Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 139-161. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 61-63. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 183-186. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 157-172. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Th. 3e cycle--Instrumentation nucl.--Grenoble 1, 1978. N°: 144.

Le cotransporteur Na+-K+-G" rénal, aussi appelé NKCC2, est une protéine polytopi-que dont le rôle est de coupler le mouvement des ions Na+, K+ et Cl" à la surface cellulaire. Il est exprimé exclusivement dans la membrane apicale de l'anse ascendante large de Henle (TALH) où il veille à la réabsorption des ions filtrés. Ce faisant, il contribue à la concentration et à la dilution de l'urine, au rétrocontrôle tubuloglomérulaire et au maintien de la pression artérielle (PA) via celui du volume extracellulaire. À cet effet, l'inactivité de NKCC2 dans le syndrome héréditaire de Bartter se manifeste par des pressions qui sont souvent normales basses. L'activité de NKCC2 augmente lorsque la concentration intracellulaire (Ci) des ions transportés diminue, et ce, grâce à des modifications posttranslation-nelles qui incluent la phosphorylation du transporteur. L'activité de NKCC2 est aussi régulée avant l'étape de la traduction en protéine, mais il y a peu de données disponibles à ce chapitre. Le but du présent mémoire était de déterminer si des changements de la concentration intracellulaire des ions Na⁺, K⁺ ou C1⁻ affectaient aussi l'expression de NKCC2 par des mécanismes opérant aux étapes transcriptionnelle ou posttranscriptionnelle de la synthèse du transporteur. Pour ce faire, nous avons transfecté des cellules immortalisées provenant du TALH avec des régions promotrices de NKCC2, les avons soumises à différentes conditions de culture, et les avons analysées de manière à quantifier l'activité transcriptionnelle de NKCC2 et son expression. Nos résultats montrent qu'à court terme, une diminution de la concentration intracellulaire des ions Na⁺ et Cl⁻ entraîne une augmentation de l'activité transcriptionnelle de NKCC2 et sans doute aussi de la stabilité de son ARNm, alors qu'à moins court terme, elle entraîne une diminution de l'activité transcriptionnelle de NKCC2. Ces données suggèrent donc l'existence de facteurs de transcription dont l'activité est sensible à la concentration intracellulaire des ions transportés par NKCC2 et dont la cible comprend le promoteur du gène. Elles suggèrent aussi que l'effet immédiat d'une diminution de la concentration intracellulaire des ions est d'augmenter l'activité de NKCC2 par différents mécanismes à action rapide, mais que l'effet plus tardif est d'autolimiter la synthèse du cotransporteur à l'étape transcriptionnelle pour empêcher un transport excessif des ions vers l'intérieur de la cellule.

L'activité des cotransporteurs K-Cl (KCC1 à 4) est modulée par des changements de concentration en Cl ([Cl]) et du volume cellulaire. Les voies signalétiques d'activation ou d'inhibition des KCCs impliquées suite à de tels changements sont encore inconnues. Selon plusieurs études effectuées avec des agents pharmacologiques, le cotransport K-Cl serait activé par déphosphorylation des transporteurs et vice versa. Toutefois les enzymes régulatrices et les domaines KCCs avec lesquels elles interagissent ne sont pas encore élucidés quoiqu'il ait été rapporté que le C-terminus (Ct) de ces transporteurs semble jouer un rôle fonctionnel important à cet égard. D'autre part, nous avons récemment trouvé que l'activité de KCC2 et KCC4 est inhibée par le 4p-phorbol 12-myristate 13-acetate ou PMA, suggérant une régulation par la protéine kinase C (PKC). Les objectifs de cette thèse étaient donc d'analyser le rôle du Ct dans la régulation des KCCs en réponse aux changements de tonicité ou de [Cl] et au PMA, d'identifier des sites potentiels de phosphorylation par la PKC dans la structure des KCCs et de faire des études in vitro pour vérifier si les changements de tonicité ou de [Cl] et si l'effet du PMA s'accompagnent de changements dans le degré de phosphorylation des KCCs. L'approche privilégiée a été de générer des protéines chimériques KCC2-KCC4 dans lesquelles j'ai échangé 3 domaines du Ct (proximal, central et distal) et des mutants ponctuels dans lesquels j'ai supprimé les sites potentiels de PKC dans les domaines cytsoliques de ces transporteurs, et de déterminer l'impact de ces changements sur l'activité des transporteurs et leurs niveaux de phosphorylation. Plus spécifiquement, les protéines modifiées (n =19) et sauvages (n = 2) ont été exprimées dans les oocytes du xénope et l'activité de transport a été déterminée en mesurant l'influx en 86Rb et les niveaux de phosphorylation ont été analysés avec du H332PÛ4 par autoradiographie et ce, dans différentes conditions (mentionnées ci-dessus). Mes travaux ont permis de démontrer pour la première fois que la configuration structurale adoptée par le Ct des KCCs joue un rôle clé dans la régulation de ces protéines en réponse au gonflement cellulaire ou à l'augmentation de l'activité PKC membranaire mais que ces changements sont en partie indépendants de l'état de phosphorylation des transporteurs. Ils ont permis également de démontrer de nouveaux mécanismes de régulation des KCCs bien distincts suite à des changements de volume cellulaire, un mécanisme indépendant de la phosphorylation qui permettrait d'activer le cotransport K-Cl suite au gonflement cellulaire et un mécanisme dépendant de la phosphorylation qui permettrait de supprimer le cotransport K-Cl suite au rétrécissement cellulaire.

