike grupper immunsvikt. Det er i tillegg blitt etablert egne normalverdier for normale B-cellepopulasjoner i blod.

Prostatakreft er den kreftformen som hyppigst rammer norske menn og dødelighet på grunn av avansert kreft i prostata er et klinisk problem. For å forstå molekylære ulikheter som skiller progressiv sykdom fra ikke-progressiv sykdom, vil identifisering av nye biomarkører som kan bidra til å gi en mer korrekt prognose være med på å forenkle behandling av pasienter med prostatakreft, og det er svært ønskelig med bedre behandlingsmetoder enn det som finnes i dag.miRNA er viktig under regulering av genuttrykk og det har vist seg at miRNA har en betydelig rolle under utvikling av kreft. Så langt er det bare et lite antall studier som har undersøkt uttrykk av miRNA relatert til prostatakreft. Målet med denne oppgaven var å utarbeide en optimal metode for isolering av total-RNA fra formalinfiksert parafininnstøpt vevsmateriale til bruk i undersøkelse av miRNA i vev fra prostata. Videre ville det være interessant å undersøke hvilken miRNA-profil som uttrykkes i Gleason grad 3, 4 og 5 for å finne ut om det er forskjell i miRNA-profil knyttet til alvorlighetsgrad av prostatakreft.Det ble tatt utgangspunkt i metode for isolering av total-RNA med RecoverAllTM Nucleic Isolation Acid Kit for formalinfiksert parafininnstøpt materiale, for å bedre utbytte total-RNA i vevsprøver fra prostata. Utprøving av ulike parametere som temperatur, inkubasjonstid med enzym, oppkutting av vevssylinder og homogenisering av vevssylinder ble gjennomført for å undersøke hvorvidt endringer kunne bidra til et bedre utbytte av RNA fra vevsmateriale som er formalinfiksert. Resultatene viser at optimal metode for isolering av RNA krever inkubasjon med enzymbehandling over natt (18 timer) for å få best utbytte RNA og høyest RIN-score. Ved isolering av RNA til analyse av miRNA er det tilstrekkelig med 3 timers inkubasjon med enzymbehandling, da mengde av kvantitert miRNA ser ut til å påvirkes i liten grad av inkubasjonstid over 3 timer. Mengde kvantitert miRNA i formalinfiksert materiale og ferskt materiale er tilnærmet likt, som betyr at formalinfiksert vevsmateriale kan benyttes på lik linje som ferskt materiale med hensyn på undersøkelse av miRNA.Det kommer tydelig frem av resultatene at det er gjennomgående lave konsentrasjoner RNA til stede i vevsmaterialet, og det er tydelig at RNAet er svært degradert, noe som gjenspeiles i den generelt lave RIN-scoren. Til tross for dårlig kvalitet på isolert RNA ble det laget cDNA-bibliotek til bruk i sekvensering av miRNA i formalinfiksert vevsmateriale. cDNA-bibliotekene viste mye adapterdimer som er forstyrrende for sekvensering av miRNA, og på bakgrunn av den dårlige kvaliteten på RNAet og forstyrrende DNA-sekvenser i prøvene, var det ikke mulig å gjennomføre sekvensering.

DNA damage may be caused by many different agents, including radiation, spontaneous mutations and chemical mutagens. If the damage is left unrepaired, it may result in mutations or cell death. All organisms contain repair system to repair these damages. The mechanism that is believed to be the most common is base excision repair (BER). The BER pathway is initiated by enzymes called DNA glycosylases, which recognize and remove modified or misincorporated bases. Studies of the sequenced genome of the two diatoms Thalassiosira pseudonana and Phaeodactylum tricornutum have shown that they have an unusual DNA glycosylase. The glycosylase has been named “Dual DNA glycosylase” and has only been found in diatom genomes. DDG contain an N-terminal NEIL (endonuclease VIII/Nei like) domain and a C-terminal UNG (Uracil N-glycosylase) domain, connected with a linker region. DDG has later been found in the pennate diatoms Fragilariopsis cylindrus and Seminavis robusta, suggesting that DDG is a diatom-specific protein. cDNA clones encoding the FL (full-length) P. tricornutum DDG as well as the single NEIL domain and UNG domain were cloned into the expression vector P-BADM-30, which contains both a histidine-tag and a glutathion S-transferase (GST)-tag for affinity purification. The clones were verified by sequencing and transformed into Escerichia coli ArcticExpress RIL cells. The ArcticExpress cells are modified for fusion protein expression. The expression of fusion proteins was optimized by induction time, temperature and inducer concentration. Expressed proteins were purified by the use of both histidin tag and GST tag columns, and verified by MALDI-TOF analysis. Purified recombinant PtDDG-FL was used in UDG activity assay analysis to determine activity optimum. The pH optimum was found to be at pH 8, NaCl optimum at 125 mM, MgCl2 optimum at 8 mM MgCl2 and the temperature optimum at 45°C. PtDDG-FL substrate preference was found to be in the order of ssU>U:G>U:A. The thermal stability of PtDDG-FL at its optimum temperature was found to be low in comparison to human UNG2. The Km and Kcat values of PtDDG-FL against double-stranded uracil-containing DNA were 0.64 μM and 3.3 min-1, respectively. The corresponding values for the nuclear human UNG2 enzyme are 3.0 μM and 187 min-1, respectively.

