As more patients with cystic fibrosis (CF) are living into adulthood, patients may need to disclose their CF status to others, such as in romantic or professional settings. Patients who choose not to disclose their CF status may be limited in their closeness with others, which may negatively affect their psychological functioning and health-related quality of life. Few studies, however, have examined disclosure in CF, and currently no validated measures of CF disclosure exist. The purpose of this study was to explore CF disclosure in adults and validate a new assessment of CF disclosure, the Cystic Fibrosis Disclosure Scale (CFDS). Results were consistent with prior research in disclosure in CF, with participants disclosing most often to close others and less often at school or in the workplace. Disclosure to close and casual friends was consistently associated with better psychosocial functioning. Factor analyses determined the CFDS was valid and that all questions should be retained. The Count Group subscale emerged as the “best” subscale grouping and coding method. This study contributed to the literature by serving as the first validation study of a questionnaire of disclosure in CF. Additionally, as disclosure in CF is a new emerging area, this study added information to the sparse literature on this issue. The CFDS as it exists now gathers important research and clinical information from adults with CF, and should be examined further with a larger sample size and more descriptive information.

Mycobacterium abscessus is an emerging pathogen with infections increasing worldwide, especially among Cystic Fibrosis (CF) patients. During my PhD, I studied key aspects of the biology of M. abscessus spp.; particularly, I studied host-pathogen interactions, antimicrobial resistance mechanisms, and genetic determinants of virulence. First, I performed phenotypic characterization of M. abscessus spp. clinical isolates obtained from CF patients classified according to subspecies and clustering. I found clustered isolates, representing probable transmission events, were phenotypically distinct from sporadic isolates and showed adaptation phenotypes associated with chronic lung infection, such as enhanced intracellular survival, increased antibiotic resistance, and metabolic adaptations to the host environment. Second, I assessed the role of an inserted element containing an active methyltransferase in M. a. massiliense. Infection experiments with an isolate containing the inserted element (BIR1049wt) and a knockout strain (BIR1049Δ1809078_1815649) showed decreased survival of BIR1049Δ1809078_1815649 within macrophages. RNAseq analysis showed a distinct gene expression pattern between both isolates, with a number of mycobacterial virulence factors upregulated in BIR1049wt. Third, I studied heritable non-mutational antibiotic resistance mechanisms in M. abscessus to linezolid and clofazimine. For both antibiotics, I found clonal isolates of M. abscessus spp. with varying susceptibilities and different gene expression patterns, suggesting transcriptional regulation of antibiotic resistance. Mutation- mediated resistance to clofazimine was also found due to mutations in two transcriptional regulators predicted to regulate efflux pumps. Last, I evaluated the potential of repurposing a kinase inhibitor (compound H) in clinical trials for the treatment of cancer and CF, to treat M. abscessus infection. I found compound H enhanced killing of intracellular M. abscessus in macrophages through stimulation of autophagy and lysosomal function. I further studied over 60 chemical analogues of compound H in order to find a more active and specific compound for M. abscessus infection.

Aspergillus fumigatus is increasingly recognised as a cystic fibrosis (CF) pathogen with reported infection rates up to 50% and associated with increased hospitalisations and lung deterioration. Research investigating immune responses of CF phagocytes against A. fumigatus has been scarce and the role of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein in anti-Aspergillus immune responses is not known. The studies in this thesis aimed to explore innate immune responses by CF phagocytes against A. fumigatus. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC), monocytes (MNC) and polymorphonuclear cells (PMN) were isolated from blood samples of CF patients with at least one copy of the F508del mutation. CF phagocytes efficiently cleared A. fumigatus similar to healthy controls. Microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3B (LC3) expression was found to be attenuated in CF PMN and MNC, indicating a disbalance in the autophagy or LC3-associated phagocytosis pathway. Regarding inflammatory responses, it was found that upon phagocytosis a resting A. fumigatus conidia, CF phagocytes produce up to 4-fold more reactive oxygen species (ROS) compared to controls. The excessive ROS was then shown not to be necessary for adequate killing, suggesting the increased ROS to be redundant in the antifungal response. Patient metrics obtained from the clinic showed that the excessive ROS production correlated to exacerbations and lung function. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis revealed that CF PMN only express 20-25% of the 4 haemoglobin subunits compared to healthy controls. Combining the LC-MS data suggests that CF PMN are under hypoxic stress. In conclusion, the effective clearance of A. fumigatus by CF phagocytes comes at the cost of an excessive respiratory burst which correlates to disease severity. Our data indicate that CF PMN are under hypoxic stress while circulating in the blood stream, which is likely to contribute to the hyperinflammatory phenotype observed upon interaction with A. fumigatus.

