L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est synthétisé par la plante en réponse à des stress abiotiques et biotiques dont l’infection par le pathogène bactérien A. tumefaciens. Des travaux antérieurs ont montré que le GABA induit, chez A. tumefaciens C58, l’expression d’une lactonase BlcC (=AttM) qui inactive ses propres signaux quorum-sensing (QS), donc module le transfert horizontal du plasmide Ti. La protéine périplasmique de liaison (Periplasmic Binding Protein, PBP) Atu2422 et le transporteur ABC Bra sont respectivement impliqués dans la perception et le transport du GABA. L’importation du GABA est nécessaire à l’induction de l’expression de BlcC, donc à la dégradation des signaux QS. Les caractéristiques structurales des récepteurs/senseurs du GABA ne sont connus ni chez les bactéries, ni chez les eucaryotes.Ce travail de doctorat a permis de définir la structure et la fonction de deux senseurs du GABA, les PBPs Atu2422 et Atu4243 d’A. tumefaciens C58.La structure cristalline d’Atu2422 a été résolue en présence de GABA ou d’acides aminés antagonistes de la liaison au GABA comme la proline et l’alanine. L'analyse structurale du site de fixation du ligand d’Atu2422 a permis d’identifier deux résidus clés, Phe77 et Tyr275, respectivement impliqués dans la sélectivité du ligand et la liaison du GABA. L’analyse phénotypique de mutants ponctuels a révélé le rôle crucial de ces deux résidus aminés dans l’interaction entre A. tumefaciens C58 et deux plantes hôtes, tomate et tabac. De plus, ces travaux ont défini les caractéristiques moléculaires d’une sous-famille de PBPs présentes chez différentes protéobacteries interagissant avec des hôtes eucaryotes et capables de fixer le GABA et des acides aminés compétiteurs comme la proline ou l’alanine.Ce travail a également révélé une deuxième PBP (appelée GABA2) impliquée dans la perception et l’importation du GABA chez A. tumefaciens. Cette PBP a été identifiée grâce au séquençage du génome et l’analyse du transcriptome de mutants spontanés, issus d’un mutant-KO atu2422 d’A. tumefaciens C58, mais devenus capables de transporter le GABA. La construction d’un mutant défectif pour la PBP GABA2 a permis d’évaluer son rôle dans la signalisation GABA et l’interaction A. tumefaciens-plante hôte. La structure cristalline de cette PBP en présence de GABA a permis d’identifier les résidus clés impliqués dans la fixation du GABA dont le rôle a été validé par l’analyse de mutations ponctuelles. Enfin, une analyse phylogénétique des orthologues de GABA2 a révélé leur présence au sein de nombreuses protéobactéries pathogènes et symbiotiques interagissant avec les plantes. L’ensemble de ces travaux aboutit à la proposition de deux modèles de référence quant aux mécanismes moléculaires associés à la perception du GABA, médiateur de communications inter-cellulaires et inter-organismes. Ce travail illustre l’association des approches de biologie structurale et de génétique pour la compréhension des interactions plantes-microorganismes. / Γ-aminobutyric acid (GABA) is synthesized by plants in response to abiotic and biotic stresses, including infection with A. tumefaciens. Previous works have revealed that GABA induces the expression of the A. tumefaciens BlcC (=AttM) lactonase, which cleaves quorum-sensing (QS) signals, thus modulates QS-regulated functions such as horizontal transfer of the plasmid Ti. Periplasmic binding protein (PBP) Atu2422 and ABC transporter Bra of A. tumefaciens are involved in GABA transport from plant to A. tumefaciens. The structural characteristics of the receptors/sensors of GABA are still unknown in bacteria or eukaryotes.I have studied two GABA-binding PBPs of A. tumefaciens C58, Atu2422 and Atu4243 by a combination of structural, genetic and functional approaches.The crystal structure of Atu2422 was solved in the presence of GABA and competitive amino acids, such as proline and alanine. Structural analysis of the ligand binding site revealed two key residues, Phe77 and Tyr275, which are involved in the ligand selectivity and GABA binding, respectively. Analysis of two constructed point-mutants confirmed the critical role of these two residues in the interaction between A. tumefaciens C58 and two host plants, tomato and tobacco plants. Using characteristics of the GABA-binding site, a subfamily of GABA-PBPs was identified in Proteobacteria of which most of them interact with eukaryotic hosts.This work also revealed a second PBP (GABA2) involved in the GABA uptake in A. tumefaciens. This PBP was identified by whole-genome sequencing and transcriptomic analysis of two spontaneous mutants, which derived from the atu2422 mutant. A mutant GABA2 was constructed to validate GABA2 involvement in the transport of GABA, degradation of QS signal, conjugal transfer of the plasmid Ti, and aggressiveness of A. tumefaciens. X-ray structure of GABA-liganded PBP GABA2 revealed key-residues required for GABA-binding. Their role in the GABA uptake has been confirmed by analysis of point mutations. A phylogenetic approach showed that all GABA2-related proteins exhibiting these key-residues were clustered in the same PBPs subfamily.This study has contributed to a better understanding of the A. tumefaciens-plant host interaction, and has permitted to determine two GABA binding modes for PBPs.

