Das four-jointed (fj) Gen in Drosophila ist zum einen am proximo-distalen Längenwachstum der Extremitäten beteiligt, zum anderen spielt es auch eine Rolle in dem in neuerer Zeit verstärkt untersuchten planaren Zellpolaritätssignalweg (PCP-Signalweg). Über das in der Maus identifizierte homologe fjx1 Gen ist dagegen vergleichsweise wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war daher die nähere Charakterisierung von fjx1 sowie die Identifizierung möglicher Interaktionspartner. Durch RNA in situ Hybridisierung wurde zunächst das räumliche und zeitliche Expressionsmuster von fjx1 in Embryonen und adulten Organen untersucht. Dabei zeigte sich, dass fjx1 in allen Stadien vor allem im Gehirn, aber auch in epithelialen Strukturen verschiedener Organe exprimiert war. Obwohl die Expression von fjx1 ebenso wie die von fj über den Notch-Signalweg reguliert wird, konnte im Gegensatz zu Drosophila jedoch keine Regulation von fjx1 über den Wnt- und/oder den JAK/STAT-Signalweg nachgewiesen werden. Da Fj in Drosophila zumindest teilweise sezerniert wird und nicht-zellautomome Effekte zeigt, wurde ein Fjx1-Rezeptor gesucht. Mit Hilfe eines Fjx1-AP Fusionsproteins konnten Bindungsstellen überlappend bzw. angrenzend zu Regionen mit fjx1-Expression gefunden werden. Beispielsweise zeigten in der embryonalen Lunge und der Niere sowohl die in situ Hybridisierung (fjx1-Expression) als auch die Inkubation mit dem Fusionsprotein (Lokalisation des Bindungspartners) Färbung in epithelialen Strukturen, während im adulten Gehirn die Färbungen in jeweils benachbarten Schichten des Hippocampus und des Kleinhirns detektiert wurden. Durch Expressionsklonierung bzw. Coimmunpräzipitation konnte der Rezeptor jedoch nicht identifiziert werden. Aufgrund der Tatsache dass fj in Drosophila in enger Beziehung zu dachsous (ds) und fat (ft) steht, wurden die homologen Gene in der Maus gesucht und deren Expressionsmuster analysiert. In Embryonalstadien war dchs1 komplementär zu fjx1 in mesenchymalen Geweben zu finden, ähnlich der Situation in Drosophila, wo fj und ds in gegenläufigen Gradienten exprimiert sind. Das homologe Gen von ft, fat-j, war hingegen nicht ubiquitär exprimiert, sondern wie dchs1 im Mesenchym. Ergänzend dazu wurden die fat-like (ftl) Homologen, fat1-3, epithelial detektiert. Die Expression in adulten Organen wurde mit Real-Time-PCR untersucht, die zeigte, dass alle Gene (fj, ds und fat Homologe) relativ stark im adulten Gehirn zu finden sind. Mit Hilfe von RNA in situ Hybridisierungen konnten die Gene im Riechhirn, im Hippocampus und im Kortex des Großhirns sowie in der Körnerschicht des Kleinhirns lokalisiert werden. Um Hinweise auf die Funktion von Fjx1 zu erhalten, wurde in Datenbanken nach Proteinen mit ähnlicher Aminosäuresequenz gesucht, die eventuell Auskunft über mögliche Proteindomänen geben sollten. Bei den gefundenen fünf Mausproteinen handelte es sich jedoch um hypothetische bzw. noch nicht untersuchte Proteine, so dass Rückschlüsse auf die Funktion von Fjx1 nicht möglich waren. Die Expression dieser Gene war nach Datenbankangaben entweder sehr spezifisch, beschränkt auf ein bestimmtes Gewebe (z.B. Milchdrüse oder Nebenniere) oder schwach und dafür ubiquitär, was sich auch durch eine schwache, einheitliche Färbung in der RNA in situ Hybridisierung bestätigte. Die Proteinstruktur von Fjx1 und der Fjx1-ähnlichen Proteine sowie die Art der konservierten Reste geben Grund zu der Annahme, dass es sich um (sezernierte) Glykosyltransferasen handeln könnte, was durch die zumindest zeitweise Lokalisation von Fjx1 im Golgi-Apparat bestärkt wird. Auch die in Drosophila gefundenen Ergebnisse sprechen für eine derartige Funktion von Fj, obwohl auch hier noch keine konkreten biochemischen Belege vorliegen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine Konservierung des in Drosophila entdeckten Fj/Ds/Ft-Siganlwegs in Vertebraten hin, wenn auch der genaue Mechanismus