Le COP9 (Constitutive photomorphogenesis 9) signalosome (CSN) est un complexe multiprotéique contenant huit sous-unités (320 kDa), impliqué dans des processus cellulaires divers allant de la progression du cycle cellulaire, à l'expression des gènes et la réparation de l'ADN, à travers sa fonction au sein du système ubiquitine-protéasome. Il s'agit d'un complexe fortement conservé au cours de l'évolution chez les eucaryotes supérieurs chez qui son activité catalytique est essentielle. Au cours des années d'études biologiques et biochimiques qui ont permis d'élucider le rôle du CSN, sa fonction la mieux étudiée et la mieux comprise est celle liée au contrôle de l'ubiquitylation des protéines (une modification post-traductionnelle qui implique la liaison covalente d'une protéine cible par une molécule d'ubiquitine) par une classe d'E3 ubiquitine ligases. L'activité catalytique du CSN régule spécifiquement les E3 cullin RING ubiquitin ligases (CRLs) via la suppression d'une molécule ressemblant à l'ubiquitine, Nedd8 (cullin-neural precursor cell expressed developmentally downregulated gene 8) des CRLs au cours d'une réaction de déneddylation. Les cycles de neddylation/déneddylation sont essentiels au fonctionnement correct des CRLs et le CSN joue un rôle central dans ce processus à travers sa fonction de déneddylase. Une similarité globale lie le CSN, le chapeau du protéasome (19S) et le complexe elF3 (eukaryotic initiation factor-3). Ces assemblages multi-protéiques comprennent tous six sous-unités contenant un domaine PCI (proteasome COP9 eIF3) et deux sous-unités contenant un domaine MPN (Mpr1–Pad1–N-terminal). L'activité catalytique du CSN est portée par la sous-unité 5, CSN5 qui hydrolyse la liaison isopeptidique entre Nedd8 et la CRL. CSN5 contient un cœur catalytique dépendent d'un zinc et comprenant un motif JAMM (Jab1/MPN/Mov34).L'incorporation de CSN5 dans le CSN révèle son activité isopeptidasique, alors qu'à l'état isolé, CSN5 n'est pas actif. Le travail réalisé au cours de ces trois ans a abouti à cinq aspects principaux qui ont contribué à une meilleure compréhension globale du système CSN. (i) S'appuyant sur la structure du domaine catalytique de CSN5, des études in vitro et in silico ont abouti à l'identification d'un élément moléculaire permettant à CSN5 de passer de la forme inactive à la forme active. Ceci a débouché sur la conception et validation d'un variant constitutivement actif de CSN5. (ii) La capacité de CSN5 à homodimériser a été étudié en solution, in silico et dans des extraits cellulaires et a apporté des perspectives potentiellement intéressantes concernant la fonction de CSN5. (iii) Au-delà de ce travail et pour aborder la question de la régulation de l'activité de CSN5 dans le CSN, la contribution de la sous-unité 6, CSN6 qui interagit directement avec CSN5 a été évaluée et ceci a abouti à l'identification de CSN6 comme sous-unité activatrice de CSN5. (iv) La caractérisation biochimique et biophysique du complexe CSN5-CSN6 a été utilisée pour explorer les bases moléculaires de cette association, non seulement, dans le contexte de son interaction avec Nedd8, mais aussi, de son intégration au sein du CSN, à travers une approche intégrée alliant des techniques biochimiques, structurales, biophysiques et computationnelles. (v) La dernière partie de ce travail est focalisée sur l'activité de maturation du précurseur de Nedd8 par le complexe CSN5-CSN6 mise en évidence in vitro et une exploration préliminaire de cette activité décrite pour la première fois est présentée. En résumé, ce travail a permis d'améliorer la compréhension des déterminants de l'activité et des mécanismes de régulation auxquels la sous-unité catalytique du CSN, CSN5 est soumise. / The COP9 (Constitutive photomorphogenesis 9) signalosome (CSN) is an eight-subunit-containing multiprotein complex (320 kDa) implicated in diverse cellular processes including cell cycle progression, gene expression and DNA repair via its function in the ubiquitin-proteasome pathway. It is a highly evolutionary conserved protein complex in higher eukaryotes for which its activity is essential. Over years of biochemical and biological studies to elucidate the role of the CSN, its most studied and best understood function is linked to the control of protein ubiquitylation (post-translational modification corresponding to the covalent conjugation of an ubiquitin molecule) by a class of E3 ubiquitin ligases. The CSN exhibits catalytic activity to regulate E3-cullin RING ubiquitin