Im Rahmen dieser Studie sollte die Frage beantwortet werden, ob sich einzelne SNPs oder Haplotypen als biologische Marker affektiver Psychosen identifizieren lassen. Hierfür sollten Assoziations- und Haplotypuntersuchung an zwei Kandidatengenen, FKBP5 und G72 DAOA/G30, mit unterschiedlichen pathophysiologischen Theorien, durchgeführt werden. Das auf der Kortisolhypothese basierende Kandidatengen FKBP5 liegt auf dem Chromosom 6 p21 und stellt ein wichtiges Regulatorprotein für den Glukokortikoid- Rezeptor (GR) dar. In FKBP5 wurden drei SNPs mit einem schnelleren Ansprechen auf Antidepressiva assoziiert gefunden: rs4713916 in der vermuteten Promoterregion, rs1360780 im 2. Intron und rs3800373 im nicht translatiertem 3Ende (Binder et al. 2004). Die vorbeschriebenen Polymorphismen sollten in einem unabhängigen Kollektiv auf Assoziation mit affektiven Psychosen untersucht werden, um eine Rolle von FKBP5 bei der Ätiopathogenese affektiver Psychosen zu überprüfen oder einen Einfluss auf verschiedene Variable des Krankheitsverlaufs zu bestätigen. In unserer Studie mit 248 Fällen und 188 Kontrollen unterschieden sich die untersuchten SNPs in FKBP5, rs4713916, rs1360780 und rs3800373 in ihrer Verteilung nicht bei Erkrankten und Gesunden. Den einzigen signifikanten Hinweis für eine Assoziation mit affektiven Erkrankungen bot der Risikophaplotyp G-C-G mit einer Odds Ratio von 6,4, der jedoch nur bei 2,1% der Fälle vorkam. Auch zeigte sich kein Zusammenhang mit den untersuchten klinischen Parametern. Die Untersuchungsergebnisse können somit einen wesentlichen Beitrag von FKBP5 für die depressive Erkrankung nicht belegen. Es erscheint daher fraglich, ob Polymorphismen in FKBP5 als biologische Marker affektiver Psychosen dienen können. Das zweite Kandidatengen G72 DAOA /G30 war durch positive Kopplungsbefunde des chromosomalen Locus für die bipolare Störung und schizophrenen Psychosen identifiziert worden. Neuere Befunde lassen einen Einfluss auf das glutamaterge Transmittersystem vermuten (Chumakov et al. 2002). Das Genprodukt von G72, D-Amino-Oxidase (DAOA) fördert die Oxidation von D-Serine durch D-Amino-Oxidase (DAO), was zum Beinamen D-Amino-Oxidase-Aktivator (DAOA) führte. Da D-Serin ein wichtiger Aktivator des NMDA Glutamatrezeptors ist, könnte G72/DAOA einen wichtigen Faktor für die glutamatergen Signaltransduktion darstellen. Mehrfach wurde eine Assoziation von 69 Markern im Locus G72/G30 mit der bipolaren Depression aber auch schizophrenen Psychosen beschrieben (Detera-Wadleigh et al. 2006). In der Studie sollte eine mögliche Assoziation von SNPs in G72/G30 mit der Erkrankung überprüft und die vorbeschriebenen LD-Blöcke am 5Ende von G72 näher untersucht werden. Dafür wurden sieben SNPs, die sich über den chromosomalen Locus von G72/G30 verteilen, bei 429 Fällen mit affektiven und zykloiden Psychosen und 188 Kontrollen, untersucht. Durch die LD-Analyse der untersuchten SNPs konnte die Ausdehnung der vorbeschriebenen LD-Blöcke in G72 genauer definiert und rs9558575 dem 1. Block zugeordnet werden, der somit bis zum 5-Ende vom G72 reicht. Der SNP rs9558575 am 5- Ende vom G72 wurde erstmalig in dieser Studie untersucht. Trotz adäquater Power (80% bei α = 0,05) erreichte kein Einzelmarker Signifikanzniveau (Tabelle 17). Dennoch zeigten sich Hinweise für eine Beteiligung von G72/G30 am Erkrankungsrisiko, insbesondere für den SNP rs2391191 bei den zykloiden Psychosen. Darüber hinaus scheint der Risikohaplotyp rs2391191A / rs3916966C sowohl für die zykloiden Psychosen (p = 0,002), als auch für die Gesamtgruppe der Affektpsychosen (p = 0,017) ein geeigneter biologischer Marker zu sein. Die in der vorliegenden Studie gefundene Assoziation mit zykloiden Psychosen könnte dabei helfen, die Vorbefunde für G72/G30 als Risikogen sowohl für die bipolare Depression als auch schizophrenen Psychosen zu erklären, da die zykloiden Psychosen nach IDC10 beiden Krankheitsentitäten zugerechnet werden können. / In this dissertation two susceptibility genes, FKPP5 and G72/DAOA for the manic depression and monopolar depression were examined by genotyping several single nucleotide polymorphisms (SNPs). In summary, our data do not support a significant genetic contribution of FKBP5 or G72/DAOA to the pathogenesis of affective psychosis in the analysed markers; they may play a role as a disease modificatory factors. FKBP5: A dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis has been proposed as an important pathogenic factor in depression. Genetic variants of FKBP5, a protein of the HPA system modulating the glucocorticoid receptor, have been reported to be genetically associated with improved response to medical treatment and an increase of depressive episodes. We examined three single nucleotide polymorphisms (SNPs) in FKBP5, rs4713916 in the proposed promoter region, rs1360780 in the second intron and rs3800373 in the 3’-untranslated region (3’-UTR), in a case-control study of Caucasian origin (affective psychosis: n= 248; controls: n= 188) for genetic association and association with disease related traits. Allele and genotype frequencies of rs4713916, rs1360780 and rs3800373 were not significantly different between cases and controls. Odds ratios were not increased between cases and controls, except the rare haplotype G-C-G (OR 6.81), representing 2.1% of cases and 0.3% of controls. The frequency of rs4713916AG in patients deviated from expected Hardy-Weinberg equilibrium, the genotype AA at rs4713916 in monopolar depression (P= 0.011), and the two-locus haplotype rs1360780T - rs3800373T in the total sample (overall P= 0.045) were associated with short duration of disease. In summary, our data do not support a significant genetic contribution of FKBP5 to affective psychosis in the analysed markers, and the findings are inconclusive regarding putative risk haplotypes or association with disease-related traits. G72/DAOA: The chromosomal region 13q32-33 has been found to be linked with bipolar disorder and schizophrenia in several studies. After the description of two genes, G72 and G30, in this region by Chumakov et al 2002, association studies revealed evidence for an association of SNPs at G72/G30 with bipolar disorder, but the results remained heterogeneous with differing risk alleles and missing replication. We examined seven single nucleotide polymorphisms (SNPs) around G7/G30: rs3916966, rs1935058, rs2391191, rs1935062, rs947267, rs3918342, rs9558575, in a case-control study of Caucasian origin (affective psychosis: n= 248; controls: n= 188) for genetic association. Allele and genotype frequencies were not significantly different between cases and controls, no single marker reached statistical significance. We found different specific marker combinations associated with manic depression rs1935062, rs2391191, rs3916966 (overall P=0.022 and monopolar affective disorder, rs1935058, rs947267, rs2391191, rs3916966, rs9558575 (overall P= 0.036), but no well-defined risk haplotype. Our data revealed no clear-cut association with polymorphisms and haplotypes in G72 with disease and did not support a significant genetic contribution of G72 to the pathogenesis of affective psychosis.

