Chaque année, Mycobacterium tuberculosis (Mtu) est responsable d‘environ 2 million de morts dans le monde. L’apparition de souches multi-résistantes aux antibiotiques rend nécessaire le développement de nouveaux antituberculeux. Dans ce contexte, les voies de biosynthèse des composés essentiels de l’enveloppe, tels que les acides mycoliques (AM), représentent des cibles thérapeutiques de choix. Les AM, cruciaux pour l’architecture et la perméabilité de l’enveloppe, jouent également un rôle important dans la virulence et dans la persistance bactérienne. La biosynthèse des AM fait appel à une Fatty Acid Synthase de type II (FAS-II), système multienzymatique qui produit les chaînes méromycoliques des AM et qui contient au moins deux déshydratases, HadAB et HadBC. Lors d’une analyse approfondie du génome de Mtu dans l’équipe, onze hydratases/déshydratases (R)-spécifiques potentielles ont été identifiées, dont la protéine Rv0504c, nommée "HadDMtu". L’objectif de mes travaux a été de caractériser la fonction enzymatique et le rôle physiologique de la protéine HadDMtu chez Mtu et de son orthologue potentiel chez M. smegmatis (Msm), un modèle d’étude mycobactérien, non pathogène et à croissance rapide. Les tests d’activité enzymatique in vitro sur la protéine HadDMsm ont montré qu'elle possède une activité hydratase/deshydratase. Lorsque le gène hadD est délété, chez Msm et chez Mtu, les profils et les structures fines des AM sont modifiés. Chez Msm, le mutant n’est plus capable de produire d’AM à longues chaînes α et epoxy. Par contre, chez Mtu, c’est la structure fine et la proportion des AM keto qui sont affectées. En parallèle de mes travaux, il a été montré que la protéine HadDMsm de Msm interagit spécifiquement avec HadAB. L'ensemble de nos données a apporté la preuve que HadD fait partie du système FAS-II. Il suggère fortement que dans les deux espèces, l’enzyme intervient dans les derniers cycles d’élongations de la chaîne méromycolique. En accord avec ces résultats, des expériences de complémentation croisée des souches mutantes de Mtu ΔhadDMtu et de Msm ΔhadDMsm, ont montré que les deux protéines HadD ont une fonction proche in vivo mais elles ne sont pas orthologues. Des tests phénotypiques ont montré que les propriétés de surface et l’intégrité de l’enveloppe des mutants ΔhadD sont profondément altérées. De plus, chez la souris, la souche mutante de Mtu apparait beaucoup moins virulente avec une baisse des charges bactériennes dans les poumons et dans la rate. / Mycobacterium tuberculosis (Mtu) kills 2 million people every year in the world. The development of new antituberculous drugs is urgently needed due to the emergence of drug-resistant strains. In this context, the biosynthesis pathways of essential compounds from the mycobacterial envelope, such as mycolic acids (MAs), constitute relevant therapeutic targets. The MAs are crucial for both the architecture and the permeability of the envelope and play important roles in the bacterial virulence and persistence. The MA biosynthesis involves a Fatty Acid Synthase type II (FAS-II), a multi-enzyme system that produces the main meromycolic chains of MA and contains at least two dehydratases, HadAB and HadBC. A thorough analysis of the Mtu genome led to the identification of eleven potential (R)-specific hydratases/dehydratases, including the protein Rv0504c, named “HadDMtu”. The objective of my work was to characterize the enzymatic function and the physiological role of HadDMtu protein in Mtu and of its putative orthologue in M. smegmatis (Msm), a non-pathogenic and fast growing mycobacteria model. The in vitro enzymatic activity tests with HadDMsm protein showed that it has a hydratase/dehydratase activity. When hadD gene is deleted, in Msm and in Mtu, the MA distribution and fine structures were changed. In Msm, the mutant could not produce long chain α- and epoxy-MAs while in Mtu, it is the fine structure and the proportion of the keto-MAs that were affected. In parallel of my work, it was that HadDMsm protein specifically interacts with HadAB. All these data show that HadD belongs to the FAS-II system. They strongly suggest that, in the both two strains, the enzyme occurs in the late steps of the meromycolic chain elongation. According to these results, cross-complementation assays of Mtu and Msm ΔhadD mutants showed that both HadD proteins have a similar function in vivo but they are not orthologs. Phenotypic tests showed that the surface properties and the envelope integrity of the ΔhadD mutants were profoundly altered. Also, in the mouse model of infection, Mtu mutant exhibited a significant loss of virulence with a decrease of bacterial loads in the lungs and in the spleen.

