Cette thèse de doctorat porte sur la régulation du cotransporteur K+-Cl- de type 4 (KCC4) par la « WNK lysine deficient protein kinase 4 » (WNK4), une sérine-thréonine kinase qui a été découverte en 2001. Le cotransporteur KCC4 fait partie de la famille des cotransporteurs cation-Cl- (CCC) qui compte neuf membres. Le cotransporteur KCC4, et les autres isoformes de type KCC, sont des protéines de surface qui couplent l’efflux du Cl- à celui du K+ de manière électroneutre. Ce faisant, ils régulent le Cl- intracellulaire (Cl-i), le volume cellulaire (Vi) et la réabsorption basolatérale du Cl- dans les épithélia. Bien qu’ils soient activés par une augmentation du Cl-i et du Vi, les intermédiaires signalétiques impliqués demeurent mal caractérisés à ce jour. À cet effet, WNK4 pourrait correspondre à l’un de ces intermédiaires puisqu’elle régule plusieurs systèmes de transport, dont les KCC. Les objectifs de cette thèse étaient donc de déterminer si WNK4 régule l’activité de KCC4 suite à des changements de Vi et de Cl-i, et si c’est le cas, par quels mécanismes. Pour répondre à ces objectifs, nous avons adopté une approche structure-fonction par laquelle des mutations ont été introduites dans les protéines KCC4 ou WNK4. L’effet de ces mutations a été analysé dans le système d’expression hétérologue des ovocytes de Xenopus laevis grâce à des études fonctionnelles, d’expression de surface, d’immunofluorescence et de phosphorylation. Nos travaux ont permis de montrer pour la première fois que WNK4 et PP1 sont bel et bien impliquées dans la régulation de KCC4 suite à une augmentation du Vi, mais que contrairement à des hypothèses avancées antérieurement, PP1 agirait en aval plutôt qu’en amont de WNK4, et qu’elle agirait aussi sur KCC4 par l’intermédiaire d’autres intervenants signalétiques. Nous avons aussi identifié deux résidus dans le domaine C-terminal de KCC4 qui soutiennent l’effet de WNK4 et de PP1. En somme, ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la régulation de KCC4 par WNK4 et PP1 et, par conséquent, d’offrir d’autres cibles thérapeutiques pour traiter des désordres électrolytiques. / This Ph.D. thesis focuses on the regulation of K+-Cl- cotransporter type 4 (KCC4) by WNK lysine deficient protein kinase 4 (WNK4), a serine threonine kinase that was discovered in 2001. The cotransporter KCC4 belongs to the cation-Cl- cotransporter (CCC) family that includes nine members. This transporter, along with the three other KCC isoforms, corresponds to cell surface proteins that couple elctroneutral efflux of Cl- with that of K+. In doing so, KCC family members regulate intracellular Cl- (Cl-i), cell volume (Vi) and basolateral reabsorption of Cl- across a variety of epithelia. Although they are activated by an increase in Cl-i and Vi, the signaling intermediates involved remain largely unknown to date. In this regard, WNK4 could correspond to one such intermediate given that it regulates several transport systems including KCC. On the basis of these premises, the main objectives of this thesis were to determine whether WNK4 regulates KCC4 activity during changes in Cl-i and Vi and if so, through which mechanisms. To address these objectives, I exploited a structure-function approach in which mutations were introduced in both KCC4 or WNK4 and in which the effect of such mutations were analyzed in the Xenopus laevis expression system through functional, expression, immunofluorescence studies and phosphorylation. My studies allowed to show for the first time that WNK4 et PP1 are indeed involved in KCC4 regulation during an increase in Vi, but that in contrast to previous assumptions, PP1 would act downstream instead of upstream of WNK4, and that it would also act on KCC4 through additional signaling intermediates. Lastly, we have identified two residues in the C-terminus of KCC4 that mediate the effect of WNK4 and PP1. Taken together, these results could help identifying new signaling pathways of KCC4 regulation by WNK4 and PP1, and thus offer other therapeutic targets to treat electrolyte disorders.

