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Vertebrate photoreceptors are highly specialized sensory neurons that utilize a modified cilium known as the outer segment to detect light. Proper trafficking of proteins to the outer segment is essential for photoreceptor function and survival and defects in this process lead to retinal disease. In this dissertation I focus on two aspects of protein trafficking, intracellular vesicular trafficking in photoreceptors and retinal pigmented epithelial (RPE) cells and how it relates to the human disease choroideremia (CHM), and the trafficking of proteins through the photoreceptor cilium. The human retinal degenerative disease choroideremia (CHM) is caused by mutation of the Rab escort protein-1 (REP1) gene, which is required for proper intracellular vesicular trafficking. However, it was unclear whether photoreceptor degeneration in this disease is cell-autonomous, due to defective opsin transport within the photoreceptor, or is noncell-autonomous and a secondary consequence of defective RPE. Utilizing the technique of blastomere transplantation and a zebrafish line with a mutation in the rep1 gene, I show that photoreceptor degeneration in CHM is noncell-autonomous and is caused by defective RPE. The molecular machinery responsible for protein trafficking through the photoreceptor cilium remained unclear for a long time. Recent studies found Intraflagellar Transport (IFT) is the process that mediates cilia formation and transport of proteins through a cilium, and further analyses showed IFT is important for trafficking proteins to the outer segment. However, many details about how IFT works in photoreceptors remained unclear. By analyzing zebrafish harboring a null mutation in the ift57 gene, I show that Ift57 is only required for efficient IFT, and that the Ift57 protein plays a role in the ATP-dependent dissociation of kinesin II from the IFT particle. Lastly, I investigate the role of retrograde IFT in photoreceptors, a process that had yet to be investigated. By utilizing antisense morpholino oligonucleotides to inhibit expression of cytoplasmic dynein-2 (the molecular motor that mediates retrograde IFT) , I show that retrograde IFT is required for outer segment extension and the recycling of IFT proteins.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont des maladies qui conduisent à une perte de la vision au cours de leur évolution. Les premiers essais cliniques utilisant la thérapie génique pour traiter ces maladies ont été réalisés et apportent des résultats encourageants. En amont de telles études, les essais précliniques s'effectuent le plus souvent sur modèle animal. Cependant, pour un certain nombre de DRH, il n'existe pas de modèle animal approprié ce qui compromet l'arrivée d'un traitement à un stade clinique. C'est le cas de la Choroïdérémie, qui représente 2% des DRH. La choroïdérémie est caractérisée par une perte de la vision nocturne dès la petite enfance et conduit à la cécité autour des 40-50 ans. Son diagnostic précoce et son évolution lente résultent en une grande fenêtre thérapeutique qui fait de la choroïdérémie une bonne candidate pour la thérapie génique. Sur le plan génétique, la maladie est causée par une mutation dans le gène CHM qui est localisé sur le chromosome X et code pour la Rab Escort Protein 1 (REP1). Cette protéine est impliquée dans le processus de prénylation de petites protéines GTPases, les protéines Rab. Afin de pallier au manque de modèle animal, nous avons généré au cours de ce travail de thèse, un modèle cellulaire humain de la choroïdérémie pour évaluer l'efficacité d'un protocole de thérapie génique sur le tissu réellement atteint in vivo. Pour cela, nous avons reprogrammé des fibroblastes de patient CHM-/y en cellules souches pluripotentes induites (iPS), que nous avons ensuite différenciées en Epithélium Pigmentaire Rétinien (EPR). Nous avons caractérisé cet EPR, montrant que c'est une couche monocellulaire polarisée possédant une morphologie et une expression de marqueurs caractéristiques. De plus, ce tissu est fonctionnel, sur le plan du transport de fluide et de la phagocytose, et possède le même phénotype biochimique que celui observé chez les patients. Dans un but de thérapie génique et afin d'évaluer le vecteur viral le plus efficace sur nos cellules, j'ai testé un panel de 5 sérotypes d'AAV et démontré que l'AAV2/5 est le plus efficient pour transduire un EPR dérivé de cellules iPS humaines. J'ai ensuite utilisé un AAV2/5-CAG-CHM afin d'évaluer l'efficacité fonctionnelle du vecteur et j'ai pu montrer qu'outre une expression correcte du transgène, le traitement de cellules de patients déficientes pour REP1 avec ce vecteur permet de restaurer une activité normale de prénylation. Nous avons donc démontré la supériorité d'efficacité de transduction de l'AAV2/5 dans des cellules d'EPR humain et soulignons le potentiel d'un modèle d'EPR pathologique dérivé de cellules iPS pour apporter une preuve de concept de thérapie génique en absence d'un modèle animal approprié. / Inherited retinal dystrophies (IRDs) lead to a progressive vision loss. The first clinical trials using gene transfer to treat such diseases have been performed with positive results. Prior to clinical trials, preclinical studies are usually performed on animal models. However, for many IRDs, appropriate animal models do not exist, which compromises their progress towards a clinical trial. An example of an IRD that lacks an appropriate model is choroideremia, which represents 2% of IRD patients. It is characterized by night blindness in childhood, followed by progressive loss of the visual field resulting in blindness by 40–50 years of age. Its early diagnosis and slow evolution result in a large therapeutic window making choroideremia a good candidate for gene therapy. Genetically, the disease is caused by a mutation in the CHM gene located on the X chromosome and encoding the Rab Escort Protein 1 (REP1). This protein is involved in the prenylation of small GTPases, the Rab proteins. To palliate the lack of an animal model, we generated a human cellular model of choroideremia in order to evaluate the efficacy of a gene therapy approach in the tissue that is affected in vivo.Towards this aim, we reprogrammed REP1-deficient fibroblasts from a CHM-/y patient into induced pluripotent stem cells (iPScs), which we differentiated into retinal pigment epithelium (RPE). We characterized the iPSc-derived RPE that is a polarized monolayer with a classic morphology, expresses characteristic markers, is functional for fluid transport and phagocytosis, and mimics the biochemical phenotype of patients. In terms of gene therapy and to evaluate the most efficient viral vector, I assayed a panel of 5 adeno-associated virus (AAV) vector serotypes and showed that AAV2/5 is the most efficient at transduce the iPSc-derived RPE. I then transduced the iPSc-derived RPE of a choroideremia patient with an AAV2/5-CAG-CHM and demonstrated that this vector is able to restore a normal prenylation function to the cells.To conclude, I demonstrated the superiority of the transduction efficiency of AAV2/5 in the iPSc-derived RPE and highlight the potential of a diseased RPE model derived from iPS cells to provide a proof of concept of gene therapy in the absence of a suitable animal model.