Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse de doctorat : Physique : Lyon, École normale supérieure (sciences) : 2006. / Bibliogr. en fin de chapitres.

Les intégrines sont bien reconnues pour être impliquées dans plusieurs mécanismes cellulaires tels que la migration, la différenciation et la survie cellulaire. Il est également connu que les différentes sous-unités des intégrines peuvent elles aussi avoir des rôles différents au sein de ces mécanismes.Les signaux de survie engendrés par l'adhésion cellulaire sont principalement médiés par les intégrines. Ainsi lors de la perte d'adhésion à la matrice extracellulaire, les cellules entrent en anoïkose. Notre laboratoire a démontré que les cellules épithéliales intestinales entrent, elles aussi, en anoïkose lors d'une perte d'adhésion à la matrice. Ainsi l'objectif de ce travail est de déterminer l'implication des différentes sous-unités [alpha] des intégrines dans la survie cellulaire dans l'épithélium intestinal selon l'état de différenciation. Tout d'abord, nous avons déterminé le profil d'expression des sous-unités [alpha]2, [alpha]3, [alpha]5 et [alpha]6 des intégrines.Les cellules indifférenciées expriment toutes les sous-unités d'intérêts, alors que les cellules différenciées expriment surtout la sous-unité [alpha]6 des intégrines. Ensuite, afin de déterminer quelles sous-unités des intégrines sont impliquées dans la survie cellulaire selon l'état de différenciation, nous avons utilisé des anticorps bloquants afin d'inhiber leur adhésion à la matrice.Les sous-unités [alpha]2, [alpha]3 et [alpha]6 des intégrines sont importantes pour la survie des cellules indifférenciées alors que ce sont les sous-unités [alpha]2, [alpha]5 et [alpha]6 qui sont importantes pour la survie des cellules différenciées. Nous avons généré des shARNs dans des lentivirus afin d'infecter les cellules indifférenciées HIEC. Aucun des shARNs générés contre les sous-unités [alpha]2, [alpha]3 et [alpha]5 n'est fonctionnel. Le troisième shARN contre la sous-unité [alpha]6 a fonctionné. De plus, la perte d'expression de la sous-unité [alpha]6 a entraîné une augmentation de l'anoïkose. Donc, la sous-unité [alpha]6 des intégrines est importante pour la survie des cellules indifférenciées. À l'aide de ce shARN, nous avons déterminé que la perte d'adhésion causée par la perte d'expression de la sous-unité [alpha]6 des intégrines affecte les niveaux relatifs d'activation de Fak. Ainsi les différentes sous-unités [alpha] des intégrines sont impliquées de façon différentielle dans la survie des cellules épithéliales intestinales selon l'état de différenciation.

Le métabolisme des phosphoinositides constitue un processus crucial parmi les systèmes permettant la terminaison de la transmission intracellulaire d’un stimulus extracellulaire. En effet, l’une de principales voies de signalisation intracellulaire engendrée en réponse à la liaison d’hormones ou de facteurs de croissance sur leurs récepteurs spécifiques fait intervenir la phosphorylation du PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 par une PI 3-kinase. Les enzymes responsables du métabolisme de ce second messager sont donc essentielles à la fonction normale de la cellule. L’ADNc de la 5-phosphatase SHIP2 a été cloné dans notre laboratoire. Cette enzyme présente au sein de sa structure primaire, en plus d’un domaine catalytique 5-phosphatase, un grand nombre de motifs permettant des interactions spécifiques avec d’autres protéines : un domaine SH2 N-terminal, des séquences riches en prolines, un motif NPXY et un domaine SAM. SHIP2 joue un rôle de régulateur négatif dans la voie PKB et MAPK in vitro dans plusieurs modèles cellulaires. De plus, l’affinité de SHIP2 pour le cytosquelette a été mise en évidence notamment dans les plaquettes sanguines. Notre travail de thèse s’intègre dans le cadre de l’étude biochimique de SHIP2 et plus particulièrement dans la recherche de ses partenaires protéiques. La Vinexine, protéine du cytosquelette impliquée dans l’adhérence cellulaire, avait été identifiée comme une protéine interagissant avec SHIP2 par la technique du double hybride. Nous avons confirmé cette association par des expériences d’immunoprécipitation en système transfecté (cellules COS-7) ainsi qu’en système natif (cellules HeLa et MEF). Nous avons montré que cette interaction n’était ni modulée par une stimulation à l’EGF (dans des cellules COS-7) ni par le sérum (dans des cellules MEF). Nous avons démontré une colocalisation de SHIP2 avec la Vinexine  à la périphérie des cellules COS-7 stimulées à l’EGF. Par la suite, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de cette interaction dans l’adhérence cellulaire. Nous avons montré que la surexpression de SHIP2 ou de la Vinexine  augmente l’adhérence des cellules COS-7 sur un substrat de collagène I. L’adhérence à ce même substrat est diminuée dans les cellules MEF issues des souris déficientes en SHIP2 comparées à des cellules contrôles SHIP2 +/+. De plus, il apparaît que la partie carboxy-terminale de SHIP2 ainsi que son activité catalytique sont importantes pour l’adhérence des cellules au substrat. Ces résultats suggèrent un rôle important de SHIP2 dans l’adhérence cellulaire et l’organisation du cytosquelette d’actine faisant intervenir un mécanisme probable de déphosphorylation du PtdInsP3.