I 2005 ble en ny type sekvenseringsteknologi introdusert som åpnet for uante muligheter innen genetikken. Prosjekter som tidligere ble ansett som uoverkommelige, både teknisk og økonomisk, kan nå gjennomføres. Sekvenseringsteknologien som baserer seg på massiv, parallell sekvensering har fått navn som nestegenerasjonssekvensering og storskalasekvensering. Prinsippet for denne metoden og potensielle bruksområder blir diskutert i tillegg til utfordringer knyttet opp mot teknologien.Et av områdene som har fått en merkbar utvikling etter at denne teknologien kom på markedet er studien av monogene sykdommer; sykdommer som forårsakes av mutasjoner i ett gen alene. Man antar at det finnes rundt 7000 slike sykdommer. Den genetiske årsaken er ukjent for mer enn halvparten av disse.Strømme syndrom, som først ble beskrevet i 1993, antas å være en monogen sykdom. Syndromet uttrykker seg i pasientene gjennom tarmmisdannelse, øyemisdannelser og liten hodeomkrets. Dette er en av mange sjeldne tilstander hvor man tidligere ikke har hatt metoder for å kunne lokalisere den genetiske årsaken. Ved bruk av storskalasekvensering av den kodende delen av genomet, har vi i dette prosjektet lett etter de(n) kausale varianten(e) for Strømme syndrom. Tilsvarende prosjekter med lignende design hadde vist seg å være vellykket tidligere, men i dette prosjektet klarte vi ikke finne en sikker årsak til sykdommen. En rekke kandidatgener ble identifisert, men ingen kunne med sikkerhet fastslås å være sykdomsgenet.Årsakene til manglende konklusjon rundt sykdomsårsaken kan være flere. Disse kan være knyttet både til de biologiske antagelsene som er lagt til grunn for prosjektet og til rent metodiske svakheter knyttet opp mot storskalasekvensering. For å kunne identifisere et eventuelt sykdomsgen for Strømme syndrom vil undersøkelse av flere pasienter trolig være nødvendig.

Bitumen er en svært viskøs råolje som er vanskelig å utvinne. Selv om verdens tungoljereserver er store er det utvunnet svært lite tungolje ved bruk av tradisjonelle utvinningsmetoder. Behovet for drivstoff øker behovet for forskning på alternative måter å utvinne tungoljen som er igjen i de resterende tungoljereservoarene. En optimal metode for å utvinne og omdanne tungolje til bruksolje kunne bidratt til å øke verdens oljeressurser.Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR) er en potensiell kostnadseffektiv og mer miljøvennlig metode å senke viskositeten til oljen på. Ekstremofile mikroorganismer (bakterier og archaea), er av spesiell interesse ved utvikling av metoder for å bryte ned tungoljen til lettere komponenter. Dette er fordi noen av de ekstremofile mikroorganismene bruker hydrokarboner i sin metabolisme som kilde for energi og karbon. Hensikten med denne oppgaven var å undersøke om biokonvertering (MEOR) i kombinasjon med løsemiddelekstraksjon kunne redusere viskositeten til oljen. Dette ble undersøkt ved ristekolbeforsøk som foregikk over sju dager. Ristekolbene inneholdt mineralmedium (vekstmedium) og olje som eksponeres for to forskjellige mikrobielle konsortier, henholdsvis L004 og ML, i to ulike prøveserier, i kombinasjon med økende konsentrasjoner av en løsemiddelblanding bestående av isopentan, n-pentan, heksan, heptan og oktan. Mikroorganismene i vannfasen ble undersøkt med denaturerende gradient gel elektroforese (DGGE) for å se om de hadde en ulik biodiversitet før, under og etter ristekolbeforsøket. Dette kunne indikere om det var en eller flere arter som deltok i biokonverteringen. Resultatene viste indikasjon på høy biodiversitet både før, under og etter ristekolbeforsøket, med noen forskjeller i biodiversitetsmønster. Oljefasen ble analysert med elektrospray ioniserende massespektrometri (ESI-MS), for å se på en aktuell endring i masse/ladnings forhold sammenlignet med olje som ikke hadde gjennomgått ristekolbeforsøk. Resultatene indikerer at det har foregått endringer i oljesammensetningen på molekylnivå og at biokonvertering i kombinasjon med løsemiddel har en potensiell degraderende effekt på de tunge komponentene i oljen. Mer forskning på biokonvertering i kombinasjon med løsemiddel må til for å kunne si mer om denne indikasjonen.