Ce mémoire porte sur l'étude d'une variante d'épissage du cotransporteur humain cation-chlore orphelin (huCCC9a), un membre de la superfamille des cotransporteurs cation-chlore qui compte neuf membres, CCC1 à 7 qui ont pour fonction de transporter les ions Na+ et/ou K+ avec le Cl" à travers les surfaces cellulaires, et CCC8 et 9, dont les substrats ioniques demeurent inconnus à ce jour. Nous avons découvert que huCCC9, bien qu'il appartienne à la famille des CCCs, fait partie d'un groupe plus large de protéines appelé « famille des transporteurs d'acides aminés-polyamines-organocations » (ou APC pour l'acronyme anglais amino acid-polyamine-organocation transporter s). Nous avons donc voulu savoir si huCCC9a est impliqué dans le mouvement transmembranaire (tm) des polyamines d'autant plus que la plupart des cellules animales semblent être capable de promouvoir le transport facilité de tels substrats sans que la nature moléculaire exacte des protéines responsables, contrairement aux organismes unicellulaires, ait pu être déchiffrée. Nos résultats ont montré que huCCC9 permettait le transport de la spermidine > spermine > putrescine. De plus, nous avons aussi trouvé que l'influx de polyamines par CCC9a est augmenté en présence de certains acides aminés, que cet influx est indépendant des ions Na+ , K+ et Cl" et qu'il est inhibé par le furosémide et la pentamidine. Ces résultats revêtent une importance capitale en ce qu'ils correspondent à la première identification faite à ce jour d'un transporteur de polyamine chez les cellules animales et en ce sens qu'il semble exister un lien important entre le métabolisme intracellulaire des polyamines et la carcinogenèse de même qu'entre le gène CCC9a et une maladie appelée psoriasis vulgaris. / Cation-Cl" transporters (CCCs) belong to a large family of proteins that includes nine isoforms: CCC1 to 7, which have been shown to promote Cl" movement along with Na+ and/or K+ movement across cell surfaces, and CCC8 and 9, which have not been ascribed a specific transport function yet. The CCCs are also part of a larger family of proteins that are regrouped under the name amino acid-polyamine-organocation carriers (APC). In contrast to the CCCs, however, proteins involved in polyamine transport have only been isolated from unicellular species and do not necessarily belong to the APC family. In this work, we have found that a splice variant of CCC9 (called CCC9a) probably operates as one such polyamine transporter in higher species given that its expression in HEK-293 cells increases the influx of spermidine > spermine > putrescine at the cell surface and that it is otherwise widely distributed in certain mammals. We have also found that the influx of PAs by CCC9a increases further in the presence of certain amino acids, is Na+ -K+ -Cl"-independent and is inhibited by furosemide and pentamidine. Hence, a group of substrates that are transported by CCC9 as well as the molecular identity of a PA transport System in animal cells have been uncovered through this work for the first lime. These findings are of special interest given that CCC9 has been linked to the development of psoriasis vulgaris in the population and that intracellular PAs play a key role in cellular proliferation.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Th. 3e cycle--Électrochim. et électrochim. anal.--Grenoble 1, 1978. N°: D3 74.

Cette thèse de doctorat a porté sur l'étude de deux protéines membranaires d'origine animale appelées CCC8 (ou SLC12A9) et CCC9 (ou SLC12A8) qui appartiennent à la superfamille des cotransporteurs cation-chlore, mais dont le rôle n'est pas de transporter les ions Na+ et/ou K+ avec le Cl" à travers les surfaces cellulaires à l'instar des autres membres de la famille. En cours de caractérisation, nous avons trouvé que CCC8 et 9 pouvaient se comporter comme des transporteurs de polyamines à la surface cellulaire, ce qui nous a permis d'être les premiers à identifier de tels systèmes de transport chez les animaux. On en connaissait l'existence depuis longtemps, mais pour une raison imprécise, leur identité moléculaire était demeurée elusive. Il faut mentionner à cet effet que tous les CCCs font partie d'un groupe plus large de protéines appelé « transporteurs d'acides aminés-polyamines-organocations » (ou APC pour l'acronyme anglais amino acid-polyamine-organocation carriers). L'importance de nos résultats réside dans le rôle que jouent les polyamines dans la prolifération et la differentiation cellulaires, et ce, dans des conditions normales autant que pathologiques. Entre autres, il semble exister un lien important entre le métabolisme intracellulaire des polyamines et la cancérogenèse de même qu'entre le gène CCC9 et une maladie appelée psoriasis vulgaris.