der Interaktion zwischen den Proteinen noch nicht geklärt ist und weiterer Untersuchungen bedarf. / The four-jointed (fj) gene in Drosophila is on the one hand involved in proximodistal growth of leg and wing; on the other hand it plays a role in the more recently investigated planar cell polarity (PCP) pathway. In contrast, little is known about the homologous mouse gene fjx1. Therefore, the aim of this thesis was to further characterize fjx1 and to identify potential binding partners. The temporal and spacial expression pattern of fjx1 was analyzed by RNA in situ hybridization on embryos and adult organs. This revealed that fjx1 is predominantly expressed in the brain at all stages investigated and additionally in epithelial structures of various organs. Similar to the Drosophila gene fj the expression of fjx1 is Notch dependent, but in contrast to Drosophila no regulation via the Wnt or JAK/STAT signaling pathway was found. In view of the fact that in Drosophila Fj is at least partially secreted and has some cell nonautonomous effects, a Fjx1 receptor was looked for. Using a Fjx1-AP fusion protein Fjx1 binding sites could be detected in regions overlapping with or adjacent to fjx1 expression, respectively. As an example, staining of epithelial structures in embryonic lung and kidney was found by in situ hybridization (fjx1 expression) as well as with the AP fusion protein (localization of the interaction partner). In the adult brain fjx1 and Fjx1 binding sites were located in adjacent layers of the hippocampus and the cerebellum. Nevertheless, it was not possible to identify the postulated Fjx1 receptor by expression cloning or coimmunoprecipitation. Due to the fact, that fj in Drosophila is closely connected with dachsous (ds) and fat (ft), the homologues mouse genes were searched for and their expression patterns were analyzed. In embryos, dchs1 was expressed complementary to fjx1 in mesenchymal tissues, similar to the situation in Drosophila where fj and ds are expressed in opposing gradients. Unlike ft, the homologous fat-j gene is not expressed ubiquitously, instead, it is found in mesenchymal tissue similar to dchs1. To complete the expected ubiquitous expression, the fat-like (ftl) homologs, fat1-3, were detected in epithelial structures. In adult organs expression was investigated by real time PCR, which revealed all genes (fj, ds and fat homologs) to be strongly expressed in the adult brain. By RNA in situ hybridization the expression was localized to the olfactory bulb, the hippocampus, the cerebral cortex and the granular layer of the cerebellum. To gain information about the function of Fjx1, databases were searched for proteins with a similar amino acid sequence, which should help to identify functional protein domains. Five related mouse proteins were found, but as all proteins were only hypothetical and not investigated so far, it was not possible to draw conclusions about the function of Fjx1. According to database information the expression of the fjx1-related genes was either very specific, restricted to a single tissue (mammary gland or adrenal gland) or the expression was weak, but ubiquitous. This weak ubiquitous expression was confirmed by a weak uniform staining on RNA in situ hybridizations. The protein structure of Fjx1 and the Fjx1-related proteins and the kind of conserved residues led to the assumption that these proteins could be (secreted) glycosyltransferases. This hypothesis is supported by the fact that Fjx1 is at least temporarily located in the Golgi apparatus and by recently published results from Drosophila, although there is no biochemical evidence so far. The results of this work suggest that the Fj/Ds/Ft signaling pathway identified in Drosophila is conserved in vertebrates, although the mechanism of the interaction between these proteins remains completely unknown and has to be elucidated by further investigations.