La motilité cellulaire est fondamentale dans de nombreux processus physiologiques, qu’ils soient normaux ou pathologiques. Cependant, bien que ces derniers impliquent la plupart du temps de nombreuses cellules se mouvant en même temps, les effets des interactions entre cellules sur leur dynamique, à la fois individuelle et collective, restent assez mal connu. Dans cette thèse, j’ai utilisé Dictyostelium discoideum à l’état végétatif pour étudier cette régulation collective de la motilité. Je me suis principalement appuyé sur une analyse minutieuse de nombreuses trajectoires cellulaires dans des situations variées pour (i) caractériser un facteur sécrété qui régule négativement la motilité cellulaire (nature chimique, voie de signalisation, dynamique de sécrétion et de réponse) et (ii) analyser et modéliser quantitativement la dynamique d’étalement de colonie cellulaires de forme, dimension et densité contrôlées. Je décris enfin un phénomène d’agrégation dynamique observé lorsque les cellules sont placées à haute densité dans un milieu nutritif / Cell motility is fundamental in many physiological, either normal or pathological, phenomena. Yet, although these most often involve several cells moving at the same time, how the interactions between cells affect both individual and collective dynamics remains a poorly understood question. In this thesis, I used vegetative Dictyostelium discoideum cells as a model to study this collective regulation of the motility. I relied mainly on the thorough analysis of numerous cell trajectories in various situations to (i) characterise a secreted factor used to down-regulate the cells’ motility (biochemical nature, response pathway, secretion and response dynamics) and (ii) quantitatively analyse and model the dynamics of spreading cell colonies of controlled initial shape, size and density. Last, I describe a dynamic aggregation phenomenon that occurs when the cells are seeded at high density in a nutrient-rich medium

Candida albicans, une levure pathogène de l’humain, cause des infections envahissantes chez les individus immunodéprimés. C. albicans peut changer sa morphologie entre les formes levures et filamenteuses, un déterminant de virulence considérable qui est influencé par plusieurs facteurs environnementaux comme le pH, le sérum, les nutriments, et le farnesol, une molécule de la détection du quorum. Le génome de C. albicans a été séquencé et à date, plusieurs gènes codant des régulateurs de transcription (RT) restent incaracterisés. Basé sur des criblages à grande-échelle, il a été possible d’attribuer des phénotypes à certains des RT incaractérisés, cependant, leurs cibles traduisant ces phénotypes restent inconnues. Le but de cette thèse était d’étudier les fonctions biologiques de RT sélectionnés et d’établir des réseaux transcriptionnels chez C. albicans. J’ai utilisé des approches génétiques et génomiques afin d’identifier et de caractériser le regulon de ces RT, ce qui a permis de déterminer leur fonctions biologiques. Notre groupe avait identifié Fcr1p, un RT dont la délétion augmente la filamentation et la tolérance à plusieurs antifongiques. Cependant, le mécanisme sous-jacent reste inconnu. Dans le Chapitre 2, j’ai identifié le régulon d’Fcr1p et j’ai trouvé qu’il régule ses cibles de façon complexe étant en même temps un activateur et un répresseur d’expression de gènes. J’ai démontré que Fcr1p agit comme répresseur direct des gènes de l’assimilation et du métabolisme de l’azote. L’expression de plusieurs de ces cibles était dépendante d’Fcr1p en conditions d’épuisement d’azote. J’ai montrés que Fcr1p agit aussi comme répresseur indirect de gènes hyphe-spécifiques ainsi qu’un activateur indirect de transport et de métabolisme du carbone et de gènes levure-spécifiques. De plus, la suréxpression d’Fcr1p abolit la filamentation sur le milieu Spider, confirmant que c’est un répresseur de filamentation. Dans le Chapitre 3, j’ai décris un crible génétique basé sur un principe de co-culture pour identifier des mutants de RT défectueux en production de farnesol. Conséquemment, les RT Ada2p, Cas5p, Fgr15p, Cas1p, et Rlm1p, impliqués dans le maintien de la paroi cellulaire, ont été identifiés. La quantification du farnesol intracellulaire de ces mutants a confirmé que le défaut observé peut être attribué à un défaut de la biosynthèse de farnesol plutôt qu’à un défaut de sécrétion de