L’hypertension artérielle affecte 40 % des Canadiens et Canadiennes âgés de 56 à 65 ans et correspond à un facteur de risque important pour le développement de maladies cardiovasculaires. Les causes de l’hypertension artérielle sont multifactorielles et le plus souvent difficiles à circonscrire. Elles incluent des facteurs génétiques, comme le dérèglement de certains systèmes de transport ionique dans le rein, et des facteurs environnementaux, comme l’ingestion excessive de sodium par la diète, l’abus d’alcool, la sédentarité, etc. La réabsorption du sodium filtré par le rein est effectuée par des protéines de transport spécialisées. Parmi celles-ci, le cotransporteur Na-K-Cl de type 2 (NKCC2), exprimé uniquement dans l’anse ascendante large de Henle (AAH) du néphron, assure la réabsorption d’environ 20 % du sodium. Ce transporteur est inhibé par les diurétiques de l’anse qui sont utilisés en clinique pour traiter certaines formes d’hypertension. Un changement de l’activité de cette protéine, soit intrinsèque ou lié à celui de certaines enzymes qui agissent sur NKCC2, a aussi été associé à des désordres de la pression artérielle. NKCC2 existe sous trois variants principaux qui sont produits par l’épissage alternatif de l’exon 4. Ces variants d’épissage, nommés NKCC2A, NKCC2B et NKCC2F, sont identiques les uns aux autres à l’exception du segment transmembranaire deux et de la boucle intracellulaire adjacente. Malgré tout, ils ont des caractéristiques, des localisations et des rôles différents le long de l’AAH. NKCC2 est impliqué dans la régulation du volume cellulaire puisqu’il est activé en condition de stress hypertonique. Cette activation serait médiée (du moins en partie) par certains isoformes des kinases with no lysine (WNK) dont WNK1 et WNK3. Toutefois, l’effet de ces kinases sur chaque isoforme n’est pas connu et les mécanismes provoquant l’activation du cotransporteur en réponse au stress hypertonique sont peu définis. Une meilleure connaissance à ce sujet nous permettrait de mieux comprendre comment NKCC2 est régulé et de savoir de quelle manière il pourrait être modulé pour en contrôler l’activité dans un but thérapeutique éventuel. Les objectifs de cette thèse étaient comme suit : 1) déterminer les mécanismes par lesquels les kinases WNK1 et WNK3 régulent chacun des variants de NKCC2 lors du stress hypertonique (chapitre 1) et 2) identifier les résidus de NKCC2 qui permettent la réponse au stress hypertonique et la régulation différentielle par les kinases WNK (chapitre 2). Le modèle des ovocytes de Xenopus laevis a été utilisé à cette fin. Dans le chapitre 1, nous avons montré que le stress hypertonique produisait son effet en augmentant l’abondance de NKCC2A et NKCC2B à la surface cellulaire et que cet effet était mimé par WNK3, mais pas par WNK1. De plus, nous avons montré que WNK3 augmentait le recyclage à la membrane des transporteurs endocytés alors que le stress hypertonique ne produisait pas cette réponse. Enfin, NKCC2F s’est révélé peu sensible au stress hypertonique et à WNK3, suggérant que des résidus lui étant uniques dans l’exon 4 contribuaient à cette réponse différentielle. Dans le chapitre 2, nous nous sommes intéressés aux rôles des résidus divergents entre les variants pour déterminer si l’exon 4 jouait un rôle dans les réponses observées. Par des études de mutagénèse dirigée, nous avons mis en évidence que les résidus en position 230 et 238 avaient un impact sur le trafic cellulaire de NKCC2. En outre, nous avons constaté que les résidus de NKCC2F à ces positions avaient pour effet de favoriser la rétention du transporteur à la membrane cellulaire. En somme, l’ensemble de ces travaux permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation du cotransporteur NKCC2 par le stress hypertonique et par la voie des kinases WNK. À la partie variable de NKCC2, l’exon 4, nous avons identifié un nouveau rôle