Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von ANP und Ang II im Bereich der blutdruckbestimmenden Widerstandsgefäße zu untersuchen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auch auf die Bedeutung von RGS2 gerichtet. Durch das Zusammenspiel der beiden funktionellen Antagonisten ANP und Ang II wird der Blutdruck reguliert. ANP und Ang II üben hierbei jeweils gegenteilige Effekte aus. Ang II hat vasokonstriktorische Effekte auf die Blutgefäße, vermindert die Natriurese und Diurese und erhöht den Sympathikustonus. ANP hingegen besitzt blutdruckmindernde Effekte, hervorgerufen durch Vasodilatation, gesteigerte Diurese, die Erhöhung der endothelialen Durchlässigkeit und der Hemmung des Sympathikustonus. Da nichts über die Interaktion dieser beiden Hormone in der Mikrozirkulation bekannt ist, wurden im Rahmen der Dissertation intravitalmikroskopische Studien der Mikrozirkulation des Musculus cremaster der Maus, in Anlehnung an der von Baez (1973) publizierten Methode, durchgeführt. Darüber hinaus wurden auch die Effekte von Ang II und ANP auf den Blutdruck durch invasive Blutdruckmessung untersucht. Der Durchmesser von präkapillären Arteriolen des M. cremaster wurde vor und während lokaler Superfusion von Ang II oder ANP gemessen. Ang II löste eine konzentrationsabhängige stabile Konstriktion aus. Bei der ausschließlichen Superfusion von ANP in verschiedenen Konzentrationen hingegen, zeigte sich kein Effekt auf den basalen Vasotonus. ANP war jedoch in der Lage, an Ang II vorkontrahierten Arteriolen, den konstriktorischen Effekt von Ang II aufzuheben und sogar darüber hinaus eine ausgeprägte Vasodilatation zu bewirken. Dieser Effekt konnte auch bei der invasiven Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen werden. Der durch Ang II ausgelöste Blutdruckanstieg wurde durch die zusätzliche Infusion von ANP gemindert. Ang II aktiviert die Kontraktion von glatten Gefäßmuskelzellen durch den Gαq-gekoppelten AT1-Rezeptor. RGS2 hingegen ist ein negativer Regulator von Gαq. Da von RGS2 bekannt ist, dass er von cGKI phosphoryliert und stimuliert wird (Osei-Owusu et al., 2007), stellte sich die Frage, ob ANP über RGS2 dem vasokonstriktiven Effekt von Ang II entgegenwirkt. Bei den Versuchen an RGS2-KO Mäusen zeigt sich hierbei, dass ANP nicht mehr in der Lage ist, den vasokonstriktiven Effekt von Ang II aufzuheben. Daraus ist nun der Schluss zu ziehen, dass RGS2 eine bedeutende Rolle für die Wechselwirkung zwischen ANP und Ang II in der Mikrozirkulation spielt und somit eine wichtige Aufgabe bei der Regulation des peripheren Widerstands und des Blutdrucks hat. / The aim of this dissertation was the investigation of the interactions between ANP and Ang II in the regulation of the tone of resistance vessels, with special focus on the role of RGS2. Arterial blood pressure is regulated by the interactions of ANP and Ang II, hormones which act as functional counterparts. Ang II leads to vasoconstriction, reduces natriuresis and diuresis, and enhances sympathetic tone. ANP on the contrary has hypotensive effects, mediated by vasodilatation, diuresis, increased endothelial permeability, and inhibition of sympathetic tone. Because nothing is known about the interaction of both hormones in resistance vessels, we performed intravital microscopy studies of the mouse cremaster microcirculation. The cremaster muscle was prepared as described by Baez (1973). Furthermore the effects of ANP and Ang II on arterial blood pressure were investigated by invasive blood pressure measurements. Arteriolar diameters were measured before and during local superfusion of Ang II or ANP. Ang II induced concentration dependent stable arteriolar constrictions. ANP did not affect diameters of unstimulated arterioles. However the peptide completely reversed the vasoconstrictory effect of Ang II. Moreover, in Ang II-preconstricted arterioles, ANP provoked a prominent dilatation. The interaction between ANP and Ang II was collaborated by invasive arterial blood pressure measurements. The hypertensive effect of Ang II was partly reversed by ANP. Ang II activates smooth muscle contraction through the the Gαq-coupled AT1 -receptor. The regulator of G protein signalling RGS2 is a negative regulator of Gαq. Because RGS2 is known to be phosphorylated and thereby stabilized by cGMP-dependent protein kinase (cGKI) (Osei-Owusu et al., 2007), we hypothesized that ANP counteracts the vasoconstrictory actions of Ang II by activation of RGS2. Indeed in RGS2-KO mice ANP failed to reverse the vasoconstrictory actions of Ang II. We conclude that RGS2 mediates the interplay between ANP and Ang II, which is critically involved in the regulation of peripheral resistance and arterial blood pressure.