Zur Herstellung von atropo-enantiomeren Perylenbisimiden wurde die kovalente Verknüpfung von Aryloxysubstituenten durch Makrocyclisierung eingesetzt. Die Darstellung makrocyclischer Perylenbisimide erfolgte ausgehend von einem vierfach (3-Hydroxyphenoxy)-funktionalisierten Perylenbisimid mit achiralen 2,6-Diisopropylphenylsubstituenten an den Imidpositionen durch Williamsonsche Ethersynthese. Die Synthese konnte für vier unterschiedliche Oligoethylenglykol-Kettenlängen realisiert werden, wobei für jede Brückenlänge jeweils zwei regioisomere Makrocyclen, nämlich das diagonal verbrückte (1,7- und 6,12-Verküpfung) und das seitlich verbrückte Isomer (1,12- und 6,7- Verknüpfung), isoliert werden konnten. Die strukturelle Zuordnung der isolierten Makrocyclen zu einem der beiden Regioisomeren gelang zweifelsfrei anhand von Röntgenstrukturanalysen für zwei Makrocyclen und 1H NMR-Spektroskopie für alle Isomere. Der konformative Einfluß der Aryloxy-Substituenten auf die funktionenellen Eigenschaften dieser Farbstoffklasse konnte durch Vergleich der optischen und elektrochemischen Eigenschaften aller isolierter Makrocyclen mit einer offenkettigen Referenzverbindung abgeleitet werden. Hierbei zeigte sich, dass die Aryloxy-Substituenten dieser Farbstoffe in Lösung bevorzugt in einer horizontalen Konformation vorliegen. Durch lösungsmittelabhängige Fluoreszenzmessungen konnte gezeigt werden, dass ein photoinduzierter Elektronentransferprozess für die Fluoreszenzlösung elektronenreicher Aryloxy-Substituenten von Bedeutung ist. Die Trennung der Atropo-Diastereomere konnte für eine diagonal überbrückte makrocyclische Verbindung mit chiralen 2-(R)-Octylamin Imidsubstituenten und Diethyleneglykol als Brückenkette mittels semi-preparativer HPLC an einer chiralen stationären Phase realisiert werden. Die chiroptischen Eigenschaften der isolierten epimerenreinen Makrocyclen wurden mittels CD-Spektroskopie untersucht. Die Zuordnung der absoluten Stereochemie konnte anhand der erhaltenen CD-Spektren durch Anwendung der „Theorie der excitonischen Kopplung“ abgeleitet und durch quantenchemische Berechnung der CD-Spektren bestätigt werden. Dieses Synthesekonzept wurde auf 1,7-diaryloxy-substituierten Perylenbisimide erweitert. Die Struktur der erhaltenen diagonal verbrückten monocyclischen Verbindung konnte erneut durch NMR-Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse eindeutig bestimmt werden. Die Trennung der Atropo-Enantiomere gelang mittels semi-preparativer HPLC an einer chiralen stationären Phase. Die Zuordnung der Stereochemie konnte anhand des Vergleichs der CD-Spektren mit den zuvor für epimerenreine Bismakrocyclen erhaltenen CD-Spektren realisiert werden. Anhand der Röntgenstrukturanalysen sowohl der racemischen Mischung als auch eines Atropo-Enantiomers ließen sich bedeutende Informationen über die p-Dimerisierung von Perylenbisimiden ableiten. Die Abhängigkeit der Razemisierungsbarriere von der Größe der Bay-Substituenten wurde für vier halogensubstituierte Derivate untersucht. Die dynamischen Eigenschaften wurden mittels temperaturabhängiger NMR-Spektroskopie und kinetischer Messungen mittels CD-Spektroskopie bestimmt. Unter Anwendung des „Apparent Overlap“-Konzeptes konnte eine überzeugende lineare Beziehung zwischen der Größe der Substituenten und der Inversionsbarriere hergestellt werden. Darüber hinaus war es möglich die Atropo-Diastereomere bzw. Enantiomere der tetrachlor- und tetrabrom-substituierten Derivate zu trennen, wobei vor allem das 1,6,7,12-tetrabrom-substituierte Perylenbisimid stabile Enantiomere bei Raumtemperatur lieferte. Die abgeleitete Struktur-Eigenschaftsbeziehung sollte zukünftig die Herstellung von stabilen Enantiomeren durch geeignete Wahl der Substituenten in den Bay-Positionen ermöglichen. Um die Reversibilität der Selbstorganisation zur quantitativen Synthese makrocyclischer Perylenbisimide ausnützen zu können, wurde ein tetra(zinkporphyrin)-funktionalisiertes Perylenbisimid synthetisiert. Die Ausbildung des angestrebten 1:2-Sandwichkomplexes aus Tetra-Zinkporphyrin-Perylenbisimid und Diazabicyclo-[2.2.2]-undecan wurde mittels UV/Vis und 1H NMR Spektroskopie untersucht und die makrocyclische Struktur des Komplexes konnte mittels diffusionsabhängiger NMR Spektroskopie (DOSY NMR) eindeutig bewiesen werden. Weiterhin konnte mittels rasterkraftmikroskopischer (AFM) Untersuchungen gezeigt werden, dass diese funktionellen makrocyclischen Verbindungen sehr geordnet auf einer Graphitoberfläche (HOPG) abgeschieden werden können. Die Ausrichtung eines amino-funktionalsierten p-konjugierten Polymers durch Zugabe des bichromphoren Tetra-Zinkporphyrin-Perlyenbisimids wurde mittels UV/Vis-Spektroskopie und AFM-Messungen untersucht. Die Oberflächenanalyse mittels AFM zeigte, dass die bichromophore Verbindung die linearen p-konjugierten Polymere über weite Teile der Oberfläche