celui-ci. Pour comprendre le mécanisme responsable de ce défaut, nous avons commencé par caractériser le régulon de Cas5p par des analyses de profilages d’expression et de localisation. J’ai montré que Cas5p se lie à des gènes impliqués dans le catabolisme des hydrocarbures et la production d’énergie. Cas5p induit aussi des gènes impliqués dans le catabolisme des hydrocarbures et des lipides et réprime des gènes impliqués dans le métabolisme primaire, montrant que Cas5p régule plusieurs voies métaboliques, notamment celle du carbone. En plus des fonctions d’Ada2p et Rlm1p dans la liaison et/ou la régulation de gènes du catabolisme des hydrocarbures, nos résultats appuient avec la proposition que le farnesol constitue une traduction du métabolisme du carbone cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats ont aidé à élucider le rôle d’Fcr1p ainsi que 5 autres RT dans la régulation de voies métaboliques fondamentales influençant le dimorphisme, un attribut crucial de la virulence chez C. albicans. / Candida albicans, an important human fungal pathogen, causes life-threatening invasive infections in immuno-compromised individuals. It switches between yeast and filamentous forms. This dimorphism is a considerable virulence attribute and one that is influenced by many environmental factors, such as pH, serum, nutrients and farnesol, a quorum sensing molecule. The genome of C. albicans has been sequenced and to date, many of the genes encoding transcriptional regulators (TRs) remain uncharacterized. Based on large-scale screens, it was possible to assign phenotypes to some of the uncharacterized TRs, however the targets of these TRs that mediate these phenotypes remain to be identified. The aim of this thesis work was to understand the normal biological function of selected TRs and construct transcriptional networks in C. albicans. I used genetic and genomic approaches to identify and characterize the regulon of these TRs, which helped to define their biological functions. Our group has previously identified Fcr1p, a zinc cluster TR whose deletion increases cell tolerance to multiple drugs and enhances filamentation. However, the mechanism by which it mediates these phenotypes is still unknown. In Chapter 2, I identified the regulon of Fcr1p and found that it regulates its targets in a complex manner since it can act both as an activator and as a repressor of gene expression. I have shown that Fcr1p acts as a direct negative regulator of genes involved in nitrogen source assimilation and metabolism. The Fcr1p-dependent expression of a number of its targets also occurs under nitrogen starvation conditions. Results also showed that Fcr1p is an indirect negative regulator of hyphal-specific genes, and an indirect positive regulator of carbon source transport and metabolism, as well as yeast-specific genes. Furthermore, Fcr1p overexpression abrogates filamentation on Spider medium confirming that it is a negative regulator of filamentation. In Chapter 3, I describe a genetic screen based on a co-culture assay with A. nidulans to identify TR mutants defective in farnesol production. Our results identified Ada2p, Cas5p, Fgr15p, Cas1p, and Rlm1p, five TRs involved in cell wall integrity. Intracellular farnesol quantification in these mutants confirmed that the observed defect in farnesol production could be attributed to impairment in farnesol biosynthesis rather than export of this molecule. To get an insight into the molecular mechanism responsible for this defect, we started by identifying the regulon of Cas5p using expression and location profiling. Results showed that Cas5p binds genes involved in carbohydrate catabolism and energy production. Cas5p also upregulates genes involved in carbohydrate and lipid catabolism and downregulates genes involved in primary metabolism, indicating that Cas5p is involved in the regulation of many pathways, with a clear involvement in carbon metabolism. Coupled to the known function of Ada2p and Rlm1p in binding and/or regulating genes involved in carbohydrate catabolism, our results support the proposition that farnesol is a metabolic read-out of the cell carbon metabolic activity. Taken together, these results helped elucidate the role of Fcr1p as well as five other TRs in the regulation of central metabolic pathways that influence morphological switching, a crucial attribute of C.albicans virulence.