Zwangsstörungen, im englischen als Obsessive Compulsive Disorder (OCD) bezeichnet, sind sowohl in der Erwachsenen- als auch in der Kinder- und Jugendpsychiatrie bekannte Krankheitsbilder, die mit einer Lebenszeitprävalenz von 2,5 – 3% zu den häufigsten psychiatrischen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter gehören. Sie stellen in der Regel eine erhebliche Belastung sowohl für die betroffenen Kinder als auch für deren Familie dar und schränken den alltäglichen Lebensablauf je nach Ausprägung erheblich ein. Familien- und Zwillingsuntersuchungen zeigen, dass bei Zwangsstörungen eine deutliche familiäre Belastung vorliegt. Gerade bei einer frühen Manifestation im Kindesalter (auf englisch als early onset bezeichnet) konnten Familienstudien zeigen, dass genetische Faktoren eine besonders ausgeprägte Rolle spielen. Diese formalgenetischen Studien legen weitere Untersuchungen auf molekulargenetischer Ebene für Zwangsstörungen im Kindes- und Jugendalter nahe. Pharmakologische Studien und erste molekulargenetische Studien verweisen zudem auf einen Zusammenhang zwischen Zwangs- und Angstsymptomen und dem Serotoninstoffwechsel. Selektive Serotonin Wiederaufnahme-Hemmer (Selective Serotonine Reuptake Inhibitors, SSRI) und tricyclische Antidepressiva sind bei der Behandlung von Zwangsstörungen besonders wirksam. Auch im Kindes- und Jugendalter sind diese Medikamente aufgrund ihrer positiven Wirkung bei Zwangsstörungen Mittel der ersten Wahl. Insgesamt wird die Pathogenese der Zwangsstörungen nach aktuellem Forschungsstand als multifaktoriell angenommen. Dabei bezieht sich bisher die überwiegende Zahl der Untersuchungen auf Zwangsstörungen erwachsener Patienten. Nach aktuellem Kenntnisstand handelt es sich bei der vorliegenden Arbeit um die ersten familienbasierten Assoziationsstudien bei Kindern und Jugendlichen mit Zwangsstörungen. Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung einer Assoziation von Varianten in ausgewählten Genen des serotonergen Systems und juvenilen Zwangsstörungen. Die Auswahl der Kandidatengene für Zwangsstörungen erfolgte auf patho-physiologischen Überlegungen: Die Tryptophanhydroxylase als geschwindigkeits-bestimmendes Enzym in der Synthese von Serotonin, der Serotonin-1B-Rezeptor als Zielorgan mit autoregulierender Funktion auf das serotonerge System, sowie der Serotonintransporter, der, therapeutisch genutzt, von SSRIs blockiert wird. Untersuchungen zu den genannten Kandidatengenen liegen bei erwachsenen Patienten mit Zwangsstörungen vor, die Ergebnisse sollten in unserer Studie repliziert werden. 64 Kinder und Jugendliche, sowie deren leibliche Eltern wurden in die Untersuchung eingeschlossen. In den vorliegenden molekulargenetischen Untersuchungen konnten für Varianten im Tryptophanhydroxylase-1-Gen und dem Serotonin-1B-Rezeptor-Gen kein Zusammenhang mit Zwangsstörungen bei Kindern und Jugendlichen gesehen werden. Die funktionelle Variante des Serotonintransporter-Gens, die zu einer höheren Aktivität des Transporters führt, wurde tendenziell häufiger bei den Patienten mit Zwangsstörungen beobachtet. Der Befund entspricht damit in der Richtung den früheren Befunden von erwachsenen Patienten. / Obsessive Compulsive Disorder (OCD)is a common psychiatric disorder in adults, but also in children and adolescents. A strong genetic impact has been shown particulary in early-onset ocd. In this investigation variants of three serotonin system candidate genes (tryptophan hydroxylase 1, serotonin transporter, serotonin autoregulation-receptor 1B) were studied for an association with early-onset ocd in 64 triads.

In Drosophila melanogaster wurde der p21-aktivierten Proteinkinase Mushroom bodies tiny (Mbt) eine wichtige Rolle als Regulator während der Differenzierung von Photorezeptorzellen zugeschrieben. Da morphologische Umgestaltungsprozesse der Photorezeptorzellen von dynamischen Zellbewegungen begleitet und die molekularen Details größtenteils noch ungeklärt sind, wurden in dieser Arbeit die Funktionen von Mbt in Bezug auf veränderte Zelladhäsionseigenschaften, Reorganisation des Aktincytoskeletts und die Beteiligung an weiteren Signalwegen analysiert. Im ersten Projekt wurde ein genetischer Interaktionsscreen mit Hilfe eines hypomorphen mbt- Allels (mbtP3) durchgeführt, um zu untersuchen, in welche zellulären Signalwege Mbt einzuordnen ist. Die Identifizierung des Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin (Drosophila: Twinstar) und der Phosphatase Slingshot bestätigte, daß Mbt in Prozesse involviert ist, die die Aktindynamik kontrollieren. In Vertebraten phosphoryliert und inaktiviert die Proteinkinase Pak4 (Drosophila Homolog zu Mbt) die Lim-Kinase (Limk), die wiederum Cofilin durch Phosphorylierung hemmt. Dieser Effekt kann nach Dephosphorylierung des Cofilin durch die Phosphatase Slingshot wieder aufgehoben werden. In Drosophila konnte gezeigt werden, daß aktiviertes Mbt mit Twinstar und Drosophila Limk (D-Limk) assoziiert ist und die Phosphorylierungen beider Moleküle induzieren kann. Zusammen mit genetischen Experimenten stellen die Ergebnisse entgegen der Situation in Vertebraten die Funktion von D-Limk als Vermittler zwischen Mbt und Twinstar in Frage und lassen vielmehr auf einen Verlauf des Signals von Mbt direkt an Twinstar, über Slingshot oder unbekannte Kinasen schließen. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluß von Mbt auf die DE-Cadherin-beta- Catenin/Armadillo vermittelte Zelladhäsion. Dazu wurde ein Zellkultursystem in Drosophila Schneiderzellen etabliert, welches es erlaubte, den DE-Cadherin-beta-Catenin/Armadillo-alpha- Catenin Komplex vollständig zu rekonstituieren. Die Resultate zeigten, daß Mbt mit dem Komplex interagiert und beta-Catenin/Armadillo an den Aminosäuren S561 und S688 phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Destabilisierung der Bindung zwischen DE-Cadherin und beta- Catenin/Armadillo und vermindert die Adhäsion der Zellkontakte zwischen Zellen. Im dritten Projekt ging es um die Suche nach unbekannten Phosphorylierungspartnern und der Integration von Mbt in weitere Signalwege. Dazu wurde eine stringente, radioaktive in vitro Phosphorylierungsreaktion entwickelt, die die Detektion von Mbt-spezifischen Phosphorylierungssubstraten aus einem Extrakt von Drosophila Schneiderzellen ermöglichte. In einer Vorstufe wurde dieses Extrakt mit dem ATP-Analogon 5’-Fluorosulfonylbenzoyladenosin (5’FSBA) vorbehandelt, um sämtliche endogenen Kinasen irreversibel zu inhibieren und die nachfolgende Phosphorylierungsreaktion mit aufgereinigtem Mbt spezifisch für Mbt zu machen. Nach Auftrennung und Identifizierung der potentiellen Phosphoproteine durch Massenspektrometrie wurde das Drosophila Dynamitin als neuer Interaktions- und Phosphorylierungspartner von Mbt gefunden. / In Drosophila melanogaster, the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny (Mbt) fulfils a critical role in the differentiation of photoreceptor cells during development. Differentiation of photoreceptor cells is accompanied by morphogenetic rearrangement, however, the underlying molecular mechanisms are not completely understood. Therefore in this work the function of Mbt was analysed with respect to the modulation of cell-cell adhesion, reorganization of the actin