Objective: To determine if inhaled Hypertonic Saline (7%) improves the Lung Clearance Index in paediatric Cystic Fibrosis patients with FEV1 ≥80% predicted. Methods: In a blinded crossover trial, twenty CF patients received 4 weeks of hypertonic saline (7%) (HS) and 4 weeks of isotonic saline (0.9%) (IS) separated by a 4 week washout period. The primary endpoint was the change in LCI in the HS versus the IS treatment periods. Results: Four weeks of twice daily inhalation of HS significantly improved the LCI as compared to IS by 1.16, 95% CI [0.26, 2.05]; p=0.016. Baseline LCI before IS, 8.71+/-2.10, was not significantly different from baseline LCI before HS inhalation, 8.84+/-1.95 (p=0.73). Randomization order had no significant impact on the treatment effect (p=0.61). Conclusions: Four weeks of twice daily Hypertonic Saline (7%) inhalations improved the LCI and may be a suitable early intervention therapy for CF patients with mild disease.

Short-chain fatty acids (SCFAs) are anaerobic bacterial metabolites. Cystic fibrosis (CF) lung disease is a condition caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductange regulator (CFTR) gene and is characterized by persistent lung inflammation and bacterial colonization. We measured the concentrations of SCFAs in sputum of patients with CF and tested the effect of these compounds on bacterial growth. Furthermore we found that SCFAs can influence the inflammatory protein expression and cytokine release in airway epithelial cells. SCFAs differentially alter cytokine release in CF bronchial epithelial cells (CFBE) compared to CFBE expressing wild-type CFTR. We also studied the effect of SCFAs in an acute lung injury model in BALB/cJ mice and found that intratracheally administered SCFAs can affect the inflammatory environment of the airways in vivo. We conclude that SCFAs may be important in the airways and that further investigation is warranted to understand their effects on inflammation and infection.

Short-chain fatty acids (SCFAs) are anaerobic bacterial metabolites. Cystic fibrosis (CF) lung disease is a condition caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductange regulator (CFTR) gene and is characterized by persistent lung inflammation and bacterial colonization. We measured the concentrations of SCFAs in sputum of patients with CF and tested the effect of these compounds on bacterial growth. Furthermore we found that SCFAs can influence the inflammatory protein expression and cytokine release in airway epithelial cells. SCFAs differentially alter cytokine release in CF bronchial epithelial cells (CFBE) compared to CFBE expressing wild-type CFTR. We also studied the effect of SCFAs in an acute lung injury model in BALB/cJ mice and found that intratracheally administered SCFAs can affect the inflammatory environment of the airways in vivo. We conclude that SCFAs may be important in the airways and that further investigation is warranted to understand their effects on inflammation and infection.

Objective: To determine if inhaled Hypertonic Saline (7%) improves the Lung Clearance Index in paediatric Cystic Fibrosis patients with FEV1 ≥80% predicted. Methods: In a blinded crossover trial, twenty CF patients received 4 weeks of hypertonic saline (7%) (HS) and 4 weeks of isotonic saline (0.9%) (IS) separated by a 4 week washout period. The primary endpoint was the change in LCI in the HS versus the IS treatment periods. Results: Four weeks of twice daily inhalation of HS significantly improved the LCI as compared to IS by 1.16, 95% CI [0.26, 2.05]; p=0.016. Baseline LCI before IS, 8.71+/-2.10, was not significantly different from baseline LCI before HS inhalation, 8.84+/-1.95 (p=0.73). Randomization order had no significant impact on the treatment effect (p=0.61). Conclusions: Four weeks of twice daily Hypertonic Saline (7%) inhalations improved the LCI and may be a suitable early intervention therapy for CF patients with mild disease.

