A doença de Chagas, que é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocasiona grandes danos à saúde da população latino-americana e vem-se distribuindo para regiões não-endêmicas como os Estados Unidos, Europa e Japão. O tratamento é realizado pela administração de dois medicamentos (Nifurtimox e Benzonidazol) que apresentam sérios efeitos colaterais e baixa eficácia. A busca por novos compostos químicos bioativos com ação farmacológica sobre alvos bioquímicos constitui uma estratégia em desenvolvimento em nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, a principal cisteino protease - a cruzaína, e a enzima central na biossíntese de pirimidinas - a DHODH, ambas de T. cruzi, foram escolhidas como alvos para a identificação de novos inibidores com ação potencial contra o T. cruzi. A síntese de inibidores dessas duas enzimas foi realizada e os ensaios bioquímicos foram usados para identificar novos inibidores em concentrações micro- e nanomolar. Alguns desses inibidores enzimáticos foram ensaiados contra o T. cruzi em sua forma infectiva tripomastigota e foram ativos em concentrações micromolar. A enzima cruzaína (3.4.22.51) possui similaridade baixa na sequência de aminoácidos (18%) com a Catepsina-L (Cat-L, EC 3.4.22.15), mas suficiente para estabelecer a hipótese de que inibidores de Cat-L também poderiam inibir a cruzaína. Assim, com base no conhecimento prévio de vários inibidores da Cat-L, o dipeptídeo-nitrila Neq409 foi inicialmente sintetizado por outro membro do grupo para validar a hipótese de que nitrilas dipeptídicas poderiam inibir a cruzaína. O composto Neq409 inibiu a cruzaína com o valor de pIC50 igual a 5,7 que o qualificou não apenas como inibidor da cruzaína mas também como possível composto matriz para modificação molecular e estudos de relações estrutura-atividade (SAR). Cinco compostos foram então sintetizados através de uma rota de quatro etapas (proteção/desproteção de ácidos carboxílicos e duas formações de amida) e avaliados através de métodos fluorimétricos quanto às suas capacidades de inibir cruzaína. As modificações moleculares resultaram em aumento da potência de até 13 vezes em relação ao composto protótipo Neq409. A substituição do grupo benzoíla, presente em P3 no Neq409, pelo grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol (Neq414) e 5-bromopiridina (Neq419) resultou nos valores de pIC50 de 6,5 e 6,1, respectivamente. A substituição do átomo de hidrogênio por cloro na posição meta da fenila em P2 no composto Neq414 deu origem ao composto Neq415 com pIC50 de 6,8. Outras duas modificações envolveram a inserção do grupo ciclopropila na região P1 do composto Neq0414 gerando o Neq533 (pIC50 = 6,8) e do composto Neq533 resultando no composto Neq543 (pIC50 = 6,2). Os resultados mostraram que o grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol apresenta interações mais eficientes no sub-sítio S3 da cruzaína que o grupo 5-bromopiridina e que um átomo de cloro em P2 e um grupo ciclopropila em P1 possuem contribuições semelhantes para o aumento da potência de inibição da enzima. A busca de inibidores da enzima TcDHODH pelo grupo NEQUIMED levou à identificação de dois novos inibidores nanomolares, o Neq71 (pKi = 6,5) e o Neq130 (pKi = 6,4), ambos derivados de 5-arilpropilidenobarbitúricos. Com base nesses resultados, foi realizada a síntese do Neq71, Neq130 e de um novo inibidor - o Neq0393, biosóstero do composto Neq130, utilizando a condensação de Knoevenagel em meio aquoso sem catalisador, por adaptação de método já descrito anteriormente na literatura. Para avaliar a importância insaturação exocíclica ao anel barbitúrico desses derivados, o Neq71, Neq130 e o Neq393 foram submetidos à redução específica dessa insaturação utilizando-se NaBH4 que resultou nos compostos Neq395, Neq298 e Neq394, respectivamente. Os compostos Neq542, Neq421 e Neq420 derivados 5-metilidenobarbitúricos também foram sintetizados através do mesmo procedimento utilizado para obtenção de Neq71, Neq130 e Neq393, para avaliar a importância do comprimento da cadeia dos derivados 5-arilpropilidenobarbitúricos. A análise das constantes de inibição dos compostos obtidos mostrou que a redução da instauração resulta de até 280 vezes de potência, enquanto o encurtamento da cadeia lateral levou a diminuição de menor escala da potência (25 vezes), indicando a importância da instauração exocíclica para a afinidade dos compostos com