Trypanosoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas, é um protozoário intracelular obrigatório. Vários estudos foram realizados visando a caracterização de moléculas de 85-90 kDa, presentes na superfície do parasita bem como de seus possíveis receptores nas células do hospedeiro vertebrado. Um membro da superfamília das gp85/trans-sialidases (Tc85-11), expresso somente na superfície das formas intectivas tripomastigotas e que adere em laminina e em células, foi clonado e caracterizado em nosso laboratório. Peptídeo J, fragmento de Tc85-11 não implicado em adesão a laminina, que contém o motivo conservado na superfamília, com seqüência VTVXNVFLYNR, aqui denominado \"domínio FLY\", foi identificado como sendo responsável pela adesão da porção carboxi-terminal da proteína em células epiteliais e, adicionado ao meio de cultura, promoveu aumento do número de células infectadas por T.cruzi. Seu receptor foi descrito como CK18 (Magdesian et al., 2001). Dando continuidade a esse estudo, em nosso laboratório caracterizamos a porção amino-terminal de CK18 como a região da interação com \"domínio FLY\" e identificamos o provável sítio de ligação, localizado entre os 15 aminoácidos iniciais da proteína. Adicionalmente, com o intuito de determinar a função do \"domínio FLY\", caracterizamos o peptídeo J como molécula extremamente adesiva, interagindo com a superfície de células epiteliais, matriz extracelular e promovendo interação entre tripomastigotas e ECM, possivelmente por meio de interações hidrofóbicas não dependentes de sua estrutura tridimensional adotada na proteína nativa. \"Domínio FLY\" foi caracterizado, ainda, como possível modulador da infecção por tripomastigotas já que, da mesma forma que estimula a invasão quando adicionado ao meio de cultura (Magdesian et al., 2001), promove secreção de proteínas imunorelacionadas com CK18 e ligantes de proteína A para o sobrenadante celular. Esse sobrenadante é capaz de in vitro inibir o processo infectivo do parasita em cerca de 40%. / Trypanosoma cruzi the causative agent of Chagas´ disease is an obligatory intracellular parasite in the mammalian host. Altrough the mechanism of trypomastigotes invasion of host cells has been intensively studied, a final and integrate picture of the process remains elusive. Members of the gp85/trans-sialidase superfamily have been implicated in the parasite-host interaction, with Tc85 family (85 kDa glycoproteins) implicated in the adhesion step. Our laboratory showed that Tc85-11, one member of Tc85 family, is a multi-adhesive molecule, with binding sites located at the amino- and carboxi-portions of the protein. The conserved \"FLY domain\" (peptide J) is present in all members of the family, binds to cytokeratin 18 (CK18) and enhances T. cruzi invasion (Magdesian et al., 2001). Herein, we localized the binding site of \"FLY domain\" on the amino-portion of CK18 and demonstrated an increase of trypomastigotes adhesion to extracellular matrix upon FLY treatment. The \"FLY domain\" can modulate T. cruzi infection in vitro and apparently is responsible for inducing the secretion of molecules by the host that inhibit trypomastigote invasion.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudos pré-clínicos de vacinação mostram que a Proteína 2 de Superfície de Amastigotas (ASP-2) é um alvo importante para a imunidade protetora contra a infecção pelo Trypanosoma cruzi. Baseado nestas propriedades protetoras da ASP-2, nós pensamos que seria importante avaliar o seu polimorfismo nas diferentes cepas do parasita. Utilizando anticorpos policlonais e monoclonais contra a proteína recombinante da cepa Y, nós confirmamos a presença de epítopos associados a ASP-2 em amastigotas das cepas pertencentes ao grupo T. cruzi II (Y), T. cruzi I (Sylvio X10/4, Dm28c, Tulahuén, G e Colombiana) e na cepa híbrida (CL-Brener). A estrutura primária da ASP-2 em cada cepa diferente foi determinada a partir de cDNAs de amastigotas intracelulares. A comparação da estrutura primária da ASP-2 expressa pelas cepas Y, CL-Brener, Tulahuén, G (G2) e Colombiana confirmou os dados imunológicos revelando um alto grau de identidade entre eles (>82%). Por outro lado, a ASP-2 das cepas Sylvio X10/4 e G (G1) apresentaram uma identidade limitada em relação às outras cepas (<50%), mas um alto grau de identidade quando comparadas entre si (78,7%). Os estudos de vacinação confirmaram os dados estruturais. Camundongos altamente susceptíveis A/Sn imunizados com cDNAs das cepas Y (pIgSPclone9) ou CL-Brener (pIgSPclone50) apresentaram um grau semelhante de proteção contra desafio com a cepa Y. Em contrapartida, o cDNA da cepa G (pIgSPclone62, G1) foi significativamente menos efetivo. Dessa forma, nossos estudos forneceram evidências que a ASP-2 expressas por diferentes cepas de T. cruzi compartilham um alto grau de identidade estrutural e