Toxinas classificadas como serinoproteases, metaloproteases e fosfolipases A2, isoladas de venenos botrópicos, podem induzir reações inflamatórias que contribuem na gravidade dos sintomas locais observados nestes envenenamentos. Entretanto, a contribuição efetiva de cada uma destas toxinas no efeito inflamatório induzido pelo veneno não é bem compreendida. Neste estudo, o veneno de Bothrops jararaca (VBj) foi tratado com Fluoreto de fenil-metil-sulfonila (PMSF), 1,10- fenantrolina (OF) ou Brometo de p-bromafenacila (p-BPB) para inibição destas enzimas. Observou-se parâmetros de leucócitos em rolling, aderidos e migrados na interação leucócito-endotélio, após a injeção de 1g dos veneno tratados no subcutâneo da bolsa escrotal de camundongos. Os resultados foram comparados aos obtidos com o veneno bruto, sem tratamento. Os animais injetados com VBj bruto apresentaram um aumento marcante de adesão celular em todos os tempos estudados, sendo o pico dessa interação entre a 2ª e 4ª hora após a injeção. Os grupos injetados com VBj também apresentaram o maior número de células migradas na 4ª h, permanecendo esse número alto na 24ª hora e diminuindo significativamente na 48ªh após a injeção do VBj. Baseando-se nesta cinética, todos os outros estudos foram verificados na 2ª e 24ª hora. Os resultados mostraram que o tratamento do VBj com OF resultou diferenças significantes nas alterações da interação leucócito-endotélio. Nos venenos tratados para inibição de serinoproteases e FLA2 verificou-se que o tratamento não resultou em diferenças nos parâmetros de interação leucócito-endotélio, quando comparados ao grupo injetado com o veneno bruto, nos dois tempos estudados. Tratamentos farmacológicos indicam que os eicosanóides originados da via da ciclooxigenase, TNF- e NO participam da mediação da interação leucócito endotélio induzidos pelo VBj. Mas aparentemente não os eicosanóides originados pela via das lipoxigenase, histamina ou serotonina,. O efeito do soro antibotrópico (SAB) na interação leucócito-endotélio induzido por VBj também foi avaliado. O SAB induziu, per se, uma interação leucócito-endotélio semelhante ao observado em animais injetados com VBj, efeito este aparentemente devido ao fenol utilizado como conservante no antiveneno. Utilizando-se um soro antibotrópico sem fenol, estas reações não foram observadas e verificou-se que o soro sem fenol evita as alterações na interação leucócito-endotélio induzidas pelo VBj. Em conclusão, conjuntamente nossos dados indicam que: 1) as metaloproteases tem maior importância, e que as fosfolipases e serinoproteases tem um papel secundário nas alterações na interação leucócito-endotélio induzida pelo VBj; 2) que os eicosanóides são os principais mediadores nestes parâmetros inflamatórios e 3) que o SAB possui anticorpos contra as toxinas do veneno que induzem alterações na interação, mas o fenol presente no soro é responsável pelas reações pró-inflamatórios indesejadas. Finalmente, os resultados sugerem que a associação de antiinflamatórios à soroterapia para o tratamento das reações inflamatórias locais induzidas pelo VBj deve ser considerada e estudada mais aprofundadamente. / Toxins classified as serineproteases, metalloproteases or phospholipases A2, isolated from venoms of Bothrops snakes can induce inflammatory reactions that contribute to the severity of local symptoms observed in envenomation. Nevertheless, the real contribution of each one of these classes of toxins to the inflammatory effect of whole venom is poorly understood. In this study, Bothrops jararaca venom (BjV) was treated with phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride (PMSF), 1,10-phenantroline (sPhe) or p-bromophenacyl bromide (pBPB), to inhibit those classes of enzymes. Inflammatory parameters of leukocyte-endothelial interaction (LEI), namely leukocytes rolling, adhesion or migration, observed after injecting of 1mg of treated venoms into the subcutaneous tissue of the scrotal bag of mice, were evaluated and compared to those observed after the injection of non-treated