Les cotransporteurs cation-Cl (CCCs) appartiennent à une grande famille de protéines qui comprend neuf isoformes : CCCl à CCC7, qui permettent le mouvement du Cl" avec celui d'un Na+ et/ou K+ à travers la membrane cellulaire, CCC9, qui agit comme un transporteur de polyamine (PA) - glutamate, et CCC8, dont on en connaît pas la fonction. Les CCCs font aussi partie d'une famille plus large de protéines qui sont regroupées sous le nom de « amino acid - polyamine - orgcmocation carriers (APC) ». À l'exception de CCC9, cependant, les protéines impliquées dans le transport des PAs n'ont été isolées que chez les unicellulaires et ne font pas nécessairement partie de la famille des APC. Dans cette étude, nous avons trouvé que CCC8 joue vraisemblablement le rôle de transporteur de polyamines chez des espèces plus complexes puisque son expression dans les cellules HEK-293 augmente l'influx de spermidine à la surface cellulaire et puisque cette protéine est ubiquitaire chez les mammifères. Nous avons aussi observé que l'influx de spermidine dirigé par les cellules exprimant CCC8 est inhibé par la pentamidine, le methyl-glyoxal-bis-guanylhydrazone, le furosémide et la paraquat, et que cet influx est aussi associé avec celui certains ions comme le Na+ et le Cl". Ainsi, un groupe de substrats qui sont transportés par CCC8 a été découvert pour la première fois suite à ce travail tout comme l'identification d'un nouveau système de transport de polyamines dans les cellules animales. Ces résultats ont un intérêt majeur puisque les polyamines intracellulaires jouent un rôle clé dans la prolifération cellulaire.

Ce mémoire présente le projet de recherche d'estimation de coefficients de dégradation du chlore résiduel libre aux parois de conduites dans un réseau de distribution d'eau potable par échantillonnage à grande échelle de longues sections de conduites ayant des caractéristiques similaires (même diamètre, matériau et période d'installation). Nous avons effectué une analyse cartographique par quartiers du principal réseau de distribution d'eau potable de la Ville de Québec (Canada) couvrant une grande variété de chemins hydrauliques et une évaluation des concentrations de chlore résiduel libre et total, ainsi que leurs coefficients de dégradation dans l'eau à différentes températures. À l'aide du logiciel de modélisation hydraulique EPANET et d'un scénario réaliste de demandes moyennes en eau pour simuler les chemins hydrauliques et les temps de séjour de l'eau, nous avons élaboré une base de données des coefficients de dégradation du chlore résiduel libre aux parois de conduites en fonction du diamètre, du matériau et de la période d'installation. / The purpose of this research was to estimate pipe wall chlorine degradation coefficients in water distribution systems by full-scale sampling of long sections of pipes with similar characteristics (same diameter, material and period of installation). Map analysis of neighbourhoods were conducted on the main distribution network in Quebec City (Canada) covering a wide variety of hydraulic paths and assessment of free and total residual chlorine concentrations, and their decay coefficients at different water temperatures. Using EPANET hydraulic modelling software and a realistic scenario of average water demands for simulating hydraulic paths and water residence times, a database of chlorine decay coefficients associated to pipe wall was elaborated in function of diameter, material and period of installation.

Le cotransporteur Na-K-CI rénal (NKCC2) couple le transport de 4 ions (1 Na+, 1 K+ ou 1 Rb +, et 2 Cr) à travers la membrane apicale de l'anse ascendante de Renle, contribuant à la réabsorption de l'ultrafiltrat glomérulaire. L'épissage alternatif de l'exon 4 engendre 2 variantes appelées ±A¿ et ±F¿ dont la séquence dans le deuxième segment transmem-branaire (tm2) et dans la première boucle intracellulaire (cs1) diffère. Il confère aussi des différences d'affinité ioniques, i.e., ± A ¿ a des Km beaucoup plus bas que ± F ¿ pour tous les ions grâce à des résidus spécifiques que nous avons identifiés par des études mutagéniques, i.e., les résidus 216 et 220 dans tm2 (qui moduleraient l'affinité pour le Rb et Cl, respectivement) et certains résidus de csl incluant 223, 229, 233 et peut être 225 (qui moduleraient l'affinité pour le Cl). À ce stade-ci, notre but principal est d'avancer notre recherche sur la compréhension des déterminants qui confèrent à ± A ¿ et ± F¿ leurs caractéristiques cinétiques propres. Nous savons que les résidus ± modificateurs d'affinité¿ identifiés opèrent en combinaison mais ignorons la séquence des cassettes en ~ant que tel et leur spécificité ionique. Nous avons donc créé des . chimères en interchangeant des paires de résidus entre ± A ¿ et ± F ¿, i.e. résidus 216 et 220 dans tm2, 223 et 225 dans cs1, 223 et 229 dans csl, et 220 et 225 dans tm2-cs1, pour ensuite exprimer les mutants dans des oocytes de Xenopus laevis et analyser leur dépendance à chacun des ions. Nous avons trouvé, de façon fort intéressante, que la cassette 220; 223; 225; 233 modulait l'affinité pour les ions Na+-Cr (incluant le site à haute affinité pour le Cl) et que la 'cassette 216; 225 modulait celle pour le Rb. Toutefois, les résultats obtenus pour l'une des chimères (± F ¿ chez qui les résidus 216 et 220 ont été remplacés par ceux de ± A ¿) avait un comportement inattendu puisque son affinité pour le Rb est demeurée identique à celle de ± F ¿. En conclusion, les résidus de tm2 et csl fonctionnent probablement en synergie pour assurer la coordination ionique par NKCC2. Par ailleurs, nos résultats suggèrent l'existence d'au moins 2 cassettes ± modificatrices d'affinité ¿, l'une pour le Na-Cl et l'autre pour le K-Cl.