ligases (CRLs) by the removal of an ubiquitin-like protein, Nedd8 (cullin-neural precursor cell expressed developmentally downregulated gene 8), from CRLs. Cycles of neddylation/deneddylation are essential for CRL function and the CSN is central in this process through its activity as a CRL deneddylase.Structural and functional similarities link the CSN, the 19S lid of the 26S proteasome and the eukaryotic initiation factor-3 (elF3). These multi-subunit assemblies comprise six PCI (proteasome COP9 eIF3) domain subunits and two MPN (Mpr1–Pad1–N-terminal) domain-containing subunits. The catalytic activity of the CSN is centred on its subunit 5 (CSN5/Jab1), which hydrolyses the Nedd8-CRL isopeptide bond. CSN5 contains a zinc-dependent isopeptidase catalytic centre constituted of a JAMM (Jab1/MPN/Mov34) motif. CSN5 incorporation within the CSN complex unleashes its isopeptidase activity, whereas it remains inactive in isolation. The work presented in this manuscript led to five main findings. (i) Having elucidated the crystal structure of CSN5 catalytic domain, biochemical and in silico investigations that furthered the understanding of CSN5 molecular regulation, led to the identification of a potential molecular trigger enabling CSN5 to be active and the design of a constitutively active CSN5 variant form. (ii) The ability of CSN5 to homodimerise was investigated in solution, in silico and in cellular extracts and brought information that could be important for its function. (iii) Further to that work, to address CSN5 activity within the CSN, the contribution of another CSN subunit, mainly CSN6, shown to interact directly with CSN5 was evaluated and this led to the identification of CSN6 as the CSN5 activating subunit. (iv) The biochemical and biophysical characterisation of the CSN5-CSN6 complex was exploited to explore at the molecular level this complex in the context of its binding to Nedd8 and of its integration within the holo-CSN assembly through an integrated approach that includes biochemical, structural, biophysical and computational techniques. (v) Finally the CSN5-CSN6 complex was shown to be able in vitro to pursue peptidase activity on the Nedd8 precursor protein, pro-Nedd8 by cleaving its C-terminal extension (-G75G76GGLRQ) and preliminary results relating to the exploration of this new activity are presented.Overall this work allowed to gain an in-depth understanding of the activity determinants and of the regulatory mechanisms that the CSN catalytic subunit CSN5 is subjected to.

We are using the yeast two-hybrid (Y2H) system to identify novel protein-protein interactions (PPI) relevant to wood formation. Bait proteins for Y2H binary assays and screening against a xylem cDNA prey library were selected from approximately 400 Populus trichocarpa genes that are at least 8-fold more highly expressed in differentiating secondary xylem versus phloem-cambium, and designated here as poplar biomass (PB) genes. Here we report some of the interactions involving selected PB proteins and efforts to characterize their functions in Populus and Arabidopsis. Members of the ROP GTPase family, PB15 in poplar and ROP11 in Arabidopsis, interact with the domain of unknown function (DUF) 620 (DUF620) proteins (e.g., PB129 in poplar). Ectopic co-expression of PB15 and PB129 in Arabidopsis caused outgrowths at the base of flower pedicels and altered leaf morphology. Interestingly, the co-expression phenotype could not be observed in transgenic plants that are only expressing either one of the interacting partners separately. Transgenics altered in expression of PB15 and/or PB129 were prepared in Populus and characterization of transgenic trees will be performed in greenhouse and field. In addition to DUF620 family proteins, ROP11 also interacts with the COP9 subunit CSN5A in Arabidopsis. We confirmed the interaction of ROP11 and CSN5A in Y2H and employed available mutants for ROP11 and CSN5A in Arabidopsis to genetically characterize this interaction. Surprisingly, loss of ROP11 was found to rescue the csn5a-2 pleiotropic phenotype. Ectopic expression of a ROP11 dominant negative mutant in the csn5a-2 background also complemented the stunted growth phenotype. Transcript analysis and gel blot assays showed that CSN5A transcript levels remained unchanged in all rescue lines, whereas CSN5A protein levels increased relative to WT. Taken together, we concluded that ROP11 negatively regulate CSN5A protein level in plant by some as yet unknown mechanism. / Ph. D.