venom. Animals injected with BjV presented an a marked expressive increase in cellular adhesion in all periods of time studied, but peaking between 2 and 4h after BjV injection. The venom-injected groups also presented the highest number of migrated cells hour 4, wich remained up to hour 24, and decreasing significantly 48h after the BjV injection. Based on this kinetics, all other studied were performed evaluating LEI parameters on 2nd and 24th hour after venom injection. Results showed that sPhe -treated venom presented significant differences in LEI. LEI parameters induced by pBPB- and PMSF-treated venom were similar to those observed with non-treated venom. Pharmacological treatments indicate that eicosanoids from the cyclooxygenase pathway, TNF- and NO participate on the mediation of the alterations of leukocyte-endothelium interaction induced by venom. Eicosanoids from the lipoxygenase pathway, histamine and serotonin apparently do not mediate these alterations. The effect of the Bothrops antivenom in blocking the disturbances of leukocyte-endothelial interaction induced by BjV was also evaluated. Surprisingly, the antivenom per se induced alterations in LEI similar to those induced by the venom. Conversely, a phenol-free antivenom did not induce LEI alterations and avoid those induced by the BjV. In conclusion, our findings indicated that: 1) the major importance of metalloproteases, and a secondary role for phospholipases and serineproteases in alterations of leukocyte-endothelial interactions induced by Bothrops jararaca venom; 2) eicosanoids are the main mediators of these alterations; 3) the Bothrops antivenom has antibodies against toxins that induce LEI alteration, but the phenol used in antivenom as a preservative can cause some undesired pro-inflammatory reactions. Finally, present results indicate that the use of anti-inflammatory drugs associated with serum therapy for the treatment of local inflammatory reactions induced by Bothrops snake venoms should be considered and further studied.

Toxinas classificadas como serinoproteases, metaloproteases e fosfolipases A2, isoladas de venenos botrópicos, podem induzir reações inflamatórias que contribuem na gravidade dos sintomas locais observados nestes envenenamentos. Entretanto, a contribuição efetiva de cada uma destas toxinas no efeito inflamatório induzido pelo veneno não é bem compreendida. Neste estudo, o veneno de Bothrops jararaca (VBj) foi tratado com Fluoreto de fenil-metil-sulfonila (PMSF), 1,10- fenantrolina (OF) ou Brometo de p-bromafenacila (p-BPB) para inibição destas enzimas. Observou-se parâmetros de leucócitos em rolling, aderidos e migrados na interação leucócito-endotélio, após a injeção de 1g dos veneno tratados no subcutâneo da bolsa escrotal de camundongos. Os resultados foram comparados aos obtidos com o veneno bruto, sem tratamento. Os animais injetados com VBj bruto apresentaram um aumento marcante de adesão celular em todos os tempos estudados, sendo o pico dessa interação entre a 2ª e 4ª hora após a injeção. Os grupos injetados com VBj também apresentaram o maior número de células migradas na 4ª h, permanecendo esse número alto na 24ª hora e diminuindo significativamente na 48ªh após a injeção do VBj. Baseando-se nesta cinética, todos os outros estudos foram verificados na 2ª e 24ª hora. Os resultados mostraram que o tratamento do VBj com OF resultou diferenças significantes nas alterações da interação leucócito-endotélio. Nos venenos tratados para inibição de serinoproteases e FLA2 verificou-se que o tratamento não resultou em diferenças nos parâmetros de interação leucócito-endotélio, quando comparados ao grupo injetado com o veneno bruto, nos dois tempos estudados. Tratamentos farmacológicos indicam que os eicosanóides originados da via da ciclooxigenase, TNF- e NO participam da mediação da interação leucócito endotélio induzidos pelo VBj. Mas aparentemente não os eicosanóides originados pela via das lipoxigenase, histamina ou serotonina,. O efeito do soro antibotrópico (SAB) na interação leucócito-endotélio