Dans le noyau des cellules eucaryotes, l’ADN est associé aux histones pour former la chromatine. Les extrémités terminales des histones peuvent subir un grand nombre de modifications posttraductionnelles réversibles (méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitinylation…). Certaines de ces marques épigénétiques définissent des domaines chromatiniens particuliers du noyau. Les triméthylations des lysines 9 et 27 de l’histone H3 (H3K9me3 et H3K27me3) correspondent respectivement à des domaines d’hétérochromatine constitutive et d’hétérochromatine facultative. Les proteines qui possèdent un chromo-domaine sont capables de se lier à des lysines méthylées, et permettent de recruter des complexes qui ont une activité enzymatique ou mécanique sur la chromatine. Les protéines de la famille CBX (ChromoBoX) possèdent toutes un chromodomaine, elles sont subdivisées en 2 groupes: les protéines du groupe HP1 (CBX1, CBX3 et CBX5) et celles du groupe Polycomb (CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 et CBX8) qui se fixent respectivement sur H3K9me3 et H3K27me3, respectivement. Afin de mieux comprendre comment s’organise la chromatine au niveau des régions hétérochromatiques, nous avons purifié, en condition native, les complexes associés à ces 8 protéines dans des cellules humaines en culture. Pour ce faire, nous avons opté pour la purification d’affinité en tandem (TAP). Les protéines co-éluées ont été identifiées par spectrométrie de masse. Nos résultats confirment que, d’une part les protéines du groupe Polycomb sont associées au complexe PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1). Toutefois, ces protéines sont mutuellement exclusives au sein du complexe PRC1, indiquant qu’il existe plusieurs complexes PRC1 de composition distincte dans la cellule. D’autre part, de nouveaux partenaires associés aux protéines du groupe HP1 ont été identifiés. La mise au point et le développement de la technologie TAP sur des cellules humaines en culture nous ont permis de purifier des complexes associés à la chromatine. Cette technique demeure un outil biochimique efficace pour la purification de complexes protéiques / In the nucleus of eukaryotic cells, DNA is wrapped around histones to form chromatin. The terminal ends of histones may undergo many reversible post-translational modifications (methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitinylation...). Some of these epigenetic marks define specific chromatic regions in the nucleus. The tri-methylation of lysines 9 and 27 of histone H3 (H3K9me3 and H3K27me3) correspond respectively to constitutive and facultative heterochromatin. Chromo-domain containing proteins can bind to methylated lysines, and can recruit complexes having enzymatic or mechanical activity on chromatin. All the members of the CBX (ChromoBoX) family contain a chromodomain, they are divided into 2 groups: the HP1 group (CBX1, CBX3 and CBX5) and the Polycomb group (CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 and CBX8) able to bind to H3K9me3 and H3K27me3, respectively. To better understand how the chromatin is organized in heterochromatic regions we purified, in native condition, the complexes associated with these 8 proteins from human cells in culture. To this end, we opted for the tandem affinity purification (TAP). The co-eluted proteins were identified by mass spectrometry. Our results confirm that firstly, Polycomb group proteins are involved in PRC1 complex (Polycomb Repressive Complex 1). However, these proteins are mutually exclusive in the PRC1 complex, indicating that several PRC1 of distinct compositions co-exist in the cell. On the other hand, new partners associated with HP1 group were identified. The development of the TAP technology to cultured human cells allowed us to purify complexes associated with chromatin. This technique remains an effective tool for the biochemical purification of protein complexes.