Depuis quelques décennies, les bactéries pathogènes multi-résistantes aux antibiotiques sont de plus en plus répandues dans le monde. Cette situation a suscité le besoin et l'intérêt de trouver des médicaments antibactériens avec de nouvelles cibles potentiels. La découverte des systèmes de communication de type quorum sensing (QS) régulant la virulence bactérienne représente une des cibles privilégiées pour contrôler les bactéries pathogènes autrement qu’en interférant avec leur croissance bactérienne. Dans l’écosystème naturel, un grand nombre d'organismes (Eucaryotes et Procaryotes) co-existent en synthétisant chacun de leur côté des métabolites secondaires. Les plantes, étant en permanence en contact avec des bactéries, synthétisent des métabolites secondaires capables d’inhiber l’expression des gènes de virulence chez les bactéries sans pour autant affecter ni leur croissance ni leur viabilité. Notre objectif a été de contribuer à la valorisation de la biodiversité malgache en identifiant des plantes et en y isolant les composés actifs présentant une capacité à perturber le mécanisme de QS chez P. aeruginosa PAO1, une bactérie pathogène opportuniste de l’homme, des animaux et des plantes. Dans ce but, nous avons tout d’abord réalisé un criblage d’activité anti-QS de différents flavonoïdes commerciaux. De ce criblage, la narigenine et la naringine ont été sélectionnées pour être les molécules de contrôle positif et négatif des tests d’activité anti-QS, respectivement. Par la suite, 4 espèces de Dalbergia endémique de Madagascar ont fait l’objet de criblage pour leur activité anti-QS. Ce travail a fait ressortir l’activité anti-QS très intéressante de l’écorce de D. trichocarpa à partir de laquelle nous avons isolée le composé actif nommé la coumarate de l’aldéhyde-oléanolique (OALC). Le contrôle naringénine et l’OALC ne présente aucun effets inhibiteurs sur la croissance bactérienne de P. aeruginosa PAO1 et sur l’expression du gène QS-indépendant aceA suggérant une activité d’inhibition spécifiquement liée au QS. Cependant, ces deux molécules présentent des spectres d’inhibition différente. En effet, les deux molécules diffèrent dans le sens que la naringenine n’inhibe pas l’expression du gène gacA et la motilité de type twitching contrairement à l’OALC. Ces résultats suggèrent que l’OALC et la naringénine représente des candidats potentiels pour des investigations in vivo quant à leur effet anti-QS et anti-biofilm sur des modèles infectieux d’organismes supérieurs. Par ailleurs, ils démontrent la richesse des plantes malgaches comme sources de nouvelles molécules anti-virulence ainsi que l’importance de telle investigation afin de renforcer notre arsenal thérapeutique en composé antibactérienne dans la lutte continuelle contre les bactéries pathogènes/Since few decades, multidrug resistant bacteria spread all over the world. This situation gives rise to the need and interest in finding antibacterial drugs with novel potent target. Discovery of communication system termed Quorum Sensing (QS) which regulate bacterial virulence factor represent privileged target in another way than interfering with bacterial growth. In natural ecosystem, many organisms (Eukaryotes and Prokaryotes) produce secondary metabolites. As plants are permanently in contact with bacteria, they have synthetized secondary metabolites which inhibit bacterial virulence gene expression without affecting bacterial viability. Our goal was to contribute to the valorization of Malagasy biodiversity and specifically to identify plants and isolate bioactive compound presenting ability to disrupt QS mechanism in P. aeruginosa, opportunistic pathogen bacteria in plants, animals and human. In this purpose, screening of commercial available flavonoids has been firstly carried out. From this screening, naringenin and naringin have been selected to be used as positive and negative QS inhibitor controls, respectively. Subsequently, Four Malagasy endemic Dalbergia species have been screened for their anti-QS activity. This work pointed out the interesting anti-QS activity of D. trichocarpa bark extract which led to the isolation of oleanolic aldehyde coumarate (OALC) as one major bioactive compound. At the concentration tested, naringenin and OALC did not affect P. aeruginosa PAO1 viability and didn’t reduce QS-independent aceA gene expression suggesting a specific anti-QS activity. However, these two compounds present different inhibition spectrum. Indeed, naringenin didn’t inhibit gacA gene expression and twitching motility contrarily to OALC. These results suggest that OALC and naringenin represent potent candidates for in vivo investigations in their anti-QS and anti-biofilm activity onto eukaryotes infectious model. Besides, this finding demonstrated the potent source for novel anti-virulence compounds of Malagasy flora and the importance of this kind of research to strengthen our antimicrobial therapeutic arsenal with the ongoing struggle against bacterial infection. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished