La culture de cortex ovarien se pose comme une alternative à l'autogreffe après autoconservation ovarienne. Pour améliorer la survie folliculaire après congélation, nous avons évalué chez la brebis l'influence de l'épaisseur de cortex ; 0,5 vs 1mm, du support de culture et du cryoprotecteur DMSO 2M vs PROH 1,5M+sucrose 0,3M. L'épaisseur de tissu de 1mm sur filtre millicell avec le protocole de congélation DMSO 2M a montré les meilleurs résultats avec 39% de survie folliculaire au 4e jour de culture. Sur tissu frais de brebis et humain, nous avons exploré un éventuel déficit d'expression en culture de Gdf9, de Bmp15 et de leur récepteurs qui expliquerait le blocage de croissance folliculaire in vitro. Dans les deux modèles la présence des ARNm et des protéines de Gdf9 et Bmp15 est maintenue et l'expression protéique de leurs récepteurs BmprIA, BmprIB, BmprII est conservée. Ce travail montre que la survie en culture après cryoconservation peut être optimisée, la cause du blocage de croissance reste à définir

L’hormone anti-Müllerienne (AMH), une glycopréotéine exclusivement produite par les cellules de la granulosa (CG) des follicules ovariens de la femme, est un marqueur unique de du statut folliculaire ovarien. Contrairement à l’inhibine B, l’estradiol et la FSH, l’AMH est produite par un large éventail de follicules allant des follicules primaires aux follicules à petit antrum. Cependant, les mécanismes précis régulant la production d’AMH par les CG restent mal connus. Nous avons montré que la sélection folliculaire précoce au cours de la phase de transition lutéo-folliculaire, un phénomène fréquemment retrouvé chez les femmes ayant un vieillissement ovarien, caractérisé par la présence d’au moins un follicule surdéveloppé au cours de la phase folliculaire précoce, n’altérait pas la puissance de la relation entre le compte folliculaire antral et les concentrations sériques d’AMH. En revanche, cette situation perturbait significativement celle entre le nombre de follicules antraux et les taux sériques de FSH, d’inhibine B et d’estradiol. Nous avons par la suite mis en évidence, en utilisant un nouvel outil, nommé Follicular Output RaTe (FORT), que le pourcentage de follicules qui répondent effectivement à la FSH exogène en atteignant la maturation pré-ovulatoire, était négativement et indépendamment lié aux taux sériques d’AMH, ce qui va dans le sens de l’hypothèse d’un effet inhibiteur de l’AMH sur la sensibilité des follicules à la FSH. Ensuite, nous avons regardé si la production d’AMH par ovaire et par follicule était altérée chez les femmes n’ayant plus qu’un seul ovaire suite à une ovariecomie unilatérale. En effet, tout indique que chez ces femmes, des réarrangements majeurs de la folliculogenèse sont mis en place pour maintenir une fonction ovarienne malgré la perte brutale d’une partie du pool folliculaire. Ainsi, par une analyse extensive et comparative de la folliculogenèse utilisant des marqueurs hormono-folliculiares, nous n’avons pu mettre aucune modification significative chez les femmes avec un ovaire unique, comparativement aux contrôles. A l’aide du modèle précédemment utilisé, nous avons constaté une augmentation de la sensibilité des follicules antraux à la FSH exogène, évaluée par le FORT, chez des femmes avec un seul ovaire, comparativement aux femmes avec 2 ovaires. Ces résultats supportent l’hypothèse d’une augmentation de la sensibilité folliculaire à la FSH, qui pourrait faire partie des possibles mécanismes compensatoires en jeu dans le maintien d’une folliculogenèse efficace chez les femmes ayant eu une ovariectomie unilatérale.Finalement, à l’aide de 2 approches complémentaires, in vitro and in vivo, nous avons montré que la FSH et l’AMPc stimulaient la transcription de l’AMH, et que la LH avait un effet additif. Nous avons montré que les gonadotrophines et l’AMPc agissaient à travers la protéine kinase A et la P38 MAP Kinase, impliquant notamment les facteurs de transcription GATA binding factor-4 et le steroidogenic factor-1. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence que l’expression d’AMH pouvait être régulée de manière différentielle par l’estradiol, en fonction du type de récepteur aux estrogènes exprimés par les CG. Ainsi, la chute d’expression de l’AMH au sein des CG des follicules matures, qui expriment essentiellement ERβ, est probablement liée à un effet de l’estradiol. En résumé, ces travaux de thèse ont permis d’apporter de nouvelles données sur la régulation de la croissance folliculaire et sur la production d’AMH chez la femme. / Anti-Müllerian hormone (AMH), a glycoprotein that is exclusively produced by the granulosa cells (GC) of ovarian follicles in the adult female, is a unique biomarker of ovarian follicular status. In contrast with inhibin B, estradiol and FSH, AMH is produced in a wide range of follicles that goes from the primary to the small antral stages of folliculogenesis. However, the precise mechanisms that drive AMH expression by GC remain poorly understood.We showed that untimely and/or accelerated antral follicle growth during the luteal–follicular transition, a phenomenon that is frequent in ovarian-aged women and that is characterized by the presence of at least one overdeveloped antral follicle during the first days of the follicular phase does not alter the strength of the relationship between antral follicle count and serum AMH levels but does affect the