imunológica. Entretanto, há na natureza algumas poucas cepas que apresentam formas distintas desta proteína. Para estudar a possível função biológica da ASP-2, nós avaliamos inicialmente a ligação da proteína recombinante em células de mamíferos em cultura. Apesar desta proteína se ligar nas células em cultura, parasitas transfectados expressando a ASP-2 na sua superfície não induzem a mobilização de Ca+2 intracelular em célula HeLa, um fenômeno importante na invasão de células hospedeiras. xviii A ASP-2 contém um domínio C-terminal denominado FLY (VTVXNVFLYNR) que foi demonstrado interagir com a citoqueratina (CK18), uma proteína abundante no citoplasma da célula hospedeira. Baseado nesta informação, nós propusemos que a interação do domínio FLY da ASP-2 com a CK18 seria um passo crítico para a multiplicação do T. cruzi no citoplasma da célula hospedeira. RNAi foi utilizado para diminuir a expressão de CK18 em células HeLa in vitro e após 24h de transfecção, as células foram infectadas com tripomastigotas das cepas Y, CL-Brener ou Sylvio X10/4 de T. cruzi. A redução dos níveis do mRNA e da proteína da CK18 decorrentes da transfecção com RNAi, foram determinados por PCR em tempo real, Western blot e imunofluorescência. Seguindo a infecção por tripomastigotas de T. cruzi, nós não observamos uma redução significativa na porcentagem de células infectadas, indicando que a invasão dos parasitas não foi significativamente alterada pela ausência de CK18. Contudo, as células transfectadas com RNAi específicos para a CK18 e infectadas com tripomastigotas das cepas Y ou CL-Brener, apresentaram uma redução significativa no número de parasitas intracelulares 48 horas após a infecção quando comparados a células controles. Em contraste, a expressão reduzida de CK18 não afetou o número de parasitas intracelulares da cepa Sylvio X10/4. Experimento de dupla marcação mostrou que os parasitas da cepa Y, mas não da cepa Sylvio X10/4, co-localizam junto com a CK18. A redução nos níveis de CK18 não afetou a ligação da proteína recombinante His-65kDa à célula HeLa, nem a indução da fosforilação de ERK1/2 por esta proteína. Dessa forma, nossos estudos demonstraram que o RNAi pode ser utilizado para reduzir a expressão de CK18 in vitro em células HeLa e que a inibição de CK18 não interfere na invasão do T. cruzi, mas reduz a multiplicação das formas intracelulares de cepas que co-localizam com a CK18. Além disso, nossos resultados demonstraram que a CK18 não é necessária nem para a ligação da proteína recombinante a células HeLa nem para a ativação da via de sinalização de ERK1/2 induzida pela ASP-2. / Pre-clinical vaccination studies provided evidence that the Amastigote Surface Protein-2 (ASP-2) is an important target for protective immunity against Trypanosoma cruzi infection. Based on the remarkable protective properties of ASP-2, we thought it would be important to evaluate its polymorphism in different strains of T. cruzi. Using polyclonal and monoclonal antibodies against a bacterial recombinant protein representing ASP-2 expressed by the Y strain, we confirmed the presence of ASP-2 associated epitopes on amastigotes of a T. cruzi II strain (Y), T. cruzi I strains (Sylvio X10/4, Dm28c, Tulahuén, G and Colombian) and a hybrid strain (CL-Brener). The ASP-2 primary structure in each different strain was determined from intracellular amastigotes cDNAs. Comparison of the primary structure of ASP-2 expressed by Y, CL-Brener, Tulahuén, G (G2) and Colombian strains confirmed the immunological data revealing a high degree of identity between them (>82%). In contrast, ASP-2 deduced sequences from Sylvio X10/4 and G (G1) strains displayed a limited identity to the others (<50%) and a high degree of identity between them (78.7%). Vaccination studies confirmed the structural data. Highly susceptible A/Sn mice immunized with cDNAs from Y (pIgSPclone9) or CL-Brener (pIgSPclone50) strains had a similar degree of protective immunity against a challenge with the Y strain. In contrast, the cDNA of the G strain (pIgSPclone62, G1) was significantly less effective. Overall, our study provides evidence that ASP-2 expressed by different T. cruzi strains share a high degree of structural and immunological identity. However, there are few strains with distinct forms of this protein in nature. To study the possible function of ASP-2, we firstly evaluated the binding of the recombinant protein to mammalian cells in culture. Although the recombinant protein binds to cultured cells, transfected parasites expressing ASP-2 on the surface do not induce intracellular Ca2+ mobilization in HeLa cells, an important phenomenon in host cells invasion. ASP-2 contains a C-terminal domain denominated FLY domain (VTVXNVFLYNR) that was shown to interact with cytokeratin (CK18), a protein abundant on the host cell cytoplasm. Based on these observations, we hypothesized xx