cytoskeleton and the integration of Mbt in different signalling pathways. In the first project a genetic screen with a hypomorphic mbt allele (mbtP3) was performed to identify components of Mbt signalling pathways. The identification of the actin depolymerization factor Cofilin (Drosophila: Twinstar) and the phosphatase Slingshot confirmed that Mbt is involved in actin regulating processes. In vertebrates, the p21 activated kinase Pak4 (Drosophila homolog of Mbt) acts as an upstream activator of the Lim-Kinase (Limk) which in turn inactivates the actin depolymerization factor Cofilin by phosphorylation. This effect can be reversed by the phosphatase Slingshot. In Drosophila activated Mbt is not only associated with Twinstar and Drosophila Limk (D-Limk) but also induces phosphorylation of both molecules. Together with genetic experiments these results are in contrast to the situation of Pak4 in vertebrates and question the role of D-Limk as a major mediator in signalling between Mbt and Twinstar. Instead we propose that Mbt can either directly act on Twinstar or regulates Twinstar phosphorylation through Slingshot or other unknown kinases. In the second project, the influence of Mbt on DE-cadherin mediated cell adhesion was investigated. Therefore a Drosophila Schneider cell line was established which allowed the reconstitution of a functional DE-cadherin-beta-catenin/Armadillo-alpha-catenin complex. The results revealed an interaction between Mbt and this complex and further showed that Mbt specifically phosphorylates beta-catenin/Armadillo on amino acids S561 and S688. As a consequence the binding between beta-catenin/Armadillo and DE-cadherin is destabilized leading to a reduced adhesion between cells. The third project was to devise a strategy that allows with high selectivity the identification of phosphorylation substrates of Mbt from total lysates of Drosophila Schneider cells. The general idea was to irreversibly block endogenous kinase activities by the ATP-analog 5’-fluorosulfonylbenzoyladenosine and then to perform a radioactive in vitro kinase assay in the presence of exogenously provided Mbt. The potential phosphoproteins were purified and identified by mass spectrometry. The Drosophila Dynamitin was found as a novel interaction and phosphorylation partner of Mbt.

Clonidine is an agonist at alpha2-adrenergic receptors that mediate a wide variety of the physiological responses to epinephrine and norepinephrine, such as inhibition of neurotransmitter release as well as sedation and analgesia. As with other therapeutically used alpha2-agonists such as moxonidine and rilmenidine, clonidine possesses an imidazoline structure and is believed to lower blood pressure not only via central and peripheral alpha2-receptors, but perhaps even more so by acting on central “imidazoline I1 receptors” in the brain stem. The molecular structure of these hypothetical “imidazoline I1 receptors” has not yet been identified. In order to test whether ligands with an imidazoline structure elicit pharmacological effects via alpha2-adrenergic receptors or via “imidazoline receptors”, mice were generated with a targeted deletion of all three alpha2-adrenergic receptor subtypes (alpha2ABC-KO). These alpha2ABC-KO mice were an ideal model in which to examine the pharmacological effects of the centrally acting antihypertensives clonidine, moxonidine and rilmenidine in the absence of alpha2-adrenergic receptors. As expected, sedative and analgesic actions of clonidine were completely absent in alpha2ABC-KO mice, confirming the sole role of alpha2-receptors in these properties of clonidine. Clonidine significantly lowered heart rate in anesthetized alpha2ABC-KO and wild-type mice by up to 150 beats/min. A similar bradycardic effect of clonidine was observed in isolated spontaneously beating right atria from alpha2ABC-KO mice. After treatment with the specific If inhibitor ZD 7288, clonidine was no longer able to lower spontaneous beating frequency, suggesting a common site of action. Furthermore, in HEK293 cells stably transfected with HCN2 and HCN4, it could be shown that clonidine inhibits the If current via blockade of pacemaker channels with similar affinity as in isolated alpha2ABC-KO and wild-type atria. This inhibition was demonstrated again in isolated sinoatrial node (SAN) cells from alpha2ABC-KO mice and was identical in potency and efficacy to clonidine inhibition observed in isolated wild-type SAN cells, confirming that inhibition of atrial HCN channels constitutes the alpha2-independent bradycardic action of clonidine. Direct inhibition of cardiac HCN pacemaker channels contributes to the bradycardic effects of clonidine in gene-targeted mice. Thus clonidine-like drugs represent novel structures for future HCN channel inhibitors. / alpha2-adrenerge Rezeptoren vermitteln die vielfältigen Wirkungen der endogenen Catecholamine Noradrenalin und Adrenalin, darunter auch eine Hemmung der Noradrenalin-Freisetzung sowie Sedierung und Analgesie. Clonidin und die ebenfalls therapeutisch eingesetzten alpha2-Agonisten Moxonidin und Rilmenidin besitzen eine Imidazolin-Teilstrukur. Es wird zur Zeit diskutiert, ob die hypotensive Wirkung dieser Arzneimittel nicht nur auf zentrale und periphere alpha2-Rezeptoren zurückzuführen ist, sondern auch auf sogenannte “I1 Imidazolin-Rezeptoren” in der ventrolateralen Medulla. Bis heute ist die molekulare Struktur dieser hypothetischen Rezeptoren nicht bekannt. Um diese Imidazolin-Hypothese zu überprüfen wurden Mäuse mit einer gezielten Deletion in allen drei alpha2-Rezeptor Genen generiert (alpha2ABC-KO). Dieses Mausmodell eignete sich hervorragend, um die pharmakologische Wirkung von den zentral-wirksamen Antihypertensiva Clonidin, Moxonidin und Rilmenidin in der völligen Abwesenheit von alpha2-Rezeptoren zu untersuchen. Wie erwartet fehlten die sedativen und analgetischen Wirkungen des Clonidins bei alpha2ABC-KO Mäusen, wodurch die alleinige Beteiligung von alpha2-Rezeptoren an diesen Eigenschaften des Clonidins bestätigt wurde. Bei anästhesierten alpha2ABCKO und Wildtyp-Mäusen zeigte Clonidin eine signifikante Senkung der basalen Herzfrequenz in beiden Genotypen von bis zu 150 Schlägen/min. In ähnlicher Weise setzte Clonidin in isolierten, spontan schlagenden rechten Vorhöfen von alpha2ABC-KO die Schlagfrequenz herab. Nach Vorbehandlung der Vorhöfe mit dem spezifischen If Inhibitor ZD 7288 fand keine weitere Senkung der Schlagfrequenz durch Clonidin mehr statt, was auf einen gemeinsamen Wirkort der beiden Substanzen hindeutete. In stabil transfizierten HEK293 Zellen zeigte Clonidin eine Inhibition des If Stromes durch Blockade von HCN2- und HCN4-Kanälen mit ähnlicher Potenz wie in den isolierten Vorhöfen. Ebenfalls in isolierten Sinusknoten (SAN) Zellen von alpha2ABC-KO und Wildtyp-Mäusen inhibierte Clonidin den If Strom mit gleicher Potenz. Diese Befunde bestätigen, dass die Blockade von atrialen HCN-Kanälen den Mechanismus der alpha2-unabhängigen, Clonidin-induzierten Bradykardie darstellt. Die direkte Hemmung von kardialen HCN-Schrittmacher-Kanälen trägt wesentlich zur bradykarden Wirkung von Clonidin bei transgenen Mäusen bei. Clonidin-Derivate bilden somit die Basis für die Entwicklung neuer HCN-Kanal-Inhibitoren.

Aus dem Bromfluorcarben-Addukt des Indens wurden durch HPLC an Chiralcel OD die reinen Enantiomere erhalten. Damit stand erstmals eine enantiomerenreine Vorstufe für die Freisetzung eines Sechsringallens im Sinne der Doering-Moore-Skattebol Reaktion zur Verfügung. Die Behandlung dieser Vorstufen, die in 2,5-Dimethyl, 2-tert-Butyl-5-methyl- or 2,5-Di-tert-butylfuran gelöst waren, mit Methyllithium lieferte die [4+2]-Cycloaddukte des Isonaphthalins an die Furane. Durch HPLC an Chiralcel OD wurde gezeigt, dass die Produkt-Enantiomerenpaare mit ca. 40% ee anfielen und dass dieser Wert praktisch unabhängig von der Art des Furans und seiner Konzentration, sowie von der Raktionstemperatur war. Die absoluten Konfigurationen der Vorstufe sowie der [4+2]-Cycloaddukte wurden durch Vergleich der gemessenen und berechneten CD-Spektren ermittelt, was in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. B. Engels erfolgte. Erzeugt durch Methyllithium aus dem Dibromcarben-Addukt des Indens wurde das Isonaphthalin erstmals durch Inden abgefangen. Die Konstitution diese [2+2]-Cycloaddukts wurde durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Erstmals wurde das Bromfluorcarben-Addukt des 1-Phenylcyclopentens hergestellt und erfolgreich daraufhin geprüft, ob es als Vorstufe für 1-Phenylcyclohexa-1,2-dien geeignet ist. Mit Hilfe von HPLC an Chiralcel OJ-H wurden die reinen Enantiomere erhalten. Die Umsetzung eines solchen reinen Enantiomers mit Methyllithium in Gegenwart von 2,5-Dimethylfuran erbrachte das [4+2]-Cycloaddukt als reines Enantiomer. Die Umsetzung einer reinen Vorstufe mit Methyllithium in Gegenwart von Inden erbrachte das [2+2]-Cycloaddukt mit einem Enantiomerenverhältnis von 95:5. Überraschend wurden auch relativ hohe Enantioselektivitäten beim Abfang dieser Vorstufe mit Styrol beobachtet. Bei der Umsetzung des reinen Enantiomers mit Methyllithium und Styrol ergab sich ein Gemisch der zwei endo- und exo-Enantiomere des [2+2]-Cycloaddukts von 50:3:40:7, was ee-Werten von 89 bzw. 79% entspricht. Geht man von einem zweistuifigen Mechanismus der Reaktion von 1-Phenylcyclohexa-1,2-dien mit Styrol aus, dann spielt die achirale Konformation des intermediären Diradikals, wenn überhaupt, keine große Rolle. Die Reduktion des bekannten 1,6-Dibrom-2-phenylcyclohex-1-ens mit Lithiumaluminiumhydrid erbrachte mit 78% Ausbeute die Monobromide 1-Brom-2-phenylcyclohexen and 1-Brom-6-phenylcyclohexen, die bei der Behandlung mit Kalium-tert-butoxid ebenfalls das Cycloallen 1-Phenylcyclohexa-1,2-dien liefern. Dies zeigte die Ausführung dieser Reaktion in Gegenwart von Furan und 2,5-Dimethylfuran. / From the bromofluorocarbene adduct of indene the pure enantiomers were obtained by HPLC on Chiralcel OD. Whith that, an enantiomerically pure precursor for the generation of a six-membered cyclic allene according to the Doering-Moore-Skattebol-Reaktion was available for the first time. The treatment of this pure precursors, dissolved in 2,5-dimethyl, 2-tert-butyl-5-methyl- or 2,5-bis-(tert)-butylfuran, with methyllithium gave rise to the [4+2]-cycloadducts of the Isonaphthalin to the furans. It was shown by means of HPLC on Chiralcel OD that the formation of the product enantiomers proceeded with about 40% ee and that this value was virtually independent of the type of the furan and its concentration as well as the reaction temperature. The absolute configurations of the precursor as well as those of the [4+2]-cycloadducts were determined by comparison of the experimental with the calculated CD spectra, which was done in co-operation with the group of Prof. Dr. B. Engels. Generated with methyllithium from the dibromocarbene adduct of indene the Isonaphthalin was trapped by indene for the first time. The constitution of this [2+2]-cycloadduct was determined by X-ray crystal structure analysis. For the first time, the bromofluorocarbene adduct of 1-phenylcyclopentene was prepared and tested successfully for the use as a precursor of 1-phenylcyclohexa-1,2-diene. By means of HPLC on Chiralcel OJ-H, the pure enantiomers were obtained. The reaction of such a pure enantiomer with methyllithium in the presence of 2,5-dimethylfuran furnished the [4+2]-cycloadduct as a pure enantiomer. The reaction of a pure precursor with methyllithium in the presence of indene leads to the [2+2]-cycloadducts in a 95:5 enantiomeric ratio. Surprisingly high enantioselektivities were also found in the case of the interception of this precursor by styrene. By using a pure enantiomer for the reaction with methyllithium and styrene a mixture of the two endo- and exo-enantiomers of the [2+2]-cycloadduct in the ratio 50:3:40:7 resulted, corresponding to ee-values of 89 and 79%, respectively. On assuming a two step mechanism for the reaction of 1-phenylcyclohexa-1,2-diene with styrene, the achiral conformation of the intermediate diradical cannot be of great importance. The reduction of the known 1,6-dibromo-2-phenylcyclohex-1-en with lithiumaluminiumhydride furnished the monobromids 1-bromo-2-phenylcyclohexen and 1-bromo-6-phenylcyclohexen with 78% yield, which give also rise to the cycloallene 1-phenylcyclohexa-1,2-dien on treatment with potassium-tert-butoxide. This was shown by conducting this reaction in the presence of furan and 2,5-dimethylfuran.