qui est de participer à la régulation du trafic cellulaire du transporteur. Grâce à cette connaissance, nous saurons désormais que des stratégies d’intervention pour contrôler l’activité de NKCC2 pourraient miser sur la modification du nombre de transporteurs au site d’expression. / High blood pressure affects 40% of Canadians aged 56 to 65 and is a major risk factor for cardiovascular diseases. The causes of high blood pressure are multifactorial and are often difficult to circumscribe. They include genetic factors, such as abnormalities in the function of renal ion transporters, and environmental factors, such as excessive dietary sodium intake, alcohol abuse, sedentary lifestyle, etc. In the kidney, the ultrafiltered NaCl load is reabsorbed by specialized ion transport systems. Of these systems, the Na-K-Cl cotransporter type 2 (NKCC2), is confined to the thick ascending loop of Henle (TALH) of the nephron where it reabsorbs approximatively 20% of the ultrafiltered NaCl load. This transporter is inhibited by loop diuretics that are used clinically to treat certain types of hypertension. A change in the activity of NKCC2, either intrinsic or secondary to the effect of regulatory enzymes, has also been associated with blood pressure disorders. NKCC2 exists as three main variants that are produced through the alternative splicing of exon 4. These splice variants, named NKCC2A, NKCC2B, and NKCC2F, are identical to each other except for the residue composition of transmembrane segment 2 and the following connecting segment. Yet, they have different characteristics and roles along the TALH. NKCC2 is involved in cell volume regulation as it is activated by cell shrinkage. This activation is mediated (at least in part) by certain isoforms of the with no lysine (WNK) kinases including WNK1 and WNK3. However, the effect of these kinases on each of the splice variants is not known and the mechanisms that underlie the response to cell shrinkage are poorly defined. A better knowledge in these regards would allow us to better understand how NKCC2 is regulated and how it could be acted upon optimally towards maximal clinical benefits. The objectives of this thesis were as follows: 1) to determine the mechanisms by which WNK1 and WNK3 regulate each of the NKCC2 variant under hypertonic stress (Chapter 1) and 2) to identify residues in NKCC2 that sustain the response to cell shrinkage and differential regulation by the WNK kinases (chapter 2). The oocyte model of Xenopus laevis was used for this purpose. In Chapter 1, we showed that cell shrinkage produced its effect by increasing the abundance of NKCC2A and NKCC2B at the cell surface and that this effect was mimicked by WNK3, but not by WNK1. In addition, we showed that WNK3 increased membrane recycling of endocytosed transporters while cell shrinkage failed to produce such a response. Finally, NKCC2F was found to be insensitive to cell shrinkage and WNK3, suggesting that specific residues that are unique to this variant in exon 4 contributed to this differential response In Chapter 2, we looked at the roles of divergent residues between the variants to determine whether exon 4 played a role in the observed responses. Using mutagenic studies, we showed that residues at positions 230 and 238 played a major role in NKCC2 trafficking. In addition, we found that the residues of NKCC2F at these positions had the effect of promoting carrier retention at the cell membrane In sum, our findings have allowed us to better understand the mechanisms through which NKCC2 is regulated during cell shrinkage and by the WNK kinase-dependent pathway. Our findings have also allowed us to identify a new role for exon 4 in NKCC2 trafficking. With this gain of knowledge, we have found that strategies aimed at controlling the activity of NKCC2 could be based on altering the number of transporters at the cell surface.