auszurichten vermag, so dass eine definierte Anordnung von drei p-Systemen auf der Graphitoberfläche ermöglicht wurde. / The covalent linkage of the aryloxy-substituents through macrocyclisation was applied for the synthesis of perylene bisimide atropo-enantiomers. The synthesis of macrocyclic perylene bisimides was achieved by using a tetra(3-hydroxyphenoxy)-functionalized perylene bisimide with achiral 2,6-diisopropylphenyl as imide substituent through Williamson´s etherfication which could be realized for four different oligoethylene glycol bridging units. Two regioisomeric macrocycles, namely the diagonally bridged (1,7- and 6,12- linkage) and the laterally bridged (1,12- and 6,7-linkage) isomers, were obtained for each bridging unit. The structural assignment of the isolated regioisomeric macrocycles was unambiguously accomplished by X-ray analysis of two macrocycles and by 1H NMR spectroscopy for all isomers. The conformational influence of the aryloxy-substituents on the functional properties of this class of chromophores could be derived by comparison of the optical and electrochemical properties of all isolated macrocylces with those of an open-chained reference compound. It was shown that the aryloxy-substituents prefer a lateral conformation in solution. Furthermore, solvent dependent fluorescence studies indicated that a photoinduced electron transfer process is of importance for the fluorescence quenching of electron-rich aryloxy-substituted perylene bisimides. The resolution of the atropo-diastereomers of diagonally bridged macrocyclic perylene bisimides with chiral 2-(R)-octylamine as imide substituent and diethylene glycol bridging units could be accomplished by semi-preparative HPLC on a chiral column. The chiroptical properties of the isolated epimerically pure macrocycles were determined by CD spectroscopy. Based on the experimental CD spectra, the stereochemical assignment of the isolated epimers was accomplished by application of the excition chirality method and confirmed by quantum chemical calculation of the CD spectra. The synthetical concept was extended successfully to 1,7-diaryloxy-substituted perylene bisimides. The structure of the diagonally bridged macrocycle was unambiguously confirmed by X-ray analysis and NMR spectroscopy. The atropo-enantiomers of this macrocycle could be resolved by semi-preparative HPLC on a chiral column and the assignment of the absolute configuration was achieved by comparison of the CD spectra of the resolved enantiomers with those of epimerically pure bis(macrocycles) reported before. By comparison of the X-ray structures obtained for the racemic mixture as well as one enantiomer important information could be extracted for the formation of p-dimers of perylene bisimides. The dependence of the interconversion barrier on the bulkiness of the bay-substituents was investigated for four halogen-substituted perylene bisimides. The dynamic properties were investigated by temperature-dependent NMR spectroscopy and kinectic measurements using CD spectroscopy. By applying the concept of the “apparent overlap” a convincing linear relationship between the size of the substituents and the free enthalpy of activation could be derived. Furthermore, the resolution of the atropo-diastereomers or enantiomers of the tetrachloro and tetrabromo-substituted derivates was accomplished, whereupon especially the 1,6,7,12-tetrabromosubstituted perylene bisimide provided at room temperature stable enantiomers. Additionally, the derived structure-property relationship allows the design of conformationally stable perylene bisimide enantiomers by proper choice of the bay substituents. In order to utilize the reversibility of self-assembly for the quantitative formation of macrocyclic perylene bisimides, a tetrazinc porphyrin-functionalized perylene bisimide was synthesized. The self-assembly of the zinc porphyrin perylene bisimide bichromophoric building block and diazabicyclo-[2.2.2]-undecane into the desired 1:2 sandwich complex was investigated by UV/Vis and 1H NMR spectroscopy and the macrocyclic structure was unequivocally proven by diffusion-ordered NMR spectroscopy (DOSY NMR). Furthermore, the controlled deposition of these well-defined macrocycles on highly ordered pyrolitic graphite (HOPG) was demonstrated by atomic force microscopy (AFM) investigations. The alignment of a linear amino functionalised p-conjugated polymers upon addition of the bichromphoric tetrazinc porphyrin-perylene bisimide was investigated by UV/Vis spectroscopy and AFM measurement. The surface analysis by AFM investigations revealed that the bichromophoric system composed of perylene bisimide and zinc porphyrin is able to cross-link the linear p-conjugated polymer over a wide range of the graphite surface which provided a defined arrangement of three different functional p-systems.