a enzima. A característica eletrofílica desta instauração levou identificação de um novo esqueleto para futuros inibidores, o Neq411. / Chagas disease, which is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, causes severe damage to the health of the population in Latin American countries and comes up distributing to non-endemic regions such as the United States, Europe and Japan. The treatment is accomplished by administering two drugs (Benznidazole and Nifurtimox) that have serious side effects and low efficacy. The search for new bioactive chemical compounds with pharmacological action on biochemical targets is a strategy under development in our research group. In this study, the major cysteine protease - cruzain, and the central enzyme in the biosynthesis of pyrimidines - DHODH, both from T. cruzi, were chosen as targets for the identification of new inhibitors with potential activity against T. cruzi. The synthesis of inhibitors of these two enzymes was performed and biochemical assays were used to identify new inhibitors at micro- and nanomolar concentrations. Some of these enzyme inhibitors were tested against T. cruzi infective trypomastigote form and were active at micromolar concentrations. The cruzain enzyme (EC 3.4.22.51) has low similarity in amino acid sequence (18 %) towards Cathepsin L (Cat-L, EC 3.4.22.15 ), but sufficient to establish the hypothesis that Cat-L inhibitors could also inhibit cruzain. Thus, based on prior knowledge of various Cat-L inhibitors, a dipeptide nitrile - Neq409 was initially synthesized by another group member in order to validate the hypothesis that dipeptide nitriles could really inhibit cruzain. The compound Neq409 inhibited cruzain with a pIC50 value of 5.7, which qualified it not only as an inhibitor of cruzain but also as a possible lead compound for molecular modification and structure-activity relationships (SAR) studies. Five compounds were then designed and synthesized through a route of four steps (protection/deprotection of carboxylic acids and two formations of amides) and evaluated using fluorimetric methods to evaluate their ability to inhibit cruzain. The molecular changes for most potent compound resulted in 13-fold potency increase as compared to the prototype compound Neq0409. The replacement of the P3 benzoyl group present in the Neq409 by 3-carboxy-5-tert- butyl-2-methylpyrazole (Neq0414) and 5- bromopyridine (Neq0419) resulted in the pIC50 values of 6.5 and 6.1, respectively. The replacement of the hydrogen atom by chlorine in the meta position of the phenyl at P2 in the compound neq0414 yielded compound Neq415 with a pIC50 of 6.8. Two other modifications involved the insertion of the cyclopropyl group in the P1 region of Neq0414 generating compound Neq0533 (pIC50 = 6.8) and compounds Neq0533 resulting in compound neq0543 with a pIC50 of 6.2. The results showed that the 3-carboxy-5-tert-butyl-2-methylpyrazole provides more efficient interactions in the cruzain S3 sub-site than 5- bromopyridine group and a chlorine atom at P2 and a cyclopropyl group at P1. The search for inhibitors of the enzyme TcDHODH led to the identification of two new nanomolar inhibitors, the Neq0071 (pKi = 6.5) and Neq0130 (pKi = 6.4), both derived from 5-aril-propiliden-barbituric acid. The Neq393, a bioisostere compound of Neq0130, was synthesized using the Knoevenagel condensation in aqueous media without catalyst, by adaptation of the method previously described in the literature. Based on these results, the synthesis of Neq71, Neq130 and a new inhibitor was performed. To assess the importance of exocyclic barbiturate ring unsaturation, Neq71, Neq130 and Neq393 underwent specific reduction of such unsaturation using NABH4 that resulted in compounds Neq395, Neq298 and Neq0394, respectively. Neq542, Neq421 and Neq420 derived compounds of 5-metilidenobarbiturate were also synthesized by the same procedure used to obtain Neq71 and Neq393 to evaluate the importance of the length of the 5-arilpropilidenobarbiturate derivatives. The inhibition constant of these compounds showed that de lack of the exocyclic double bond decreased the potency 200 times and the shrinkage of the side chain to a decrease of 25 times, showing the importance of the exocyclic bond for the inhibitors affinity for the enzyme. The electrophilicity of this bond lead to an identification of a new scaffold for novel inhibitors, the Neq411.