Québec Université Laval, Bibliothèque 2019

Les cotransporteurs K+-C1" (KCCs) sont exprimés en abondance dans le système nerveux où leur rôle est de maintenir les neurones hypoexcitables. Ds sont représentés par quatre isoformes dont les mécanismes de régulation et propriétés cinétiques diffèrent de façon appréciable. Nous avons récemment démontré que chacun des KCCs peut s'organiser en homooligomères ou hétérooligomères avec d'autres KCCs sans toutefois vérifier si certaines des associations observées menaient à des entités fonctionnelles et si oui, quel comportement elles engendraient. Dans ce travail, nous avons utilisé les ovocytes de xénopes pour caractériser les propriétés du cotransport K+-C1" quand un seul isoforme (KCC2 ou 4) est exprimé ou quand deux isoformes (KCC2 et 4) le sont et ce, après avoir prouvé que ces transporteurs pouvaient exister dans la même cellule neuronale de façon endogène. Nos résultats ont montré que les constantes cinétiques du transport différaient substantiellement entre les ovocytes exprimant KCC2/KCC4 et KCC2 seul, alors qu'elles différaient aussi entre les ovocytes exprimant KCC2/KCC4 et KCC4 seul mais de façon beaucoup moindre. Fait à noter, ces constantes étaient différentes de celles prédites sur la base d'une activité additive provenant de deux transporteurs indépendants et certaines de ces constantes, le coefficient de Hill entre autres, se sont révélées sensibles au Cl" intracellulaire (Cl'i). Ces résultats suggèrent que l'association KCC2-KCC4 dans les neurones mène à la formation d'une entité fonctionnelle avec des caractéristiques uniques et pourraient jouer un rôle intrinsèque dans le contrôle de l'excitabilité. Ils suggèrent aussi que les KCCs réagissent au Cl"; en changeant leur cinétique et que contrairement à la pensée populaire, ils fonctionnent avec deux sites de liaison pour le Cf.

Le développement durable et les conceptions plus écologiques sont devenus très présents dans le monde du génie civil. Cependant, un des matériaux de construction les plus utilisés figure parmi les plus polluants. En effet, la production du ciment, l'ingrédient clé du béton, est responsable d'une quantité importante d'émission de CO[indice inférieur 2]. Une solution est de remplacer une partie du ciment par des ajouts cimentaires provenant de sous-produits industriels, comme les cendres volantes provenant de la combustion du charbon. Au Québec, ce type d'ajout cimentaire n'est pas disponible localement. Une autre avenue est cependant possible, avec la combustion de biomasse sur un lit fluidisé. L'usine de pâtes et papiers Kruger, à Bromptonville, Québec, a récemment construit une usine de cogénération afin de valoriser ses boues de désencrage, ses boues primaires et secondaires et ses résidus de bois. À différents moments de la production, l'usine a produit six différentes cendres. Les températures de combustion ainsi que la provenance et les dosages en matières combustibles ont varié et produit des cendres ayant différentes propriétés dans les bétons. La présente recherche a tenté d'étudier et de comprendre la variation des propriétés sur bétons des différentes cendres pour ainsi faire un choix optimal selon les matières premières et les températures de combustion. Deux rapports E/L ont été testés : 0,55 et 0,4. Un taux de remplacement du ciment par les cendres de 20 % a été choisi à chaque fois. Les résultats montrent que les cendres demandent une plus grande quantité de superplastifiant, qui semble être reliée à la quantité de particules inférieures à 3 [micro]m. Des bétons formulés avec certaines cendres ont des résistances mécaniques très près ou supérieures au témoin dès 1 jour, tandis que d'autres ont de plus faibles propriétés mécaniques. La quantité de chaux libre présente dans les cendres semble avoir un effet bénéfique sur les résistances. Les perméabilités aux ions chlore à 28 jours sont souvent plus élevées que le témoin, mais se rapprochent ou sont plus faibles dans certains cas à 91 jours. Il est à noter que du gonflement et des microfissures apparaissent avec certaines cendres. Étonnamment, les cendres contenant le plus de chaux libre sont celles montrant le moins de gonflement.Le projet a aussi tenté d'étudier la compatibilité avec quatre superplastifiants de type polycarboxylate. Deux des six cendres ont été sélectionnées pour faire des bétons de rapport E/L de 0,4, toujours avec un taux de remplacement de 20 %. Parmi les quatre superplastifiants étudiés, seul le Glenium 7102 montrait une bonne rétention de l'affaissement avec les deux cendres.Le Viscocrete 2100 et le Adva 405 semblaient accentuer les gonflements et les microfissures observés précédemment. Finalement, des mélanges ternaires de rapport E/L de 0,4 ont été faits afin de tenter de diminuer la variabilité des performances entre les cendres. Des combinaisons ont été faites avec du métakaolin, du laitier, de la fumée de silice et une cendre volante normalisée de classe F. Il a été possible de conclure qu'une combinaison entre les cendres de Kruger et une cendre normalisée de classe F donne les mélanges les plus robustes.