Successful formulation development of novel, particularly organic APIs of low molecular weight as candidates for ground-breaking pharmaceutical products is a major challenge for the pharmaceutical industry because of the poor aqueous solubility of most of these compounds. The hit identification strategies of drug development in use today apply high throughput screening techniques for the investigation of thousands of substances. This approach led to a systematical increase in molecular weight and lipophilicity and a decrease of water solubility of lead compounds reaching market access. The high lipophilicity causes an excellent permeability of the compounds which favours the absorption process from the small intestine, but it causes a decrease of water-solubility. It becomes evident that an adequate aqueous solubility is necessary for absorption of the API from the gastrointestinal fluids into the systemic circulation and hence for efficacy of the pharmaceutical product. Only an dissolved API is getting absorbed and becomes efficacious. The precipitated proportion is resigned directly. Therefore, the development of an individual formulation aligning the physicochemical characteristics is necessary for every API to produce supersaturated solutions in the small intestine and to reach an adequate bioavailability after absorption into the systemic circulation. In this thesis a specific formulation development was investigated for two exemplary poorly water-soluble APIs to replace the empirical approach often used today. The basic tyrosine-kinase inhibitor imatinib and six different acetylated amino acids were transferred into ILs. As compared to the free base and the mesylate salt, which is marketed by Novartis AG as Gleevec®, the dissolution rate as well as the supersaturation time was increased significantly. By changing the mesylate anion with its potential genotoxic risks, the total toxicity of the drug product could be decreased. The amorphous ILs proved adequate stability under forcing conditions and there was no recrystallization of the free base observed. The amorphous character of the ILs caused an increased amount of water vapour sorption which can be compensated by special packaging materials. Taken together, the presentation of imatinib as an IL is intended for oral administration as a tablet and can cause a reduction of dose because of the increased solubility. Therefore, the occurrence of side effects can be reduced as compared to Gleevec®. If there is actually an increased bioavailability to observe, has to be proved by the execution of animal trials. The novel NOX inhibitor VAS3947 is intended for the treatment of endothelial dysfunctions causing diseases like heart failure and stroke. The compounds poor aqueous solubility hindered further clinical development so far and make the drug candidate to remain in a very early stage of the drug development process. Therefore, different formulation concepts were evaluated in this study: An amorphous solid dispersion prepared from VAS3947 and Eudragit® L100 by means of spray drying was able to increase the dissolution rate and solubility of the compound significantly, but with the accomplished kinetic solubility being in the low µM range it is not possible to reach therapeutic plasma concentrations. In contrast, the incorporation into cyclodextrins resulted in an 760-fold increased solubility. Different cyclodextrins were evaluated. Especially the lipophilic derivatives of the β-cyclodextrin showed to be the most adequate excipients. The incorporation of the API into the cyclodextrin cavity was proved by means of NMR spectroscopy. Additionally, a formulation of VAS3947 and hydroxypropyl-β-cyclodextrin was prepared. This formulation is intended for the intravenous application during animal trials, which have to be conducted to get to know the pharmacokinetics of VAS3947. This formulation reached a concentration of 1 mg/mL spending striking protection of VAS3947 against degradation. Presentation of VAS3947 