relationship between serum FSH, inhibin B and estradiol levels and the number of antral follicles. The heftiness of AMH in relation to advanced antral follicle growth provides a further explanation for the reported stronger association between serum AMH levels and antral follicle counts as compared with the other hormonal markers of the ovarian fertility status. We subsequently demonstrated, using an innovative tool, the Follicular Output RaTe (FORT), that the percentage of follicles that effectively respond to exogenous FSH by reaching pre-ovulatory maturation is negatively and independently related to serum AMH levels, which is in keeping with the hypothesis that AMH inhibits follicle sensitivity to FSH. Given this hypothesis, we wondered if per-ovary and per-follicle AMH production could be altered in patients having a single ovary as a result of unilateral oophorectomy. Indeed, all indicate that major rearrangements of folliculogenesis occur to preserve and maintain ovarian function despite the abrupt halving of follicular stockpile in these patients. We performed an extensive and comparative evaluation of the folliculogenesis using homono-follicular markers failing to show major changes in unilaterally oophorectomized when compared with control women. Using the same model, we demonstrated an increased antral follicle responsiveness to exogenous FSH, as assessed by FORT, in normo-ovulating unilaterally oophorectomized women undergoing controlled ovarian hyperstimulation. These results support the hypothesis that increased FSH sensitivity ranks among the possible compensating mechanisms at stake in the maintenance of successful folliculogenesis after unilateral oophorectomy.Finally, using complementary approaches, in vitro and in vivo, we showed that FSH and cAMP enhance AMH transcription, and LH has an additive effect. Gonadotropins and cAMP act through protein kinase A and p38 MAPK signaling pathways and involve the GATA binding factor-4 and steroidogenic factor-1 transcription factors, among others. The expression profile of AMH and the dynamics of serum AMH after gonadotropin stimulation have been interpreted as a down-regulating effect of FSH upon AMH production by GC. We also demonstrated that AMH expression can be differentially regulated by estradiol depending on the estradiol receptors by GC. Therefore the decrease in AMH expression by GC of mature follicles, which mainly express ERβ, is likely due to the effect of estradiol.In short, this Ph.D. work offers new insight into the regulation of the follicular growth and AMH production in woman.

De nos jours, la cryoconservation est une technique très largement utilisée dans les protocoles d’assistance à la reproduction ou comme outil pour la sauvegarde des ressources génétiques. Toutefois, la chienne est un modèle animal complexe pour l’application des biotechnologies de la reproduction du fait de ses nombreuses singularités anatomiques et physiologiques. L’objectif de notre travail était d’étudier et de développer une méthode de cryoconservation des ressources génétiques chez la chienne par le biais de deux types de ressources : les embryons et le tissu ovarien. Après avoir mis au point une méthode de collecte d’embryons, nous nous sommes appliqués à la constitution d’un stock d’embryons cryoconservés en prévision d’un transfert embryonnaire. L’étude et le développement d’un protocole de cryoconservation du tissu ovarien ont été abordés après avoir adapté et validé nos méthodes d’analyses in vitro. L’utilisation de plans d’expériences factoriels fractionnaires a permis de mettre en évidence les facteurs les plus influents sur la qualité de la réserve folliculaire (nature du cryoprotecteur pénétrant, cinétique de congélation, étapes d’équilibration) et de proposer un protocole de cryoconservation. La combinaison du DMSO incorporé en un seul bain d’équilibration avec une vitesse de congélation de 0,3°C/min est apparue comme la combinaison la plus appropriée à la cryoconservation de tissu ovarien chez la chienne et a permis d’observer, après xénogreffe de tissu ovarien cryoconservé, une reprise de la croissance folliculaire et de l’activité hormonale du tissu greffé / Nowadays, cryopreservation is widely used in animal assisted reproduction or safeguarding of genetic resources. Nevertheless, the bitch is a complex animal model concerning the use of this biotechnology, due to numerous anatomical and physiological peculiarities. The aim of our research work was to investigate and develop a method of cryopreservation of genetic resources in the bitch by exploring two kinds of resources: embryos and ovarian tissue. After the setting up of a method for embryo collection, we have built up a stock of cryopreserved embryo for subsequent embryo transfer. After a preliminary validation of our in vitro assessment methods, the investigation and development of a cryopreservation protocol has been conducted. The use of fractional experimental design allowed us to highlight the main factors affecting the follicular pool quality (CPA nature, freezing rate and equilibration steps). The combination of DMSO incorporated in a unique equilibration bath with a freezing rate of 0.3°C/min appeared to be suitable for the cryopreservation of bitch ovarian tissue. Finally, Follicular growth and hormonal activity resumption have been observed after xenotransplantation of cryopreserved bitch ovarian tissue