that the interaction of the FLY domain of ASP-2 with CK18 could be a critical step for T. cruzi multiplication in the host cell cytoplasm. RNAi was used to knock down the expression of CK18 in HeLa cells in vitro. Following RNAi transfection, reduced level of CK18 mRNA and protein were confirmed by real time RT-PCR, Western blot and immunofluorescence. Following infection with trypomastigotes of Y, CL-Brener or Sylvio X10/4 strains of T. cruzi, we could not observe a significant reduction in the percentage of cells infected, indicating that parasite invasion was not significantly altered by the absence of CK18. However, CK18 RNAi transfected cells infected with trypomastigotes of Y or CL-Brener strains displayed a significant reduction in the number of intracellular parasites 48 hours later when compared with control cells. The reduced level of CK18 did not affect the number of intracellular parasites of a third parasite strain (Sylvio X10/4). Colocalization experiments showed that parasites of Y strain, but not Sylvio X10/4 strain, may interact with CK18. The reduced level of CK18 did not affect the His-65kD recombinant protein binding to HeLa cells, nor the ERK1/2 phosphorilation. Our studies demonstrated that RNAi can be useful to reduce the CK18 expression in HeLa cells in vitro and the inhibition of CK18 does not interfere with T. cruzi invasion, but it seems to reduce the multiplication of intracellular forms in strains that interact with the CK18. Our results also showed that the CK18 is not necessary for the recombinant protein binding to HeLa cells nor the activation of ERK1/2 pathway signaling induced by ASP-2. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Trypanosoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas, é um protozoário intracelular obrigatório. Vários estudos foram realizados visando a caracterização de moléculas de 85-90 kDa, presentes na superfície do parasita bem como de seus possíveis receptores nas células do hospedeiro vertebrado. Um membro da superfamília das gp85/trans-sialidases (Tc85-11), expresso somente na superfície das formas intectivas tripomastigotas e que adere em laminina e em células, foi clonado e caracterizado em nosso laboratório. Peptídeo J, fragmento de Tc85-11 não implicado em adesão a laminina, que contém o motivo conservado na superfamília, com seqüência VTVXNVFLYNR, aqui denominado \"domínio FLY\", foi identificado como sendo responsável pela adesão da porção carboxi-terminal da proteína em células epiteliais e, adicionado ao meio de cultura, promoveu aumento do número de células infectadas por T.cruzi. Seu receptor foi descrito como CK18 (Magdesian et al., 2001). Dando continuidade a esse estudo, em nosso laboratório caracterizamos a porção amino-terminal de CK18 como a região da interação com \"domínio FLY\" e identificamos o provável sítio de ligação, localizado entre os 15 aminoácidos iniciais da proteína. Adicionalmente, com o intuito de determinar a função do \"domínio FLY\", caracterizamos o peptídeo J como molécula extremamente adesiva, interagindo com a superfície de células epiteliais, matriz extracelular e promovendo interação entre tripomastigotas e ECM, possivelmente por meio de interações hidrofóbicas não dependentes de sua estrutura tridimensional adotada na proteína nativa. \"Domínio FLY\" foi caracterizado, ainda, como possível modulador da infecção por tripomastigotas já que, da mesma forma que estimula a invasão quando adicionado ao meio de cultura (Magdesian et al., 2001), promove secreção de proteínas imunorelacionadas com CK18 e ligantes de proteína A para o sobrenadante celular. Esse sobrenadante é capaz de in vitro inibir o processo infectivo do parasita em cerca de 40%. / Trypanosoma cruzi the causative agent of Chagas´ disease is an obligatory intracellular parasite in the mammalian host. Altrough the mechanism of trypomastigotes invasion of host cells has been intensively studied, a final and integrate picture of the process remains elusive. Members of the gp85/trans-sialidase superfamily have been implicated in the parasite-host interaction, with Tc85 family (85 kDa glycoproteins) implicated in the adhesion step. Our laboratory showed that Tc85-11, one member of Tc85 family, is a multi-adhesive molecule, with binding sites located at the amino- and carboxi-portions of the protein. The conserved \"FLY domain\" (peptide J) is present in all members of the family, binds to cytokeratin 18 (CK18) and enhances T. cruzi invasion (Magdesian et al., 2001). Herein, we localized the binding site of \"FLY domain\" on the amino-portion of CK18 and demonstrated an increase of trypomastigotes adhesion to extracellular matrix upon FLY treatment. The \"FLY domain\" can modulate T. cruzi infection in vitro and apparently is responsible for inducing the secretion of molecules by the host that inhibit trypomastigote invasion.