as a microemulsion system led also to increase the aqueous solubility of the compound, but not in the same extent as the cyclodextrin formulation. Beside the formulation development a physicochemical characterization was performed to get to know important parameters such as log P and pKa values of VAS3947. An HPLC method was developed and validated to analyse the extent of solubility improvement. A major issue of the compound VAS3947 and all related triazolopyrimidine derivatives, developed by Vasopharm GmbH, is the insufficient chemical stability because of presence of a hemiaminal moiety in the chemical structure. Stability investigations and an extensive biopharmaceutical characterization confirm the hindering of further clinical development by insufficient drug stability and high cytotoxicity. Poor aqueous solubility is an additional disadvantage which can be handled by a concerted formulation development. / Die erfolgreiche Formulierung von neuen, insbesondere organischen Wirkstoffen geringen Molekulargewichtes als Entwicklungskandidaten für innovative Arzneimittel stellt eine erhebliche Herausforderung für die pharmazeutische Industrie dar, weil ein Großteil dieser Substanzen ausgesprochen schlecht wasserlöslich ist. Die moderne Wirkstoffentwicklung basiert meistens auf der Zielstruktur und erfolgt unter Anwendung von Hochdurchsatzmethoden, bei denen Tausende an verschiedenen Substanzen getestet werden. Dieses Vorgehen hat in den letzten Jahrzehnten dazu geführt, dass die molare Masse und die Lipohilie derjenigen Entwicklungskandidaten, die eine Zulassung als Arzneimittel erreicht haben, kontinuierlich zugenommen haben. Durch die hohe Lipophilie weisen diese Wirkstoffe eine ausgezeichnete Permeabilität auf, die für den Absorptionsprozess aus dem Magen-Darm-Trakt notwendig ist. Jedoch geht damit gleichzeitig eine Abnahme der Wasserlöslichkeit einher. Es ist offensichtlich, dass eine ausreichendende hohe Wasserlöslichkeit die Grundvoraussetzung für die Absorption des Wirkstoffes aus dem Gastrointestinaltrakt in den systemischen Kreislauf und damit für die Wirksamkeit des Arzneimittels darstellt. Nur in Lösung befindlicher Wirkstoff kann absorbiert werden und seine Wirkung erzielen. Der ungelöste Anteil wird unverändert wieder ausgeschieden. Aus diesem Grunde ist die Entwicklung einer individuellen, an die physiko-chemischen Eigenschaften angepassten Formulierung für jeden Wirkstoff unbedingt erforderlich, um im Magen-Darm-Trakt übersättigte Lösungen zu generieren und dadurch eine ausreichende Bioverfügbarkeit zu erzielen. In dieser Arbeit wurden exemplarisch zwei schlecht lösliche Wirkstoffe ausgesucht und einer gezielten Formulierungsentwicklung unterzogen, um die bisher oft angewandte rein empirische Vorgehensweise abzulösen. Aus dem basischen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib und unterschiedlichen acetylierten Aminosäuren wurden 6 verschiedene ionische Flüssigkeiten hergestellt. Im Vergleich mit der freien Base und dem Mesilat-Salz, welches die Firma Novartis AG unter dem Namen Gleevec® im Handel hat, wurden sowohl die Auflösungsrate als auch die zeitliche Dauer der Übersättigung signifikant vergrößert. Durch den Austausch des potentiell genotoxischen Mesilat-Anions gegen die acetylierten Aminosäuren konnte zusätzlich das Toxizitätsrisiko gesenkt werden. Die amorphen Formulierungen der ionische Flüssigkeiten waren unter Stressbedingungen ausreichend stabil und zeigten kein erhöhtes Risiko für eine Rekristallisation der freien Base. Die durch den amorphen Charakter gesteigerte Hygroskopizität lässt sich durch den Einsatz entsprechender Packmittel kompensieren. Generell eignet sich die Formulierung von Imatinib als ionische Flüssigkeit für die orale Applikation als Tablette und kann durch die Verbesserung der Wasserlöslichkeit zu einer Dosisreduktion beitragen, sodass weniger Nebenwirkungen auftreten als bei dem im Handel befindlichen Mesilat-Salz. Ob tatsächlich eine Verbesserung der Bioverfügbarkeit eintritt, muss noch durch