Les ribosomes sont les molécules présentes dans toutes les cellules du règne vivant. Ils résultent de l'assemblage d'ARN ribosomiques (ARNr) et de protéines ribosomiques, constituant des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Ils jouent un rôle majeur en décodant l'information génétique contenue dans les ARN messagers (ARNm) afin de les traduire en protéines lors du processus de traduction. La production des ribosomes chez les eucaryotes est initiée par la transcription par l'ARN pol I d'un pré-ARNr ribosomique (pré-ARNr) précurseur des ARNr matures 18S, 5.8S et 25S/28S, qui sera modifié chimiquement et digéré par des endo- et exoribonucléases pour aboutir aux ARNr matures. Le pré-ARNr en cours de synthèse s'associe avec des protéines ribosomiques, des petites particules ribonucléoprotéiques (snoRNP) et des protéines dites " non ribosomiques " conduisant à l'assemblage de la particule 90S initiale. Cette particule est ensuite scindée en particules pré-ribosomiques pré-40S et pré-60S, qui vont suivre des voies de maturation indépendantes pour aboutir aux sous unités ribosomiques 40S et 60S mature. La production des ribosomes eucaryotes requiert l'intervention de plus de 200 protéines dites " non ribosomiques ", qui s'associent avec les particules pré-ribosomiques et sont absentes des ribosomes cytoplasmiques matures. Des données obtenues en collaboration suggèrent que cinq protéines non-ribosomiques impliquées dans les étapes précoces de la formation de la grande sous-unité ribosomique, Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p et Rsa3p forment un complexe en l'absence d'ARN ribosomique. Il s'agirait du plus gros complexe connu composé uniquement de protéines, requis pour la formation des sous unités ribosomiques. Nop8p contient un domaine de liaison à l'ARN et pourrait permettre de fixer le complexe au pré-ARNr, et Dbp6p est une potentielle ARN hélicase. Les composants du complexe pourraient constituer des régulateurs et/ou des cibles de Dbp6p. Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer si les protéines Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p et Rsa3p forment effectivement un complexe en dehors des pré-ribosomes, de caractériser les interactions protéine/protéine au sein du complexe et sa structure et d'étudier les fonctions de ses composants. Au cours de ma thèse, j'ai mis en évidence que Nop8p, Dbp6p et Rsa3p sont associées aux pré-ARNr 35S, 32S et 27SA2 et font donc partie des mêmes particules pré-ribosomiques que Npa1p et Npa2p. Les protéines Npa1p, Npa2p, Nop8p et Rsa3p forment un complexe stable, qui persiste une fois dissocié des particules pré-ribosomiques. L'observation au microscope électronique à transmission des complexes purifiés révèle la présence de deux types de complexes de tailles différentes. Par ailleurs, l'hélicase Dbp6p interagit avec ce complexe, mais de manière plus labile car elle en est dissociée en présence d'une forte concentration en magnésium. Les analyses de déplétion de chaque membre du complexe montrent que l'absence de Nop8p n'empêche pas les interactions entre Npa1p, Npa2p et Rsa3p, et que l'absence de Npa2p n'empêche pas les interactions entre Npa1p, Nop8p et Rsa3p. En revanche, l'absence de Npa1p déstabilise totalement le complexe. La perte d'expression de Dbp6p affecte également l'efficacité de co-précipitation de ces pré-ARNr, mais dans une moindre mesure. En parallèle, nous avons débuté une étude des interactions protéine/protéine qui s'établissent entre les membres du complexe. Des données préliminaires suggèrent des interactions directes entre Npa1p, Npa2p et Dbp6p et entre Npa1p et Rsa3p. Nous avons également commencé à effectuer des tests d'activité in vitro de l'hélicase Dbp6p qui suggèrent qu'elle présente une activité ATPase. Enfin, nous avons également localisé le site de fixation sur le pré-ARNr de Npa1p situé à proximité de la protéine ribosomique Rpl3, suggérant qu'ils pourraient collaborer dans la compaction du pré-ARNr. / Ribosomes are huge molecular complexes present in all cells of living things. They result from the assembly of ribosomal RNA (rRNA) and ribosomal proteins, constituting ribonucleoproteins (RNP). They play a major role in decoding the genetic information contained in messenger RNA (mRNA) to translate them into proteins during translation. Production of eukaryotic ribosomes is initiated by transcription of a pre-ribosomal rRNA (pre-rRNA) precursor of mature 18S rRNA, 5.8S and 25S / 28S by RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed with endo- and exoribonucleases, in order to form mature rRNAs. The nascent pre-rRNA associates with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and proteins called "non-ribosomal", leading to the assembly of an initial pre-90S particle. This particle is then split into pre-ribosomal pre-40S and pre-60S particles that follow independent maturation pathways leading to mature ribosomal 40S and 60S subunits. Synthesis of eukaryotic ribosomes requires the intervention of more than 200 non-ribosomal proteins that associate with pre-ribosomal particles and are absent from mature cytoplasmic ribosomes. Data obtained in collaboration suggest that five non-ribosomal proteins involved in the early maturation steps of the large ribosomal subunit Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p and Rsa3p form a complex in the absence of ribosomal RNA. It would be the biggest and only known protein module required for the formation of ribosomal subunits. Nop8p contains a RNA binding domain and could tether the complex with pre-rRNA, and Dbp6p is a putative RNA helicase. Components of the complex may constitute regulators and / or Dbp6p targets. The objectives of my thesis were to determine whether Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p and Rsa3p can form a complex outside the context of pre-ribosomes, characterize protein / protein interactions within the complex, and also to study its structure and function. During my thesis, I demonstrated that Nop8p, Dbp6p and Rsa3p are associated with 35S, 32S and 27SA2 pre-rRNAs, and are therefore constitutive of the same pre-ribosomal particles than Npa1p and Npa2p. Npa1p, Npa2p, Nop8p and Rsa3p can form a stable complex that exists once dissociated pre-ribosomal particles. Electron microscopic observation reveal two types of complexes. Furthermore, Dbp6p helicase can interact with this complex, but in a more labile fashion, since it is dissociated in presence of a high concentration of magnesium. Depletion experiments show that the absence of Nop8p does not prevent interactions with Npa1p, Npa2p and Rsa3p, and that the absence of Npa2p does not prevent interactions with Npa1p, Nop8p and Rsa3p. However, the absence of Npa1p strongly destabilizes the complex. Loss of expression of Dbp6p also affects the efficiency of co-precipitation of 35S, 32S and 27SA2 pre-rRNAs, but to a lesser extent. In parallel, we began a study of protein / protein interactions between members of the complex. Preliminary data suggest a direct interaction between Npa1p or Npa2p and Dbp6p, and Npa1p and Rsa3p. We also began conducting an in vitro study of Dbp6p that suggest it has a helicase activity. Finally, by CRAC analysis we show that Npa1p binds adjacent to large ribosomal protein Rpl3 on 25S rRNA, and could collaborate with it in local rRNA folding.

Les qualités analytiques de la spectrométrie de masse à résonance cyclotronique ionique et à transformée de Fourier, combinée à une source d'électronébulisation (ESI-FT-ICR) ont été mises à profit pour l'étude d'interactions non-covalentes dans des assemblages protéiques. Dans une première partie, l'utilisation de cette technique pour la détection de complexes protéiques intacts a été développée sur le système constitué de la créatine kinase (CK) et de ses ligands ADP et ATP, conduisant à l'observation de ces complexes en phase gazeuse. Les parts spécifiques et non spécifiques de ces interactions ont été séparées par un modèle statistique, conduisant à la détermination des constantes de dissociation (K1,ADP=11.8 ± 1,5 μM, K2,ADP=48 ± 6 μM, K1,ATP=27 ± 7 μM, K2,ATP=114 ± 27 μM ) qui sont en accord avec la littérature. Dans une seconde partie, des techniques pour l'étude de l'accessibilité de surface de complexes de protéines par modification chimique en solution, aussi bien réversibles (échanges H/D) qu'irréversibles (modification spécifique d'histidine et de lysine par le DEPC) ont été mises au point et appliquées. Les sites de modification ont été localisés soit par une approche « bottom-up » (digestion enzymatique suivie d'une mesure de masse des peptides résultants) soit par une approche « top-down » (fragmentation en phase gazeuse de la protéine intacte par dissociation par capture d'électrons [ECD]). Dans le cadre de l'instrumentation actuelle, cette dernière approche a conduit à des résultats pour des protéines allant jusqu'à 17 kDa et pourrait être étendue jusqu'à des protéines de 25 kDa. Ces différentes stratégies analytiques ont été appliquées à des oligomères de la protéine du prion (PrP) obtenus par dénaturation thermique partielle in vitro de l'espèce monomérique. L'accroissement de l'incorporation de deutérium dans certaines régions de la forme oligomèrique (par rapport au monomère) reflète un dépliement partiel de la protéine, en particulier au niveau d'une hélice .

La compréhension et la prédiction des relations structure-fonction de protéines par des approches in sillico représentent aujourd'hui un challenge. Malgré le développement récent de méthodes algorithmiques pour l'étude du mouvement et des interactions moléculaires, la flexibilité de macromolécules reste largement hors de portée des outils actuels de modélisation moléculaire. L'objectif de cette thèse est de développer une nouvelle approche basée sur des algorithmes de planification de mouvement issus de la robotique pour mieux traiter la flexibilité moléculaire dans l'étude des interactions protéiques. Nous avons étendu un algorithme récent d'exploration par échantillonnage aléatoire, ML-RRT pour le désassemblage d'objets articulés complexes. Cet algorithme repose sur la décomposition des paramètres de configuration en deux sous-ensembles actifs et passifs, qui sont traités de manière découplée. Les extensions proposées permettent de considérer plusieurs degrés de mobilité pour la partie passive, qui peut Æetre poussée ou attirée par la partie active. Cet outil algorithmique a été appliqué avec succès pour l'étude des changements conformationnels de protéines induits lors de la diffusion d'un ligand. A partir de cette extension, nous avons développé une nouvelle méthode pour la résolution simultanée du séquenc¸age et des mouvements de désassemblage entre plusieurs objets. La méthode, nommée Iterative- ML-RRT, calcule non seulement les trajectoires permettant d'extraire toutes les pièces d'un objet complexe assemblé, mais également l'ordre permettant le désassemblage. L'approche est générale et a été appliquée pour l'étude du processus de dissociation de complexes macromoléculaires en introduisant une fonction d'évaluation basée sur l'énergie d'interaction. Les résultats présentés dans cette thèse montrent non seulement l'efficacité mais aussi la généralité des algorithmes proposés.

Pour comprendre comment les gènes du développement exercent de multiples fonctions temporelles, nous prenons comme modèle le facteur de transcription Otx2. Celui-ci est impliqué dans la gastrulation, le développement de l’œil, du système olfactif, de la glande pinéale, du thalamus et de la région cranio-faciale. Dans la rétine adulte, deux tissus distincts expriment Otx2 : l’épithélium pigmenté (RPE) et la rétine neurale, contenant les photorécepteurs. L’ablation globale du gène Otx2 entraîne la dégénérescence exclusive des photorécepteurs alors qu’elle modifie l’expression de gènes surtout dans le RPE. Ces faits suggèrent un mécanisme non autonome, confirmé par des expériences de gain et perte de fonction restreintes au RPE. Pour approcher les fonctions de la protéine Otx2 dans la rétine neurale et le RPE, une étude à grande échelle de ses cibles génomiques a été menée. Les profils distincts d’occupation du génome du RPE et de la rétine neurale suggèrent des fonctions différentes d’Otx2. Dans la rétine neurale, ce profil est très proche de celui du facteur paralogue Crx, indiquant une redondance fonctionnelle entre Otx2 et Crx. Nous avons émis l’hypothèse qu’une combinatoire de partenaires protéiques différents permet de moduler l’action d’Otx2 en sélectionnant des cibles génomiques distinctes. Pour identifier cette combinatoire in vivo et la corréler aux fonctions exercées par Otx2, nous avons créé une lignée de souris exprimant une protéine de fusion Otx2-TAP-tag à un niveau physiologique. Cet outil permettra la purification des complexes protéiques Otx2 in vivo et leur identification par analyse protéomique. / In the present work, we study the Otx2 transcription factor as a model to understand how developmental genes achieve multiple functions throughout time. Otx2 is first implied in gastrulation, and then participates to the development of the eye, the olfactory system, the pineal gland, the thalamus and the craniofacial region. Otx2 is expressed in two distinct tissues: retinal pigmented epithelium (RPE) and neural retina including photoreceptors. Global Otx2 gene ablation leads to exclusive photoreceptor degeneration although most of the affected genes are RPE specific. These elements suggest a non-cell-autonomous mechanism, confirmed by RPE restricted gain and loss of function. To understand Otx2 functions in the neural retina and in the RPE, a large scale study of its genomic targets has been yielded. Genome occupancy profiles in RPE and neural retina suggest different Otx2 functions. In the neural retina, Otx2 genome occupancy profile is very close to the one of its paralogue Crx, indicating functional redundancy between both transcription factors. We hypothesized that a different combination of protein partners allows modulating Otx2 action by selecting distinct target genes. To identify Otx2 combinatory in vivo and correlate it to Otx2 functions, we produced a mouse line expressing an Otx2-TAP-tag fusion protein at physiological level. This tool will allow purification of Otx2 protein complexes in vivo and their identification by proteomic analysis.

Pour comprendre comment les gènes du développement exercent de multiples fonctions temporelles, nous prenons comme modèle le facteur de transcription Otx2. Celui-ci est impliqué dans la gastrulation, le développement de l'œil, du système olfactif, de la glande pinéale, du thalamus et de la région cranio-faciale. Dans la rétine adulte, deux tissus distincts expriment Otx2 : l'épithélium pigmenté (RPE) et la rétine neurale, contenant les photorécepteurs. L'ablation globale du gène Otx2 entraîne la dégénérescence exclusive des photorécepteurs alors qu'elle modifie l'expression de gènes surtout dans le RPE. Ces faits suggèrent un mécanisme non autonome, confirmé par des expériences de gain et perte de fonction restreintes au RPE. Pour approcher les fonctions de la protéine Otx2 dans la rétine neurale et le RPE, une étude à grande échelle de ses cibles génomiques a été menée. Les profils distincts d'occupation du génome du RPE et de la rétine neurale suggèrent des fonctions différentes d'Otx2. Dans la rétine neurale, ce profil est très proche de celui du facteur paralogue Crx, indiquant une redondance fonctionnelle entre Otx2 et Crx. Nous avons émis l'hypothèse qu'une combinatoire de partenaires protéiques différents permet de moduler l'action d'Otx2 en sélectionnant des cibles génomiques distinctes. Pour identifier cette combinatoire in vivo et la corréler aux fonctions exercées par Otx2, nous avons créé une lignée de souris exprimant une protéine de fusion Otx2-TAP-tag à un niveau physiologique. Cet outil permettra la purification des complexes protéiques Otx2 in vivo et leur identification par analyse protéomique.

La compréhension et la prédiction des relations structure-fonction de protéines par des approches in sillico représentent aujourd'hui un challenge. Malgré le développement récent de méthodes algorithmiques pour l'étude du mouvement et des interactions moléculaires, la flexibilité de macromolécules reste largement hors de portée des outils actuels de modélisation moléculaire. L'objectif de cette thèse est de développer une nouvelle approche basée sur des algorithmes de planification de mouvement issus de la robotique pour mieux traiter la flexibilité moléculaire dans l'étude des interactions protéiques. Nous avons étendu un algorithme récent d'exploration par échantillonnage aléatoire, ML-RRT pour le désassemblage d'objets articulés complexes. Cet algorithme repose sur la décomposition des paramètres de configuration en deux sous-ensembles actifs et passifs, qui sont traités de manière découplée. Les extensions proposées permettent de considérer plusieurs degrés de mobilité pour la partie passive, qui peut être poussée ou attirée par la partie active. Cet outil algorithmique a été appliqué avec succès pour l'étude des changements conformationnels de protéines induits lors de la diffusion d'un ligand. A partir de cette extension, nous avons développé une nouvelle méthode pour la résolution simultanée du séquençage et des mouvements de désassemblage entre plusieurs objets. La méthode, nommée Iterative-ML-RRT, calcule non seulement les trajectoires permettant d'extraire toutes les pièces d'un objet complexe assemblé, mais également l'ordre permettant le désassemblage. L'approche est générale et a été appliquée pour l'étude du processus de dissociation de complexes macromoléculaires en introduisant une fonction d'évaluation basée sur l'énergie d'interaction. Les résultats présentés dans cette thèse montrent non seulement l'efficacité mais aussi la généralité des algorithmes proposés. / Understanding and predicting structure-function relationships in proteins with fully in silico approaches remain today a great challenge. Despite recent developments of computational methods for studying molecular motions and interactions, dealing with macromolecular flexibility largely remains out of reach of the existing molecular modeling tools. The aim of this thesis is to develop a novel approach based on motion planning algorithms originating from robotics to better deal with macromolecular flexibility in protein interaction studies. We have extended a recent sampling-based algorithm, ML-RRT, for (dis)-assembly path planning of complex articulated objects. This algorithm is based on a partition of the configuration parameters into active and passive subsets, which are then treated in a decoupled manner. The presented extensions permit to consider different levels of mobility for the passive parts that can be pushed or pulled by the motion of active parts. This algorithmic tool is successfully