Les poly(ADP-ribose) polymérases (PARP) sont des enzymes qui modifient les protéines ou l’ADN par ADP-ribosylation à l’aide du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+). Tankyrase est une PARP qui régule divers processus cellulaires, tels que la maintenance des télomères, la signalisation Wnt et le traitement de l’ARN. Elle est constituée de groupes de répétitions d’ankyrine (ARC) N-terminaux qui se lient aux protéines substrats, d’un domaine de motif α stérile intermédiaire qui médie la polymérisation avec d’autres molécules de tankyrase et d’un domaine catalytique C-terminal. Étant donné que l’activité de la tankyrase favorise la signalisation pro-oncogène Wnt/β-caténine, des inhibiteurs sous forme de petites molécules ont été développés pour cibler son domaine catalytique et se sont révélés prometteurs pour le traitement du cancer colorectal. Certaines protéines se lient à la tankyrase, mais plutôt que d’être ciblées pour l’ADP-ribosylation, elles inhibent son activité catalytique. Ces partenaires de liaison comprennent la GDP-mannose 4,6-déshydratase (GMD) et le gène 4 associé à la prostate (PAGE4). Il est important de noter que la structure de l’enzyme tankyrase complète n’a pas encore été déterminée, et on ignore actuellement pourquoi certaines protéines qui se lient à la tankyrase sont modifiées par l’ADP-ribose, tandis que d’autres restent inchangées et inhibent plutôt son activité catalytique. Comprendre ce mécanisme d’inhibition par analyse structurale pourrait fournir de nouvelles voies thérapeutiques bloquant la signalisation Wnt/β-caténine en ciblant le domaine N-terminal de la tankyrase. Notre objectif était d’utiliser la microscopie à coloration négative et la cryomicroscopie électronique pour déterminer les structures de la tankyrase seule et en complexe avec GMD et PAGE4. Nous avons observé que la tankyrase 1 s’assemble en double hélice lors de la polymérisation, créant des contacts interdomaines susceptibles de faciliter ses rôles catalytiques et d’échafaudage dans la signalisation cellulaire. De plus, GMD compactée et ARC1–5 de la tankyrase 1 se lient dans un rapport molaire 1:1 pour former un complexe bilobé, ce qui aide à expliquer pourquoi la GMD reste inchangée. Ces connaissances permettront le développement d’interventions cliniques plus efficaces ciblant les ARC N-terminaux ainsi que les contacts interdomaines de la tankyrase humaine. / Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are enzymes that modify proteins or DNA by ADP-ribosylation using nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+). Tankyrase is a PARP that regulates diverse cellular processes, such as telomere maintenance, Wnt signaling, and RNA processing. It is made up of N-terminal ankyrin repeat clusters (ARCs) that bind substrate proteins, a middle sterile α motif domain that mediates polymerization with other tankyrase molecules, and a C-terminal catalytic domain. Due to the fact that tankyrase activity promotes pro-oncogenic Wnt/β-catenin signaling, small molecule inhibitors have been developed that target its catalytic domain and have shown promise for the treatment of colorectal cancer. Certain proteins bind tankyrase, but rather than being targeted for ADP-ribosylation, they inhibit its catalytic activity. These binding partners include GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) and prostate-associated gene 4 (PAGE4). Importantly, the structure of the full-length tankyrase enzyme has yet to be determined, and it is currently unknown why some proteins that bind to tankyrase are modified with ADP-ribose, while others remain unmodified and instead inhibit its catalytic activity. Understanding this mechanism of inhibition by structural analysis could provide new therapeutic avenues that oppose Wnt/β-catenin signaling by targeting the N-terminal domain of tankyrase. We aimed to use negative stain and cryo-electron microscopy to determine the structures of tankyrase alone and in complex with GMD and PAGE4. We observed that tankyrase 1 assembles as a double helix upon polymerization, creating interdomain contacts that may facilitate its catalytic and scaffolding roles in cellular signaling. Moreover, compacted GMD and ARC1–5 of tankyrase 1 bind in a 1:1 molar ratio to form a bilobal complex, which aids in explaining why GMD remains unmodified. These insights will allow for the development of more effective clinical interventions targeting the N-terminal ARCs as well as interdomain contacts of human tankyrase.