Experimente im Tiermodell bestätigt werden. Der neuartige NOX-Inhibitor VAS3947 ist zur Behandlung von arteriosklerotischen Veränderungen im Gefäßendothel und damit allen verbunden Folgeerkrankungen wie zum Beispiel Herzinfarkt oder Schlaganfall von der Vasopharm GmbH entwickelt worden. Die extrem schlechte Wasserlöslichkeit hat bisher die klinische Forschung verhindert und der Wirkstoff befindet sich nach wie vor in einer sehr frühen Phase der Entwicklung. Aus diesem Grund wurden im Zuge dieser Arbeit verschiedene Formulierungskonzepte erforscht: Eine erste sprühgetrocknete, amorphe Formulierung mit dem Polymer Eudragit® L100 konnte zwar die Auflösungsrate und die Löslichkeit signifikant verbessern, allerdings kam es schnell zur Rekristallisation des Wirkstoffes und mit der erzielten kinetischen Löslichkeit im niedrigen µM Bereich ließen sich keine therapeutischen Plasmaspiegel erreichen. Durch die Herstellung einer Cyclodextrineinschlussverbindung von VAS3947 hingegen konnte die Löslichkeit um den Faktor 760 gesteigert werden. Verschiedene Cyclodextrine wurden getestet. Dabei erwiesen sich insbesondere die lipophilen Derivate des β-Cyclodextrins als geeignet. Die Einlagerung des Wirkstoffes in das Innere der Kavität wurde mittels NMR-Spektroskopie bestätigt. Zusätzlich wurde erstmals eine Formulierung von VAS3947 mit Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin zur intravenösen Anwendung im Tiermodell für die Durchführung von geplanten Pharmakokinetikstudien hergestellt. Diese erzielte über 24 Stunden eine Löslichkeit von 1 mg/mL und schütze den Wirkstoff effektiv vor Zersetzung. Durch die Formulierung von VAS3947 als halbfeste Mikroemulsion konnte die Wasserlöslichkeit ebenfalls gesteigert werden, allerdings längst nicht in dem Maße wie durch die Cyclodextrine. Neben der Formulierungsentwicklung wurde eine physiko-chemische Charakterisierung des Wirkstoffes durchgeführt, um wichtige Parameter wie zum Beispiel die log P- und pKs-Werte einschätzen zu können. Des Weiteren wurde eine HPLC-Methode entwickelt und validiert, um die erzielte Löslichkeit quantifizieren zu können. Ein großes Problem dieses Wirkstoffes und damit aller Derivate vom Triazolopyrimidine-Typ, welche die Vasopharm GmbH in der Entwicklung hat, ist die mangelnde chemische Stabilität aufgrund einer Halbaminal-Partialstruktur im Molekül. Durchgeführte Stabilitätsuntersuchungen sowie eine umfangreiche biopharmazeutische Charakterisierung bestätigten letztendlich, dass eine weitere Entwicklung dieser Wirkstoffe aufgrund ihrer ungenügenden Stabilität und ihrer hohen Zytotoxizität nicht möglich ist. Die niedrige Wasserlöslichkeit stellt ein zusätzliches Problem dar, das sich durch eine gezielte Formulierungsentwicklung lösen lässt.

The first Borono-Strecker reaction has been developed to synthesize α-aminoboronates via a multicomponent reaction of readily available carbonyl compounds (aldehydes and ketones), amines and B2pin2. The preparation of α-amino cyclic boronates can be achieved via multicomponent coupling of salicylaldehydes, amines, and B2(OH)4. In addition, the diazaborole-based PBP pincer palladium chloride and the diazaborole-based PBP pincer palladium trifluoromethanesulfonate complexes were synthesized and fully characterized for the first time, and used as catalysts for Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. / Wurde die erste Borono-Strecker Reaktion zur Synthese von α-Aminoboronaten, mittels einer Multikomponenten-Reaktion aus leicht zugänglichen Carbonylverbindungen (Aldehyde und Ketone), Aminen und B2pin2, entwickelt. Außerdem gelang die Darstellung von zyklischen α-Aminoboronaten durch Multikomponenten-Kupplung von leicht zugänglichen Salicylaldehyden, Aminen und B2(OH)4. Des Weiteren wurde der Diazaborol-basierte PBP Pincer Palladium Chlorid Komplex und der Diazaborol-basierte PBP Pincer Palladium Trifluoromethylsulfonat Komplex erstmalig synthetisiert, vollständig charakterisiert und als Katalysator für Suzuki-Miyaura Kreuzkupplungen eingesetzt.