La memoria de la tesis está organizada en 8 capítulos. Un resumen de cada capítulo se detalla a continuación. El Capítulo 1 es una Introducción, en la que se presenta el estado del arte así como los objetivos de la tesis. En el Capítulo 2 se describe el uso de la impedancia electroquímica a diferentes temperaturas para la discriminación de la mutación DF508 con respecto a la secuencia normal sin mutación. Las sondas de DNA (de 15 y 21 bases de longitud) fueron inmovilizadas en la superficie de los electrodos de oro y de la variación de la resistencia a la transferencia de carga (Rct) fue medida en función de la hibridación. Para la detección se han utilizado dos tipos de secuencias diana: secuencias sintéticas 15 mer y dos análogos sintéticos de productos de PCR de 82 (mutante) y 85 (normal) bases. La hibridación con la secuencia corta resulto en una variaciones de Rct muy específicas a la secuencia estudiada, con un factor de discriminación a temperatura ambiente de 5 veces cuando se comparó la respuesta obtenida con la secuencia totalmente complementaria con respecto a las no coincidentes. Sin embargo, en el caso de los productos de PCR sintéticos de cadena sencilla el factor de discriminación fue menor (1.5 veces). Por ellos, el efecto de la temperatura fue investigado como vía para mejorar la discriminación. El uso de lavados post-hibridación a temperatura elevada dio lugar a una mejora de 5 veces en el factor de discriminación. De esta manera, utilizando arrays de electrodos inmovilizadas con sondas selectivas a las secuencias de tipo mutante y normal, se logró una detección inequívoca de la mutación DF508. En el Capítulo 3 se describe el uso del azul de metileno como indicador electroquímico en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuencias normales en productos de PCR. En condiciones experimentales óptimas se obtuvo un factor de discriminación de 1.5 entre el tipo mutante y el normal. El ensayo propuesto es cuantitativo y lineal en el rango de 10 - 100 nM, exhibiendo un límite de detección (LOD) de 2.64 nM. Estudios electroquímicos en distintas condiciones de fuerza iónica permitió elucidar el mecanismo de la interacción de azul de metileno con el DNA y, al parecer, este es el primer reporte sobre la detección de hibridación a través de la interacción guanina específica del MB con de DNA, a diferencia de la interacción electrostática como quedó demostrado en el estudio de la fuerza iónica. La introducción de formamida en el tampón de hibridación para mejorar la discriminación también fue investigada. Por último, a una concentración de 10 nM, la secuencia mutante fue efectivamente discriminada respecto de la normal ajustando los parámetros de configuración de un multi-sensor. el DNA y, al parecer, este es el primer reporte sobre la detección de hibridación a través de la interacción guanina específica del MB con de DNA, a diferencia de la interacción electrostática como quedó demostrado en el estudio de la fuerza iónica. La introducción de formamida en el tampón de hibridación para mejorar la discriminación también fue investigada. Por último, a una concentración de 10 nM, la secuencia mutante fue efectivamente discriminada respecto de la normal ajustando los parámetros de configuración de un multi-sensor. El Capítulo 4 presenta un biosensor electroquímico basado en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuencias normales en productos de PCR sintéticos. Para ello se empleo una sonda tipo faro molecular de 34 pares de bases complementaria a la mutación DF508 inmovilizada en la superficie de un electrodo de oro y azul de metileno como indicador electroquímico, el cual interacciona con el extremo 5' del faro molecular. La inmovilización del faro molecular en la superficie del electrodo de oro se logró a través un derivado tiolado en el extremo 3' para formar un enlace S-Au en la superficie del electrodo. El efecto de diferentes tipos de tampón (PBS, PBS-T, CSE, HEPES y Trizma) fue investigado. Dos mecanismos de inmovilización fueron examinados en este trabajo: co-inmovilización e inmovilización en dos etapas ("backfilling") con el objetivo de determinar el procedimiento que más tarde sería mejor para la estabilidad de la sonda. También se estudió la temperatura de fusión de la sonda obteniéndose un valor de 31.5ºC, lo cual asegura la estabilidad de la sonda a temperatura ambiente. El tiempo optimo del proceso de hibridación fue de 20 minutos, lo cual segura un ensayo rápido. En condiciones experimentales óptimas se obtuvo un factor de discriminación de 2.5 entre la secuencia mutante y la normal. En el Capítulo 5 se presenta un método para la determinación precisa de la temperatura de fusión (Tm) de secuencias de DNA de doble hebra inmovilizadas que explota las propiedades de extinción de fluorescencia de superficies de oro. Para ello se empleo una sonda de DNA de cadena simple tiolada quimisorbida en la superficie de oro que se híbrida a una secuencia complementaria marcada con un fluoróforo. Tras la formación del dúplex, la fluorescencia de la etiqueta se extingue de manera efectiva por la superficie de oro. Al aumentar la temperatura y deshibridarse el dúplex, el fluoróforo se mueve lejos de la superficie del oro y la señal de fluorescencia se recupera de nuevo. De esta manera el aumento de la fluorescencia se mide cuando temperatura se eleva de secuencias relacionadas a la mutación DF508 se determinaron en tres formatos: en disolución, inmovilizados en nanopartículas de oro (Au-NPs) y en chips de oro (Au-chips). progresivamente y graficando la primera derivada de la variación e fluorescencia con respecto a la temperatura se determina Tm. Para demostrar este el enfoque, los valores de Tm En el Capítulo 6 se introduce una propuesta de discriminación de la mutación DF508 basada en la modificación del DNA a determinar con la etiqueta redox. Para ello se preparó un conjugado de ferroceno con la secuencia mutante (Mut-Fc) que se hibrida con dos posibles secuencias complementarias inmovilizadas en una superficie de oro, una con complementaridad total y otra conteniendo 3 bases no coincidentes. Las diferencias en las señales del ferroceno entre los dos métodos de hibridación se han mejorado estudiando las variaciones de la temperatura de fusión, obteniéndose alrededor de 8 ºC de diferencia en los valores de Tm entre ambas secuencias. La mejor discriminación se obtuvo a 40 ºC, en la que la sonda respecto a la secuencia normal dio una respuesta cercana a cero. Este resultado indica que es posible etiquetar las sondas de PCR con ferroceno con el fin de obtener muestras de DNA real marcadas, lo cual haría posible distinguir entre secuencias mutantes y normales mediante medidas de la temperatura de fusión. En Capítulo 7 se discute un ensayo basado en mediciones de temperatura de fusión empleando azul de metileno como indicador electroquímico en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuencias normales en productos de PCR sintéticos. La sonda complementaria mutante inmovilizada en la superficie de electrodos de oro resultó ser térmicamente estable hasta 70 ºC. La influencia de la fuerza iónica sobre la estabilidad del sistema también se estudió, siendo 0.5 M la concentración de NaCl óptima. El factor de discriminación entre las secuencias de tipo mutante y normal mejoró de 1.1 a 27 ºC hasta 4.26 a 55 ºC. El valor calculado de la temperatura de fusión del dúplex mutante con la secuencia complementaria inmovilizada sobre la superficie del electrodo de oro estuvo de acuerdo con la ecuación de Wallace. El efecto en la estabilidad de dúplex en términos de temperatura de fusión de secuencias laterales situadas en el mutante también fue investigado. Finalmente, en el Capítulo 8 se presentan las conclusiones principales del trabajo de esta tesis y el trabajo futuro.

The effectiveness of liposomes incorporating bismuth-ethanedithiol and loaded with tobramycin (LipoBiEDT-TOB) at sub-inhibitory concentrations to inhibit the production of quorum sensing signaling molecules and virulence factors induced by P. aeruginosa was evaluated in vitro. In addition, we evaluated the efficacy and safety of free and encapsulated tobramycin in liposomal formulations administered intratracheally to rats chronically infected with P. aeruginosa. LipoBiEDT-TOB significantly reduced the production of quorum sensing signaling molecules and virulence factor secretion compared to free tobramycin. The LipoBiEDT-TOB formulation significantly reduced the bacterial count in lungs, modulated the IL-8 level in blood and minimized the nephrotoxicity that is associated with aminoglycoside treatment. These results support the hypothesis that aerosolization of liposomal aminoglycosides may enhance the management of chronic lung infections caused by resistant P. aeruginosa in patients with cystic fibrosis.

No description available.