Directed cortical actin assembly is the driving force for intercellular adhesion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) participates in actin-fiber formation and VASP activity is regulated by phosphorylations. We screened for endothelial cell proteins, which bind to VASP dependent on its phosphorylation status. Differential proteomics identified αII-spectrin as novel VASP-interacting protein. αII-spectrin binds to the triple GP5-motif in VASP via its SH3 domain. cAMP-dependent protein kinase-mediated VASP phosphorylation at Ser157 inhibits αII-spectrin/VASP complex formation. VASP becomes dephosphorylated upon formation of cell-cell contacts and in confluent but not in sparse endothelial cells αII-spectrin colocalizes with non-phosphorylated VASP at cell-cell junctions. Ectopic expression of the αII-spectrin SH3 domain fused to claudin-5 translocates VASP to cell-cell contacts and is sufficient to initiate the formation of cortical actin cytoskeletons. αII-spectrin SH3 domain overexpression stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, permeability of VASP-deficient endothelial cells is elevated. In a skin edema model, microvascular leakage is increased in VASP-deficient over wild-type mice. We propose that αII-spectrin/VASP complexes regulate cortical actin cytoskeleton assembly with implications for formation of endothelial cell-cell contacts and regulation of vascular permeability. / Der zielgerichtete Aufbau eines kortikalen Aktin-Zytoskeletts ist die treibende Kraft für die interzelluläre Adhäsion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) ist maßgeblich an der Bildung von Aktin-Fasern beteiligt und die VASP Aktivität wird durch seine Phosphorylierung geregelt. Wir haben in einem systematischen Ansatz nach endothelialen Proteinen gesucht, die an VASP, abhängig von seinem Phosphorylierungszustand, binden. Mit Hilfe differenzieller Massenspektrometrie konnte αII-Spektrin als neuer VASP Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei bindet die αII-Spektrin SH3 Domäne an die drei GP5-Motive in VASP. Die Phosphorylierung von VASP durch die cAMP-abhängige Protein Kinase hemmt die αII-Spektrin/VASP Komplexbildung. Bei der Bildung von Zell-Zell Kontakten wird VASP dephosphoryliert und in konfluenten - nicht aber in vereinzelten Endothelzellen - kolokalisieren αII-Spektrin und nicht-phosphoryliertes VASP an Zell-Zell Kontakten. Die ektopische Expression der αII-Spektrin SH3 Domäne als Fusionsprotein mit Claudin-5 führt zu einer Translokation von VASP an Zell-Zell Kontakte und ist hinreichend um die Bildung von kortikalen Aktin-Fasern einzuleiten. Funktionell stabilisiert die Überexpression der αII-Spektrin SH3 Domäne Zell-Zell Kontakte und führt zu einer Abnahme der Endothelzellpermeabilität. Dementsprechend ist die Permeabilität von VASP-defizienten Zellen erhöht. In einem Hautödem-Modell zeigt sich nach Bradykinin-Stimulation eine Erhöhung der mikrovaskuläre Permeabilität von VASP-defizienten Mäusen gegenüber wild-typ Tieren. Unsere Forschungsergebnisse legen nahe, dass αII-Spektrin/VASP Komplexe den Aufbau des kortikalen Aktin-Zytoskeletts regulieren und damit für die Bildung von endothelialen Zell-Zell Kontakten und die Regulation der vaskulären Permeabilität eine Rolle spielen.

Oxygen-centered radicals are important intermediates in photobiological, mechanistic and synthetic studies. The majority of precursors of reactive oxyl radicals are labile and thus delicate to handle. Therefore N-(alkoxy)-pyridinethiones and N-(Alkoxy)-thiazolethiones have attracted attention as "mild'' photochemical source of alkoxyl radicals, in the last few years. A disadvantage of the pyridine compounds, is their sensibility to daylight. Despite of their similarities, both molecules behave surprisingly different, if photolyzed in the absence of trapping reagents. The pyridinethione compounds undergo highly efficient radical chain reactions under such conditions while the corresponding thiazolethiones react surprisingly sluggish and give rise to several unwanted side products. The properties of both compounds should be understood and optimized in the frame of this work. Additionally new compounds should be suggested that can also be applied in the photochemical alkoxyl radical generation. Some background information about the generation and application of alkoxyl radicals is provided in chapter 2. Electronic excitations and UV/vis spectroscopy together with a description of quantum chemical approaches that are able to calculate such phenomena are outlined in chapter 3. Chapter 4 deals with the description of the vertical excitation spectra. During the validation CASSCF, CASPT2, TD-DFT and RI-CC2 were tested with respect to their ability to describe the vertical excitations in both compounds. The CASPT2 approach gives accurate descriptions of the electronic excitation spectra of all compounds. The time-dependent DFT results are very sensitive on the choice of the functional and a validation of the results should be always done. On the basis of these computations the spectroscopic visible absorption bands of both compounds were assigned to a pi-->pi* transition in the thiohydroxamic acid functionality. In chapter 5 the mechanism of the thermally and the photochemically induced N,O homolysis in both compounds is unveiled. The near UV-induced N,O homolysis will start from the S2 state. The expected relaxation from the S2- to the S1-state and the dissociation process is expected to be very fast in the case of the thiazolethione compound. The potential surfaces of the pyridine compound in contrast point to a slower N,O bond dissociation. Due to the resulting faster dissociation process the excess energy which results from the photochemical activation is quenched only to small amounts. The maximal possible excess energy of the fragments is lower and a quenching is much more likely in the case of the pyridinethione compounds. This explaines the different reactivities of both compounds. For the also already successfully applied precursor system N-(alkoxy)-pyridineones the computed dissociation paths show courses that clearly predict a slow bond dissociation process. Chapter 6 deals with the tuning of the initial excitation wave length of the known pyridinethiones und thiazolethiones. In the first part the effects of substituents on the thiazolethione heterocycle was examined. The UV/vis spectra of 4 and 5 substituted thiazolethiones can be interpreted like the spectrum of the parent compound. The second part of chapter 6 deals with the identification of a substitution pattern on the pyridine heterocycle which induces a blue shift of the photo active band. The computations showed that electron rich and electron poor substituents result the same effects on the electronic excitation spectra. These substituent effects are additive, but the steric orientation of the substituents has to be taken into account. Chapter 7 describes a computer aided design of new alkoxyl radical precursors. Combining the advantages of both compounds the radical formation should be initiated by an irradiation with light at about 350 nm, and the amount of side products during the radical formation process should be small. To achieve this 18 test candidates were obtained by a systematic variation of the parent compound of the thiazolethione precursor. To identify the promising new precursor systems a screening of the lower electronic excitations of all resulting 18 systems was performed with TD-DFT. For promising systems the N,O or P,O dissociation paths, respectively, were analyzed according to the developed model. N-(methoxy)-azaphospholethione and N-(methoxy)-pyrrolethione seem to be the most promising candidates. The computations predict a strong absorption at about 350 nm respectively 320 nm. Due to the amounts of maximal excess energy and the shapes of the potential surfaces of the N,O bond dissociation paths their reactivity should resemble more the behavior of the pyridinethiones. / Sauerstoff zentrierte Radikale sind wichtige organisch chemische Zwischenstufen. Die Mehrzahl der Vorläufer zur Erzeugung von Sauerstoffradikalen sind allerdings instabil und schwer zu handhaben. Deshalb haben N-(Alkoxy)-Pyridinthione und N-(Alkoxy)-Thiazolthione in den letzten Jahren als milde Quelle von Alkoxylradikalen verstärkt Aufmerksamkeit erhalten. Ein Nachteil der Pyridinverbindungen ist ihre Tageslichtempfindlichkeit. Außerdem verhalten sich beide Moleküle sehr unterschiedlich, wenn sie in ohne die Anwesenheit effektiver Radikalfänger photolysiert werden. Die Pyridinthione reagieren unter diesen Bedingungen in sauberen und effizienten Radikalkettenreaktionen, wogegen die entsprechenden Thiazolthione unkontrollierbar mit unerwünschten Nebenreaktionen reagieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollen die Eigenschaften beider Verbindungen verstanden und verbessert werden. Außerdem sollen neue Verbindungen vorgeschlagen werden die ebenfalls in der photochemischen Alkoxylradikalchemie eingesetzt werden können. Kapitel 2 behandelt die theoretischen Hintergründe der Erzeugung und Anwendung von Alkoxylradikalen. Elektronische Anregungen, die UV/vis Spektroskopie sowie quantenchemischer Ansätze, die in der Lage sind diese Phänomene zu berechnen, werden in Kapitel 3 dieser Arbeit beschrieben. Kapitel 4 befasst sich mit der Beschreibung der senkrechten elektronischen Anregungsspektren. Im Validierungsschritt wurden CASSCF, CASPT2, TD-DFT sowie RI-CC2 getestet wie gut sie die senkrechten elektronischen Übergänge in beiden Vorläufersystemen beschreiben. Der CASPT2 Ansatz berechnet die gemessenen elektronischen Anregungen aller Verbindungen sehr genau. Die Ergebnisse der TD-DFT Berechnungen sind sehr empfindlich bezüglich der Wahl des Funktionales und eine Validierung sollte deshalb immer durchgeführt werden. Auf der Grundlage der Berechnungen wurden die spektroskopisch aktiven Banden einem pi-->pi* Übergang in der Thiohydroxamsäure-Gruppe zugeordnet. In Kapitel 5 wird der Mechanismus der thermisch oder photochemisch induzierten N,O-Homolyse in beiden Verbindungen aufgeklärt. Die durch UV-Licht induzierte N,O-Homolyse beginnt im S2-Zustand. Die zu erwarteten Relaxation vom S2- in den S1-Zustand und die anschließende Dissoziation wird im Fall der Thiazolthion Verbindung sehr rasch verlaufen. Die Potentialflächen der Pyrridinverbindung weisen hingegen auf einen langsameren N,O Bindungsbruch hin. Wegen des schnelleren Dissoziationsprozess wird die Überschussenergie, die von der photochemischen Aktivierung der Moleküle herrührt nur zu einem kleinen Teil abgebaut. Für die Pyridinthione ist die maximal mögliche Überschussenergie der Fragmente deutlich geringer und ein Energieabbau wesentlich wahrscheinlicher. Dies erklärt die unterschiedliche gefundene Reaktivität beider Verbindungen. Für die ebenfalls erfolgreich im Experiment eingesetzten Alkoxylradikalvorläufer N-(Alkoxy)-Pyridinon weisen die berechneten Dissoziationspfade Verläufe auf, die klar auf einen relativ langsamen Bindungsbruch hindeuten. Kapitel 6 dieser Arbeit behandelt das Anpassen der Anregungswellenlänge der bekannten Pyridinthione und Thiazolthione. Im ersten Teil wurde der Effekt von Substituenten am Thiazolthion Heterocyclus erforscht. Die UV/vis Spektren von 4 und 5 substituierten Thiazolthionen können wie das Spektrum des Grundkörpers interpretiert werden. Der zweite Teil von Kapitel 6 beschreibt die Identifikation eines Substitutionsmuster am Pyridinring, das eine Blauverschiebung der photoaktiven Bande induzieren soll. Die Berechnungen zeigen, dass elektronenarme und elektronenreiche Substituenten den gleichen Einfluss auf das elektronische Anregungsspektrum haben. Die Substituenteneffekte auf die elektronischen Anregungen sind additiv allerdings muss ihre sterische Orientierung berücksichtig werden. Kapitel 7 dieser Arbeit beschreibt ein computerunterstütztes Design neuer Alkoxylradikalvorläufer. Um die Vorteile beider bekannter Verbindungen zu kombinieren, sollte die Radikalerzeugung mit Licht der Wellenlänge von ungefähr 350 nm initiiert werden, und es sollten wenige unerwünschte Nebenreaktionen während der Radikalbildung auftreten. Hierzu wurden 18 Testsysteme durch eine systematische Modifikation des Thiazolthion-Grundkörpers erhalten. Vielversprechende Vorläufersysteme wurden durch ein Screening der ersten elektronischen Anregungen aller 18 Moleküle auf TD-DFT Niveau identifiziert. Für die erhaltenen neuen, vielversprechenden Systeme wurden die N,O oder P,O Bindungsdissoziationspfade nach dem entwickelten Modell analysiert. N-(Methoxy)-Azaphospholthion und N-(Methoxy)-Pyrrolthion scheinen die vielversprechendsten neuen Kandidaten zu sein. Die Berechnungen sagen eine intensive Absorption bei ungefähr 350 nm bzw. 320 nm voraus. Anhand der maximal möglicher Überschussenergie und der N,O Bindungsdissoziationspfade, wird eine Reaktivität erwartet, die mehr dem Verhalten der Pyridinthione entsprechen sollte.