applied to study protein conformational changes induced by the diffusion of a ligand inside it. Building on the extension of ML-RRT, we have developed a novel method for simultaneously (dis)assembly sequencing and path planning. The new method, called Iterative-ML-RRT, computes not only the paths for extracting all the parts from a complex assembled object, but also the preferred order that the disassembly process has to follow. We have applied this general approach for studying disassembly pathways of macromolecular complexes considering a scoring function based on the interaction energy. The results described in this thesis prove not only the efficacy but also the generality of the proposed algorithms

Le système de sécrétion de type II (SST2) permet la sécrétion de protéines repliées à travers la membrane externe chez les bactéries à Gram-négatif. Le SST2 est une nano-machine enchâssée dans l’enveloppe bactérienne, proche par sa composition et structure aux systèmes d’assemblage des pili de type IV (PT4) impliqués, entre autres, dans d’adhésion et motilité. Chez Klebsiella oxytoca, la surexpression des gènes pul codant le SST2 permet l’assemblage de pili composées des sous-unités PulG. Ceci suggère qu’en conditions physiologiques l’assemblage d’un pseudopilus périplasmique permet la sécrétion du substrat spécifique du SST2, la pullulanase. Dans ce projet nous avons exploré le mécanisme moléculaire de l’assemblage du pseudopilus en se focalisant sur les interactions de PulG avec les composants du SST2 dans la membrane interne. En utilisant l’approche de double-hybride bactérien, nous avons établi le réseau d’interactions de PulG avec les pseudopilins mineures PulH, I, J et K et avec la plateforme d’assemblage (PA). Pour valider ces interactions, nous avons combiné des techniques de biochimie (co-purification par affinité, pontage cystéine et chimique) avec des analyses fonctionnelles de sécrétion et de formation du pseudopilus. Nous avons mis en évidence des interactions entre PulG et les protéines de la PA, PulF et PulM, et nous avons analysé en détail l’interface PulG-PulM. Les résultats suggèrent la formation d’un complexe PulK-I-J-H-G dans la membrane interne impliqué dans des étapes précoces de la formation du pseudopilus, à travers les interactions de PulG et PulH avec PulM et PulF. Nos données expérimentales suggèrent un rôle majeur de PulM dans la sécrétion, vraisemblablement durant l’assemblage du SST2 et l’élongation du pseudopilus. Nos travaux collaboratifs mettant en jeu l'analyse par spectroscopie de masse et en dynamique moléculaire in silico révèlent le rôle essentiel des résidus conservés Glu5 et Thr2 de PulG, requis pour l’interaction avec PulM. Ces données suggèrent que Glu5 participe à l'extraction de PulG de la membrane, en neutralisant la charge positive de son peptide N-terminal par des interactions intramoleculaires. Ces résultats permettent d'établir un modèle détaillant les étapes initiales de l’assemblage des pseudopili dans la membrane interne, relevant pour de futures études sur le SST2 et nanomachines homologues. sécrétion de protéinespili de type 4 assemblage de fibres complexes protéiques membranairesinteractions protéine-protéinemicroscopie à immuno-fluorescence simulations en dynamique moléculairedouble-hybride bactérien spectrométrie de masse nanomachines bacteriennes / The type II secretion system (T2SS) drives the translocation of folded, periplasmic proteins across the outer membrane in Gram-negative bacteria. Secretion is carried out by an envelope-spanning nanomachine that is similar to the apparatus that builds type IV pili (T4P), bacterial surface filaments involved in adhesion, motility and other functions. In the Pul T2SS of Klebsiella oxytoca, overexpression of pul genes in plate-grown bacteria allows the assembly of T4P-like surface fibres made of PulG subunits, suggesting that a periplasmic pseudopilus fibre plays a role in the secretion of the type II substrate pullulanase under physiological conditions. In this project, we explored the molecular mechanism of pseudopilus assembly by focusing on the interaction between PulG and the T2SS inner membrane and pseudopili components. The network of interactions of PulG with the minor pseudopilins PulH, I, J and K and the assembly platform (AP) components was established using bacterial two-hybrid analysis. To validate these interactions, we combined biochemical approaches (affinity co-purification, chemical or cysteine cross-linking) with functional assays of secretion and pseudopilus formation. We provide evidence of the interaction between PulG and the AP proteins PulF and PulM, and delve into the PulG-PulM interface. Our results point to the formation of a PulK-I-J-H-G complex in the plasma membrane involved in early steps of fibre assembly, with a determinant role for PulG and PulH interaction with PulM and PulF. We obtained experimental evidence supporting a major role for PulM in pseudopilus assembly and protein secretion, probably by intervening in the assembly of the T2SS apparatus and in pseudopilus elongation. The results of experimental and in silico studies in collaboration with experts in mass spectrometry and molecular dynamics support the essential role of the highly conserved PulG residues Glu5 and Thr2, which participate in PulM binding. In addition, Glu5 probably favours PulG membrane extraction by neutralising its N-terminal positive charge through intra-molecular interaction. These findings shed new light on early membrane events during fibre assembly, and open new and exciting avenues in research on T2SSs and related nanomachines.protein secretiontype 4 pilifibre assemblymembrane protein complexprotein-protein interactionsimmunofluorescence microscopymolecular dynamics simulationsbacterial two-hybrid assaymass spectrometrybacterial nanomachines

Très conservée, plus abondante dans les cellules en prolifération que dans les cellules<br />normales, stimulée par les rayonnements UV et ionisants, autant de caractéristiques qui ont<br />suscité notre intérêt pour l'analyse structurale et fonctionnelle de la protéine KIN17 humaine<br />(hKIN17) dans le but de caractériser sa ou ses fonction(s) dans la cellule. Plusieurs propriétés ont<br />été décrites pour la protéine hKIN17 dans différents mécanismes cellulaires tels que la réplication<br />de l'ADN, la réparation de l'ADN et le métabolisme de l'ARN. Pendant ma thèse, j'ai montré en<br />combinant des données de DC, RMN et SAXS que la protéine hKIN17 possède un domaine<br />structuré adoptant probablement le repliement d'un doigt de zinc et un domaine winged helix<br />dans sa région N-terminale. Seul le premier domaine lie les acides nucléiques, le deuxième<br />domaine ayant pour partenaires plusieurs hélicases à ARN impliquées dans la transcription et la<br />traduction. J'ai résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal qui<br />est retrouvé uniquement chez les eucaryotes supérieurs et se replie en un double domaine de type<br />SH3. J'ai montré par différentes méthodes biochimiques (filtration sur gel, gel IEF natif) que ce<br />domaine ancre la protéine hKIN17 à un complexe nucléaire acide de haut poids moléculaire dont<br />les composants sont en cours d'identification par spectrométrie de masse. De plus, il lie l'ARN et<br />les histones modifiées. L'ensemble de ces résultats confirment l'implication de la protéine<br />hKIN17 dans le métabolisme de l'ARN et précisent le rôle de chacun des domaines au sein de la<br />protéine.

La génomique structurale a donnée accès à un nombre remarquable d'informations sur le protéome. De nature essentiellement combinatoire---il apparaît que certaines protéines interagissent en complexe, elles gagnent à être complémentées par des modèles tridimensionnels pour étendre la connaissance jusqu'au niveau structural. Récemment, de tels modèles ont été reconstruits pour le pore nucléaire, en intégrant diverses données biophysiques et biochimiques. Cependant, la nature qualitative de ces modèles empêche une complète synergie entre ceux-ci et les données expérimentales. Cette thèse propose trois développements répondant à ces limitations. Premièrement, nous introduisons les modèles tolérancés pour représenter des formes aux contours incertains par un continuum de modèles. Nous montrons qu'un modèle tolérancé est équivalent à un diagramme de Voronoi additif multiplicatif, et nous développons le lambda-complexe, l'équivalent de l'alpha-complexe, pour un tel diagramme. Deuxièmement, nous utilisons les modèles tolérancés pour représenter des assemblages protéiques. Nous expliquons comment un modèle tolérancé peut être utilisé pour évaluer la stabilité des contacts entre les protéines et pour valider la cohérence d'un tel modèle vis à vis de données expérimentales. Troisièmement, nous proposons des outils pour comparer des graphes de contact entre protéines, issus d' une part d'un modèle tolérancé, et d'autre part d'un modèle connu à résolution atomique. L'ensemble de ces concepts et outils est utilisé pour sonder les reconstructions du pore nucléaire mentionnées ci-dessus.