A doença de Chagas, que é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocasiona grandes danos à saúde da população latino-americana e vem-se distribuindo para regiões não-endêmicas como os Estados Unidos, Europa e Japão. O tratamento é realizado pela administração de dois medicamentos (Nifurtimox e Benzonidazol) que apresentam sérios efeitos colaterais e baixa eficácia. A busca por novos compostos químicos bioativos com ação farmacológica sobre alvos bioquímicos constitui uma estratégia em desenvolvimento em nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, a principal cisteino protease - a cruzaína, e a enzima central na biossíntese de pirimidinas - a DHODH, ambas de T. cruzi, foram escolhidas como alvos para a identificação de novos inibidores com ação potencial contra o T. cruzi. A síntese de inibidores dessas duas enzimas foi realizada e os ensaios bioquímicos foram usados para identificar novos inibidores em concentrações micro- e nanomolar. Alguns desses inibidores enzimáticos foram ensaiados contra o T. cruzi em sua forma infectiva tripomastigota e foram ativos em concentrações micromolar. A enzima cruzaína (3.4.22.51) possui similaridade baixa na sequência de aminoácidos (18%) com a Catepsina-L (Cat-L, EC 3.4.22.15), mas suficiente para estabelecer a hipótese de que inibidores de Cat-L também poderiam inibir a cruzaína. Assim, com base no conhecimento prévio de vários inibidores da Cat-L, o dipeptídeo-nitrila Neq409 foi inicialmente sintetizado por outro membro do grupo para validar a hipótese de que nitrilas dipeptídicas poderiam inibir a cruzaína. O composto Neq409 inibiu a cruzaína com o valor de pIC50 igual a 5,7 que o qualificou não apenas como inibidor da cruzaína mas também como possível composto matriz para modificação molecular e estudos de relações estrutura-atividade (SAR). Cinco compostos foram então sintetizados através de uma rota de quatro etapas (proteção/desproteção de ácidos carboxílicos e duas formações de amida) e avaliados através de métodos fluorimétricos quanto às suas capacidades de inibir cruzaína. As modificações moleculares resultaram em aumento da potência de até 13 vezes em relação ao composto protótipo Neq409. A substituição do grupo benzoíla, presente em P3 no Neq409, pelo grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol (Neq414) e 5-bromopiridina (Neq419) resultou nos valores de pIC50 de 6,5 e 6,1, respectivamente. A substituição do átomo de hidrogênio por cloro na posição meta da fenila em P2 no composto Neq414 deu origem ao composto Neq415 com pIC50 de 6,8. Outras duas modificações envolveram a inserção do grupo ciclopropila na região P1 do composto Neq0414 gerando o Neq533 (pIC50 = 6,8) e do composto Neq533 resultando no composto Neq543 (pIC50 = 6,2). Os resultados mostraram que o grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol apresenta interações mais eficientes no sub-sítio S3 da cruzaína que o grupo 5-bromopiridina e que um átomo de cloro em P2 e um grupo ciclopropila em P1 possuem contribuições semelhantes para o aumento da potência de inibição da enzima. A busca de inibidores da enzima TcDHODH pelo grupo NEQUIMED levou à identificação de dois novos inibidores nanomolares, o Neq71 (pKi = 6,5) e o Neq130 (pKi = 6,4), ambos derivados de 5-arilpropilidenobarbitúricos. Com base nesses resultados, foi realizada a síntese do Neq71, Neq130 e de um novo inibidor - o Neq0393, biosóstero do composto Neq130, utilizando a condensação de Knoevenagel em meio aquoso sem catalisador, por adaptação de método já descrito anteriormente na literatura. Para avaliar a importância insaturação exocíclica ao anel barbitúrico desses derivados, o Neq71, Neq130 e o Neq393 foram submetidos à redução específica dessa insaturação utilizando-se NaBH4 que resultou nos compostos Neq395, Neq298 e Neq394, respectivamente. Os compostos Neq542, Neq421 e Neq420 derivados 5-metilidenobarbitúricos também foram sintetizados através do mesmo procedimento utilizado para obtenção de Neq71, Neq130 e Neq393, para avaliar a importância do comprimento da cadeia dos derivados 5-arilpropilidenobarbitúricos. A análise das constantes de inibição dos compostos obtidos mostrou que a redução da instauração resulta de até 280 vezes de potência, enquanto o encurtamento da cadeia lateral levou a diminuição de menor escala da potência (25 vezes), indicando a importância da instauração exocíclica para a afinidade dos compostos com