HIPK1 (Homeodomain Interacting Protein Kinase 1) est une sérine/thréonine kinase de la superfamille des CMGC kinases. Les HIPKs, initialement identifiées comme des régulateurs des facteurs de transcription à homéodomaine, constituent un groupe de quatre kinases. Parmi elles, trois semblent jouer un rôle dans la modulation de l’activité de p53. Il est bien connu que HIPK2 peut phosphoryler p53 sur sa sérine 46 en activant sa fonction pro-apoptotique et plus récemment il a été découvert que HIPK4 pouvait phosphoryler p53 sur sa sérine 9. Concernant HIPK1 le rôle fonctionnel de son interaction avec p53 n’a pas encore été clairement élucidé. De plus, la régulation d’autres voies de signalisation, telles que celle des MAP kinases par HIPK1 a été aussi documentée. L’objectif de mes travaux a été de caractériser la fonction de HIPK1 dans les cellules cancéreuses afin d’identifier son rôle potentiel dans la biologie tumorale, i.e. dans les processus de cancérogénèse ou dans la réponse aux traitements. Par sur-expression de HIPK1 nous avons caractérisé sa localisation subcellulaire, identifié ses déterminants moléculaires, et trouvé que HIPK1 est rapidement dégradée dans le compartiment nucléaire. De plus nous avons trouvé que HIPK1 active principalement la transcription p53-dépendante, en phosphorylant p53 sur sa sérine 15 et en stabilisant cette dernière. La sur-expression de HIPK1 a un effet anti-prolifératif, associé avec l’induction de p21. Nous avons donc exploré le profil d’expression de HIPK1 dans une collection de 80 cancers colorectaux et observé que HIPK1 est souvent plus fortement exprimée dans les tissus tumoraux que dans les tissus sains, mais aussi que son expression est indépendante du statut de p53 (sauvage ou muté). / HIPK1 (Homeodomain Interacting Protein Kinase 1) is a serine/threonine kinase which belongs to the CMGC kinases superfamily. HIPKs that have been initially identified as regulators of homeodomain transcription factors constitute a group of four kinases. Among them, three seem to play a role in the modulation of p53 activity. While it is well known that HIPK2 can phosphoylate p53 on serine 46 and activates its proapoptotic function, it has more recently been shown that HIPK4 can also phosphorylate p53 on serine 9. Concerning HIPK1, although some first studies have indicated that it could interact with p53, the functional role of this interaction has not been clearly elucidated. Moreover, the regulation of other signaling pathways, such as MAP Kinases by HIPK1 has also been documented. The purpose of this work is to characterize HIPK1 function in cancer cells to identify its possible role in tumor biology, i.e. in cancerogenesis process or in the response to treatments. By overexpressing HIPK1 we characterized the subcellular localization of the kinase, identified its molecular determinants, and found that HIPK1 is rapidly degradated in the nuclear compartment. Moreover we found that HIPK1 activates principally the p53 dependent transcription, by phophorylating p53 on its serine 15 and by stabilizating it. The overexpression of HIPK1 has an anti-proliferative effect, associated with the induction of p21.We have explored the HIPK1 expression profile in a collection of 80 colorectal cancers and observed that HIPK1 is often strongly expressed in the tumor tissue compared to the normal tissue, but also that its expression is p53 status independent (wild-type or mutated).