Die diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome (DLBCL) stellen den häufigsten Typ aller Non-Hodgkin-Lymphome dar, sind aber morphologisch, immunologisch, genetisch und klinisch eine sehr heterogene Gruppe. Aufgrund dieser Heterogenität von DLBCL wurde in mehreren Studien untersucht, ob eine molekulare Heterogenität der Tumoren vorläge, bzw. versucht, eine molekulare Reklassifikation zu erreichen. Resultat dieser Bemühungen war eine Unterscheidung bzw. Definition einer Keimzentrums- ähnlichen (GCB-cell-like) Gruppe und einer aktivierten B-Zellen-ähnlichen (ABC-like) Gruppe, die sich in ihrem Ansprechen auf übliche Therapieschemata, mit einer deutlich besseren Prognose für die GCB-like-Gruppe, unterschieden. Die hierbei angewendete Microarray-Technologie hat den entscheidenden Nachteil, dass hierfür qualitativ hochwertige RNA zur Verfügung stehen muss. Neu ist der Ansatz, unterschiedliche Proteinexpressionsmuster am Paraffinmaterial zur Unterscheidung prognostisch relevanter Gruppen heranzuziehen. Die hierbei erzielten Daten sind allerdings in Ihren Aussagen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeiten widersprüchlich. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst verschiedene biologische Parameter am Paraffinmaterial hinsichtlich ihrer prognostischen Wertigkeit in der Risikostratifikation von DLBCL untersucht. In einem ersten Schritt wurden klinische Daten von 99 de novo entstandenen großzelligen B-Zell-Lymphomen erhoben, bei denen es sich um 84 DLBCL und um elf DLBCL mit einer weiteren Komponente eines follikulären Lymphoms Grad 3B bzw. auch um vier Fälle mit ausschließlich follikulärem Wachstumsmuster handelte. Die Klassifikation der Fälle nach dem Internationalen Prognostischen Index (IPI) sowie der einzelnen klinischen Parameter des IPI zeigte eine deutliche prognostische Relevanz. In einem zweiten Schritt wurden immunhistochemische Färbungen mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt und auf ihre prognostische Bedeutung überprüft. Als negative prognostische Parameter erwiesen sich die Negativität für CD10 sowie BCL-6, also Antigene, die mit einer Keimzentrumszell-Differenzierung assoziiert werden, sowie eine Überexpression von MUM-1, das mit einer postfollikulären Differenzierung assoziiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einer Expression von BCL-2 und einem Ki67-Index von unter 80 % eine negative prognostische Bedeutung zukommt. Die Stratifikation der Fälle in einen GCB- und einen ABC- Typ anhand des Hans-Klassifikators zeigte nur eine schwache Korrelation zur Überlebenswahrscheinlichkeit. In einem dritten Schritt wurde gezeigt, dass die kombinierte Analyse jeweils zweier Parameter eine relative Abhängigkeit ihrer Expression von der Expression weiterer Marker erkennen ließ. Aus diesem Grunde wurde ein Modell einer sequentiellen Addition negativer prognostischer Indikatoren entwickelt, in der bei Anwesenheit einer negativen Variable (CD10-Negativität, BCL-6 < 20%, BCL-2 positiv, MUM-1&#8805; 50% und Ki67 < 80%) ein negativer Faktor gewertet und die Summe dieser als Risiko-Score angegeben wurde. Die Stratifikation der Patienten anhand dieses „kombinierten immunhistochemischen Risiko-Scores“ zeigte drei prognostisch deutlich unterschiedliche Gruppen: In der Gruppe von Patienten ohne Risikofaktoren verstarb lediglich eine Patientin (die eine Behandlung abgelehnt hatte); in der Hochrisikogruppe (Score 5) verstarben alle Patienten innerhalb eines Jahres. Die multivariate Analyse des Scores ergab dabei eine Unabhängigkeit von den Parametern des IPI. In der intermediären Gruppe mit einem Risiko-Score von 1-4 zeigten sich der IPI sowie eine LDH-Erhöhung und das Vorhandensein einer B-Symptomatik als geeignete Parameter, um hier eine weitere Stratifizierung durchzuführen. Die vorliegende Arbeit stellt somit eine Erweiterung der publizierten Ansätze einer Erfassung prognostischer Indikatoren in kombinierten Algorithmen dar. Eine Verifizierung der gezeigten Ergebnisse in einer homogen behandelten Patientengruppe innerhalb einer klinischen Studie muss Ziel weiterer Untersuchungen sein. / Diffuse large B-cell Lymphomas (DLBCL)are heterogeneous in morphologic, immunologic, genetic and clinical features. In different studies a molecular reclassification of this hetreogeneous group has been tried to establish, defining a germinal center B-cell-like group (GCB)and a activated B-cell-like group (ABC), with a better prognosis for the GCB-like group in responding to chemotherapy. Another way to differentiate prognostically relevant groups in DLBCL is by getting different protein expression patterns by using paraffin embedded material. In this study different biological parameters were analysed for their prognostic relevance. Clinical data of 99 de novo large B-cell lymphomas was collected, including 84 DLBCL, 11 DLBCL with a component of a follicular lymphoma grade 3B and 4 lamphomas with only a follicular growth pattern. Classification using the International Prognostic Index and its items in particular showed a significant clinical relevance. In a second step immunohistochemically revealed antibodies were examined for their prognostically relevance. As negative prognostic factors were found CD10-negativity and bcl-6, both beeing associated with a germinal center- differentiation. Another negative prognostic factor was MUM-1-overexpression, beeing associated with a postfollicular differentiation. Expression of bcl-2 und a Ki67-index below 80% indicated a negative prognosis as well. Stratification by using the Hans-Classificator showed a non-significant correlation of overall survival. In a third step a combined analysis of the parameters by looking for prognostic significance showed that the expression of one parameter was dependent of the expression of other parameters. Therefore a score was developed by using a sequentially addition of every negative prognostic factor (CD10-negativitiy, bcl-6 <20%, Bcl-2-positivity, MUM-1 >=50% and Ki67 <80%). Stratification of the patients using this "combined immunohistochemical risc score" showed three significantly different groups: In the group without any risc factor only one patient died (who had denied any treatment), in the high risk group (score 5) all patients died within one year. Multivariate analysis of the score showed independence of the IPI-parameters. In the intermediate risk group (score 1-4) the IPI-parameters as well as high LDH-levels and any B-symptoms were useful to make a further risk stratification. The present study extends the studies published trying to find prognostic indicators in combined algorithms. Verification of the presented results by a homogeneous treated patient group using a controlled clinical study has to be evaluated in further studies.

Die bullösen Autoimmundermatosen sind organspezifische Autoimmunkrankheiten, die durch das Auftreten einer Autoimmunantwort gegen Strukturproteine der Haut gekennzeichnet sind. Diese Proteine sind wichtig für den Zell-Zell-Kontakt der Keratinozyten bzw. für die Adhäsion der Epidermis auf der Dermis. Die blasenbildenden Autoimmunkrankheiten werden nach den betroffenen Zielstrukturen eingeteilt. Man unterscheidet vier Hauptgruppen: die Pemphigus- und Phemphigoid-Erkrankungen, die Epidermolysis bullosa acquisita und die Dermatitis herpetiformis Duhring. Entscheidend für die Diagnosestellung von bullösen Autoimmundermatosen sind Klinik, Histologie sowie direkte und indirekte Immunfluoreszenzuntersuchung. Zur exakten Einordnung der verschiedenen bullösen Dermatosen ist die Charakterisierung der Autoantikörper durch immunserologische Tests notwendig. In der vorliegenden Arbeit beschäftigten wir uns mit der Optimierung des Immunoblotnachweises. Wir untersuchten die Seren von 120 Patienten mit bullösen Autoimmundermatosen mit Extrakten kultivierter Keratinozyten. 63 von 78 Patienten mit bullösem Pemphigoid erkannten entweder BP180 oder BP230. 16 von 18 Patienten mit Pemphigoid gestationis reagierten ebenfalls mit BP180 seltener auch mit BP230. Fünf von 6 Patienten mit Pemphigus vulgaris erkannten Desmoglein 3, einer davon zusätzlich Desmoglein 1. Zwei von 2 Patienten mit Pemphigus foliaceus reagierten mit Desmoglein 1. Fünf von 5 Patienten mit paraneoplastischem Pemphigus zeigten eine Reaktivität mit Envo-, Peri- oder Desmoplakin. Drei von 11 Patienten mit Schleimhautpemphigoid reagierten mit Laminin 5, ein Patient mit BP180. Autoantikörper gegen Kollagen Typ VII und Beta4-Integrin konnten mit Extrakten kultivierter Keratinozyten nicht nachgewiesen werden. Deshalb versuchten wir in weiteren Experimenten, den Nachweis dieser beiden Antigene zu optimieren. Zwei von 2 Patienten mit Epidermolysis bullosa acquisita erkannten Kollagen Typ VII in dermalen Extrakten und konzentriertem Überstand von kultivierten Keratinozyten. Autoantikörper gegen Beta4-Integrin konnten mit extrazellulärer Matrix von kultivierten Keratinozyten in 3 von 12 Seren von Patienten mit Schleimhautpemphigoid nachgewiesen werden. Da der Nachweis von Laminin 5 mit Extrakten kultivierter Keratinozyten nicht zufriedenstellend war, wurde auch dieser Immunoblotnachweis weiter optimiert. Wir konnten zeigen, dass die extrazelluläre Matrix kultivierter Keratinozyten ein besser geeignetes Substrat zum Nachweis von Antikörper gegen Laminin 5 ist, vor allem zum Nachweis der IgG-Subklassen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen insgesamt, dass das Extrakt kultivierter Keratinozyten den größten Teil der verschiedenen Antigene der bullösen Autoimmundermatosen enthält und somit ein effizientes Substrat für den Immunoblotnachweis darstellt. Der Nachweis von Autoantikörper gegen Laminin 5 ist zwar ebenfalls mit diesem Extrakt möglich, sensitiver ist jedoch der Nachweis unter Verwendung extrazellulärer Matrix. Mit extrazellulärer Matrix gelingt auch der Nachweis von Autoantikörpern gegen Beta4-Integrin. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der konzentrierte Überstand von kultivierten Keratinozyten zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Kollagen Typ VII eine gute Alternative zum dermalen Extrakt darstellt. / Autoimmune bullous skin diseases are organ specific autoimmune disorders characterized by autoantibodies against various structural proteins of the skin. These proteins are responsible for cell-to-cell or cell-to-matrix adhesion. Binding of autoantibodies to these proteins results in intra-epidermal or subepidermal blisters. The autoimmune bullous skin diseases are divided into 4 main groups according to the target autoantigen: pemphigus diseases, pemphigoid diseases, epidermolysis bullosa acquisita and dermatitis herpetiformis Duhring. Decisive for the diagnosis of autoimmune bullous skin diseases are clinic, histology, direct and indirect immunofluorescence. For the exact differential diagnosis of the various autoimmune bullous skin diseases immunoserological analysis are necessary. In this study we tried to optimise the immunoblotting analysis. 120 sera from patients with autoimmune bullous skin diseases, including pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, paraneoplastic pemphigus, bullous pemphigoid, pemphigoid gestationis and mucous membrane pemphigoid, were immunoblotted on the keratinocyte extract. Among the 120 sera, 95 showed detectable levels of immunoreactivity to their respective antigens. 63 of 78 sera from patients with bullous pemphigoid detected bands corresponding to BP180 and BP230. 16 of 18 sera from patients with pemphigoid gestationis reacted as well with BP180, rarely with BP230. Five of 6 sera from patient with pemphigus vulgaris recognized Desmoglein 3, one additionally Desmoglein 1. Both patients with pemphigus foliaceus reacted with Desmoglein 1. All sera from patients with paraneoplastic pemphigus detected bands corresponding to Envo-, Peri-, or Desmoplakin. Three of 11 sera from patients with mucous membrane pemphigoid reacted with laminin 5, one with BP180. Autoantibodies to type 7 collagen and beta4-integrin were not detected by immunoblotting with keratinocyte extract. Therefore, we tried to optimise the detection of autoantibodies to type 7 collagen and beta4-integrin. Both sera from patients with epidermolysis bullosa acquisita recognized type 7 collagen in dermal extract and in medium of cultured keratinocytes. In 3 of 12 patients with mucous membrane pemphigoid we were able to detect autoantibodies to beta4-integrin extracted from the extracellular matrix of human keratinocytes. In a next set of experiments, we optimised the detection of autoantibodies against laminin 5. We could show that extracellular matrix of human keratinocytes was the most sensitive substrate for the detection of autoantibodies to laminin 5. This study shows that most of the target antigens in autoimmune bullous skin diseases could be detected with immunblotting analysis using keratinocyte extract. While the detection of autoantibodies to laminin 5 with keratinocyte extract is possible, the extracellular matrix of human keratinocytes represents a more sensitive substrate. Autoantibodies to beta4-integrin can also be detected with extracellular matrix of human keratinocytes. Furthermore we can show that medium of cultured keratinozytes represents a good alternative substrate to dermal extract in the detection of autoantibodies to type 7 collagen.

Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Tumor Nekrose Faktor-&#945; (TNF- &#945;) (TNF-&#945;) in pathophysiologisch relevanten Konzentrationen neben seiner bekannten negativ inotropen Wirkung einen deutlichen Effekt auf die myokardiale Energetik im Myokard der Ratte besitzt. Dieser wurde anhand des Sauerstoffverbrauchs an rechtsventrikulären Muskelstreifenpräparaten quantifiziert. Der erhöhte Energieumsatz bei gleichzeitig reduzierter myokardialer Arbeit, d.h. der gesteigerte spezifische Sauerstoffverbrauch, basiert auf einer verschlechterten Ökonomie des Kontraktionsprozesses. Diese schnelle Wirkung auf die myokardiale Energetik ist durch einen Sphingolipid Signaltransduktionsweg vermittelt. Dagegen spielt wohl für den mechanischen Effekt von TNF-&#945; sowohl NO, als auch Sphingosin eine Rolle. / Objective: Several experimental studies have demonstrated that tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;) impairs myocardial contractility. It was the aim of the present study to test the hypothesis that TNF-&#945; influences myocardial energy metabolism as well. Methods: Oxygen consumption (MVO2) of isometrically contracting trabeculae isolated from right ventricular rat myocardium was analyzed using a clark-type oxygen probe. The slope of the force-time integral-MVO2 regression line indicates economy of contraction. Results: TNF-&#945; impaired myocardial economy without altering baseline MVO2. Incubation with TNF-&#945; in the presence of the NO-synthase inhibitor L-NAME further impaired myocardial economy. Pre-incubation with the ceramidase inhibitor NOE abrogated the TNF-&#945; effect on myocardial economy. The negative inotropic effect of TNF-&#945; was observed in NOE, but not in L-NAME pre-incubated muscle fibers. Moreover, exogenous sphingosine mimicked the TNF-&#945; effect on mechanics and energetics. Conclusion: TNF-&#945; impairs the economy of chemo-mechanical energy transduction primarily through a sphingosine-mediated pathway.