induzido por VBj também foi avaliado. O SAB induziu, per se, uma interação leucócito-endotélio semelhante ao observado em animais injetados com VBj, efeito este aparentemente devido ao fenol utilizado como conservante no antiveneno. Utilizando-se um soro antibotrópico sem fenol, estas reações não foram observadas e verificou-se que o soro sem fenol evita as alterações na interação leucócito-endotélio induzidas pelo VBj. Em conclusão, conjuntamente nossos dados indicam que: 1) as metaloproteases tem maior importância, e que as fosfolipases e serinoproteases tem um papel secundário nas alterações na interação leucócito-endotélio induzida pelo VBj; 2) que os eicosanóides são os principais mediadores nestes parâmetros inflamatórios e 3) que o SAB possui anticorpos contra as toxinas do veneno que induzem alterações na interação, mas o fenol presente no soro é responsável pelas reações pró-inflamatórios indesejadas. Finalmente, os resultados sugerem que a associação de antiinflamatórios à soroterapia para o tratamento das reações inflamatórias locais induzidas pelo VBj deve ser considerada e estudada mais aprofundadamente. / Toxins classified as serineproteases, metalloproteases or phospholipases A2, isolated from venoms of Bothrops snakes can induce inflammatory reactions that contribute to the severity of local symptoms observed in envenomation. Nevertheless, the real contribution of each one of these classes of toxins to the inflammatory effect of whole venom is poorly understood. In this study, Bothrops jararaca venom (BjV) was treated with phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride (PMSF), 1,10-phenantroline (sPhe) or p-bromophenacyl bromide (pBPB), to inhibit those classes of enzymes. Inflammatory parameters of leukocyte-endothelial interaction (LEI), namely leukocytes rolling, adhesion or migration, observed after injecting of 1mg of treated venoms into the subcutaneous tissue of the scrotal bag of mice, were evaluated and compared to those observed after the injection of non-treated venom. Animals injected with BjV presented an a marked expressive increase in cellular adhesion in all periods of time studied, but peaking between 2 and 4h after BjV injection. The venom-injected groups also presented the highest number of migrated cells hour 4, wich remained up to hour 24, and decreasing significantly 48h after the BjV injection. Based on this kinetics, all other studied were performed evaluating LEI parameters on 2nd and 24th hour after venom injection. Results showed that sPhe -treated venom presented significant differences in LEI. LEI parameters induced by pBPB- and PMSF-treated venom were similar to those observed with non-treated venom. Pharmacological treatments indicate that eicosanoids from the cyclooxygenase pathway, TNF- and NO participate on the mediation of the alterations of leukocyte-endothelium interaction induced by venom. Eicosanoids from the lipoxygenase pathway, histamine and serotonin apparently do not mediate these alterations. The effect of the Bothrops antivenom in blocking the disturbances of leukocyte-endothelial interaction induced by BjV was also evaluated. Surprisingly, the antivenom per se induced alterations in LEI similar to those induced by the venom. Conversely, a phenol-free antivenom did not induce LEI alterations and avoid those induced by the BjV. In conclusion, our findings indicated that: 1) the major importance of metalloproteases, and a secondary role for phospholipases and serineproteases in alterations of leukocyte-endothelial interactions induced by Bothrops jararaca venom; 2) eicosanoids are the main mediators of these alterations; 3) the Bothrops antivenom has antibodies against toxins that induce LEI alteration, but the phenol used in antivenom as a preservative can cause some undesired pro-inflammatory reactions. Finally, present results indicate that the use of anti-inflammatory drugs associated with serum therapy for the treatment of local inflammatory reactions induced by Bothrops snake venoms should be considered and further studied.