Le mélanome est le cancer de la peau le plus rare, mais celui qui cause le plus de mortalité. L’étapecritique de sa progression est l’angiogenèse, processus détourné par la tumeur pour s’oxygéner et senourrir. Les cellules tumorales peuvent alors former des métastases dans les ganglions lymphatiques,notamment. D’autre part, la tumeur inhibe les réponses immunitaires de l’hôte à son encontre. Tousces mécanismes font intervenir le monoxyde d’azote (NO ). Le but de ce projet a été d’approfondir lerôle du NO dans l’angiogenèse et le recrutement leucocytaire, mécanismes basés sur lareconnaissance cellulaire de l’endothélium.Nous avons montré que le NO est nécessaire à l’angiogenèse, mais que des doses plus fortes sontanti-angiogéniques. Cet effet inhibiteur peut s’expliquer par la diminution des interactions cellules-cellules,et l’inhibition de l’expression de PECAM-1/CD31, principalement.D’autre part, nous avons établi que l’adhésion des leucocytes est inhibée par le NO ce qui a été reliéà la modulation de l’expression des molécules capables de fixer des chimiokines : lesglycosaminoglycannes et les récepteurs de chimiokines, ainsi qu’à la sous-expression des moléculesd’adhésion CD34, ICAM-2/CD102 et VCAM-1/CD106.En conclusion, le NO est capable de réguler des mécanismes cellulaires majeurs de la progressiontumorale, par modulation de l’expression des molécules de surface de l’endothélium. Tout au long dece travail, nous avons observé que les différences de réponse sont dépendantes des doses de NO etdu type cellulaire, ce qui démontre le rôle pivot du NO dans la progression du cancer. / Melanoma is the rarest skin cancer, but one that causes the most of deaths. The critical step of itsprogression is angiogenesis, a physiological tumor-activated process which allows the delivery ofoxygen and nutrients. Tumor cells may then metastasize to the lymph nodes, in particular. Moreover,the tumor inhibits the host immune responses toward itself. All these mechanisms are regulated bynitric oxide (NO ). The aim of the project was to deepen the role of NO in angiogenesis andleukocyte recruitment, two mechanisms based on endothelial cell recognition.We have shown here that NO is necessary for angiogenesis, but that high concentrations are antiangiogenic.This inhibitory effect of NO can be attributed to the decrease of cell-cell interactions andthe inhibition of the PECAM-1/CD31 expression, mainly.Besides, we have demonstrated that leukocyte adhesion on endothelium is inhibited by NO . This canbe explained by the modulation of the expression of molecules able to bind to chemokines:glycosaminoglycans and chemokine receptors, as well as by the down-regulation of the adhesionmolecules CD34 and ICAM-2/CD102 VCAM-1/CD106.In conclusion, NO is able to regulate the main cellular mechanisms of tumor progression bymodulating the expression of surface molecules on endothelial cells. Throughout this work, we haveobserved that these modulations depend on NO concentrations and on the cell type, demonstratingthe pivotal role of NO in cancer progression.

Le système nerveux des invertébrés présente des caractéristiques fonctionnelles différentes de celles des vertébrés. Chez la sangsue Hirudo medicinalis, modèle d’étude privilégié en neurobiologie, une réparation efficace de la chaîne nerveuse est possible après lésion. Ce processus physiologique nécessite la mobilisation des cellules microgliales présentes au sein au système nerveux de la sangsue et rappelle certaines phases d’une réaction inflammatoire. Une recherche des effecteurs moléculaires impliqués dans ce recrutement cellulaire a été entreprise. Une protéine homologue au facteur du complément humain C1q, nommée HmC1q, a été caractérisée et a été montrée comme impliquée dans le phénomène d’accumulation précoce de la microglie. En effet, constitutivement exprimée au sein des neurones, HmC1q s’accumule directement au niveau de la lésion du connectif et a été démontrée capable d’augmenter le recrutement d’une sous-population de cellules microgliales en réponse à la lésion. HmC1q se comporte ainsi comme une cytokine à activité chimio-attractante. La production d’une forme recombinante en levure de type Pichia pastoris a permis ensuite de préciser les modalités d’action de ce nouveau facteur chimiotactique, fortement actif au sein du système nerveux de la sangsue. Les expériences de cytométrie en flux, d’immunopréciptation et de chimiotactisme réalisées avec un anticorps anti-gC1qR plaident pour l’existence d’une structure réceptrice homologue au gC1qR des vertébrés sur la sous-population réactive à HmC1q.Par ce travail, il a été mis en évidence, pour la première fois dans le SNC d’un invertébré, l’existence d'une « nouvelle cytokine » HmC1q, ayant une homologie avec la protéine C1q des vertébrés, mais également faisant partie de la vaste famille des cytokines C1q-TNF. Les résultats originaux obtenus suggèrent que HmC1q puisse avoir un rôle-clé dans le dialogue neurone-glie nécessaire au maintien de l’intégrité du système nerveux. / The nervous system of invertebrates has functional characteristics different from those of vertebrates. In the leech Hirudo medicinalis, a well-recognized model in neurobiology, the nerve cord repair might be effective after injury. This physiological process requires the mobilization of microglial cells present in the leech nervous system and seems to mimic some key-phases of an inflammatory reaction.A search of the effector molecules involved in this cell recruitment was undertaken. A protein homologous to human complement factor C1q, named HmC1q, was characterized and was shown to be involved in the early accumulation of microglia. Indeed, constitutively expressed in neurons, HmC1q is directly expressed on the cut end of the connective and, in response to the injury, has been shown to increase the recruitment of a subpopulation of microglial cells. Thus HmC1q behaves as a chemoattractant cytokine. The production of its recombinant form in the yeast Pichia pastoris enabled us to specify the molecular mechanisms by which this new chemoattractant, might be highly active in the leech nervous system. The experiments carried out by flow cytometry, immunopreciptation and in chemotaxis analysis that were performed with an anti-gC1qR, argue for the existence of an human homologous gC1qR-like receptor at the surface the reactive of microglial cell subpopulation reactive to HmC1q. By this work, it was shown, for the first time in the CNS of an invertebrate, the existence of a « new cytokine » HmC1q, homologous to the vertebrate protein C1q, but also belonging to the vast C1q-TNF cytokine family. Finally the present original results suggest that HmC1q may have a key role in neuron-glia dialogue that is essential to maintain the integrity of the nervous system.