a enzima. A característica eletrofílica desta instauração levou identificação de um novo esqueleto para futuros inibidores, o Neq411. / Chagas disease, which is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, causes severe damage to the health of the population in Latin American countries and comes up distributing to non-endemic regions such as the United States, Europe and Japan. The treatment is accomplished by administering two drugs (Benznidazole and Nifurtimox) that have serious side effects and low efficacy. The search for new bioactive chemical compounds with pharmacological action on biochemical targets is a strategy under development in our research group. In this study, the major cysteine protease - cruzain, and the central enzyme in the biosynthesis of pyrimidines - DHODH, both from T. cruzi, were chosen as targets for the identification of new inhibitors with potential activity against T. cruzi. The synthesis of inhibitors of these two enzymes was performed and biochemical assays were used to identify new inhibitors at micro- and nanomolar concentrations. Some of these enzyme inhibitors were tested against T. cruzi infective trypomastigote form and were active at micromolar concentrations. The cruzain enzyme (EC 3.4.22.51) has low similarity in amino acid sequence (18 %) towards Cathepsin L (Cat-L, EC 3.4.22.15 ), but sufficient to establish the hypothesis that Cat-L inhibitors could also inhibit cruzain. Thus, based on prior knowledge of various Cat-L inhibitors, a dipeptide nitrile - Neq409 was initially synthesized by another group member in order to validate the hypothesis that dipeptide nitriles could really inhibit cruzain. The compound Neq409 inhibited cruzain with a pIC50 value of 5.7, which qualified it not only as an inhibitor of cruzain but also as a possible lead compound for molecular modification and structure-activity relationships (SAR) studies. Five compounds were then designed and synthesized through a route of four steps (protection/deprotection of carboxylic acids and two formations of amides) and evaluated using fluorimetric methods to evaluate their ability to inhibit cruzain. The molecular changes for most potent compound resulted in 13-fold potency increase as compared to the prototype compound Neq0409. The replacement of the P3 benzoyl group present in the Neq409 by 3-carboxy-5-tert- butyl-2-methylpyrazole (Neq0414) and 5- bromopyridine (Neq0419) resulted in the pIC50 values of 6.5 and 6.1, respectively. The replacement of the hydrogen atom by chlorine in the meta position of the phenyl at P2 in the compound neq0414 yielded compound Neq415 with a pIC50 of 6.8. Two other modifications involved the insertion of the cyclopropyl group in the P1 region of Neq0414 generating compound Neq0533 (pIC50 = 6.8) and compounds Neq0533 resulting in compound neq0543 with a pIC50 of 6.2. The results showed that the 3-carboxy-5-tert-butyl-2-methylpyrazole provides more efficient interactions in the cruzain S3 sub-site than 5- bromopyridine group and a chlorine atom at P2 and a cyclopropyl group at P1. The search for inhibitors of the enzyme TcDHODH led to the identification of two new nanomolar inhibitors, the Neq0071 (pKi = 6.5) and Neq0130 (pKi = 6.4), both derived from 5-aril-propiliden-barbituric acid. The Neq393, a bioisostere compound of Neq0130, was synthesized using the Knoevenagel condensation in aqueous media without catalyst, by adaptation of the method previously described in the literature. Based on these results, the synthesis of Neq71, Neq130 and a new inhibitor was performed. To assess the importance of exocyclic barbiturate ring unsaturation, Neq71, Neq130 and Neq393 underwent specific reduction of such unsaturation using NABH4 that resulted in compounds Neq395, Neq298 and Neq0394, respectively. Neq542, Neq421 and Neq420 derived compounds of 5-metilidenobarbiturate were also synthesized by the same procedure used to obtain Neq71 and Neq393 to evaluate the importance of the length of the 5-arilpropilidenobarbiturate derivatives. The inhibition constant of these compounds showed that de lack of the exocyclic double bond decreased the potency 200 times and the shrinkage of the side chain to a decrease of 25 times, showing the importance of the exocyclic bond for the inhibitors affinity for the enzyme. The electrophilicity of this bond lead to an identification of a new scaffold for novel inhibitors, the Neq411.