Estrogens, namely 17β-estradiol (E2) and estrone (E1) are considered to play an important role in the initiation and promotion of breast cancer (summarized in Raftogianis et al., 2000), a malignancy responsible for around 500,000 deaths per year (summarized in Ghislain et al., 2016). Two major mechanisms have been postulated to explain the carcinogenic effects of estrogens: (1) the estrogen receptor-mediated stimulation of breast cell proliferation with a concomitant enhanced rate of mutations and (2) the metabolism of hydroxylated estrogens to quinone derivatives which can react with the DNA (Russo and Russo, 2006, summarized in Yager and Davidson, 2006). Nevertheless, as a detoxifying mechanism, E1, E2, and their hydroxylated and methoxylated metabolites are reversibly conjugated into sulfates and glucuronides devoid of biological activity (summarized in Guillemette et al., 2004). Yet, despite the key detoxifying function of these conjugates, the study of their circulating levels face some significant problems: (1) analysis by techniques such as radioimmunoassay lack specificity and accuracy and requires enzymatic/chemical hydrolysis before analysis, being unable to differentiate between sulfates and glucuronides (summarized in Stanczyk et al., 2007, summarized in Wang et al., 2016), (2) very little knowledge in healthy women, which has been identified as a barrier to advance in breast cancer research (summarized in Liu, 2000), and (3) far fewer studies in pre- than in postmenopausal women (summarized in Samavat and Kurzer, 2015). Therefore, to get more insights into the research of breast cancer etiology and prevention, the analysis of circulating levels of estrogens (including metabolites and conjugates) in women without breast cancer through reliable analytical techniques, is required. / Estrogene spielen eine zentralle Rolle bei der Entstehung von Brustkrebs. Jedoch haben nicht alle Estrogenmetabolite die gleiche Wirkung. Deshalb ist das Wissen über das Profil der zikulierenden Estrogene bei gesunden Frauen von entscheidender Bedeutung. Die meisten Methoden zur Analyse von Estrogenen zielen jedoch entweder nicht auf konjugierte Estrogene ab oder erfassen nur die Summe der jeweiligen freien und konjugierten Form. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war demzufolge, die Möglichkeit der Einbeziehung von Methoxyestrogenglucuroniden in eine bestehende Methode zur Analyse von Estrogenen zu evaluieren und somit die Analyse von Estrogenprofilen im menschlichen Plasma und im Brustgewebe von Frauen ohne Brustkrebs zu ergänzen. ...

The US National Research Council (NRC) report "Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)", published in 2007, calls for a complete paradigm shift in tox-icity testing. A central aspect of the proposed strategy includes the transition from apical end-points in in vivo studies to more mechanistically based in vitro tests. To support and facilitate the transition and paradigm shift in toxicity testing, the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept is widely recognized as a pragmatic tool. As case studies, the AOP concept was ap-plied in this work to develop AOPs for proximal tubule injuries initiated by Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload and Inhibition of mtDNA polymerase-. These AOPs were used as a mechanistic basis for the development of in vitro assays for each key event (KE). To experimentally support the developed in vitro assays, proximal tubule cells from rat (NRK-52E) and human (RPTEC/TERT1) were treated with model compounds. To measure the dis-turbance of lysosomal function in the AOP – Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload, polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide) were used as model compounds. Altered expression of lysosomal associated membrane protein 1/2 (LAMP-1/2) (KE1) and cathepsin D release from lysosomes (KE2) were determined by im-munofluorescence, while cytotoxicity (KE3) was measured using the CellTiter-Glo® cell via-bility assay. Importantly, significant differences in polymyxin uptake and susceptibility be-tween cell lines were observed, underlining the importance of in vitro biokinetics to determine an appropriate in vitro point of departure (PoD) for risk assessment. Compared to the in vivo situation, distinct expression of relevant transporters such as megalin and cubilin on mRNA and protein level in the used cell lines (RPTEC/TERT1 and NRK-52E) could not be con-firmed, making integration of quantitative in vitro to in vivo extrapolations (QIVIVE) neces-sary. Integration of QIVIVE by project partners of the University of Utrecht showed an im-provement in the modelled biokinetic data for polymyxin B. To assess the first key event, (KE1) Depletion of mitochondrial DNA, in the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, a RT-qPCR method was used to determine the mtDNA copy number in cells treated with mod-el compounds (adefovir, cidofovir, tenofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil fumarate). Mitochondrial toxicity (KE2) was measured by project partners using the high-content imaging technique and MitoTracker® whereas cytotoxicity (KE3) was determined by CellTiter-Glo® cell viability assay. In contrast to the mechanistic hypothesis underlying the AOP – Inhibition of mtDNA polymerase-, treatment with model compounds for 24 h resulted in an increase rather than a decrease in mtDNA copy number (KE1). Only minor effects on mitochondrial toxicity (KE2) and cytotoxicity (KE3) were observed. Treatment of RPT-EC/TERT1 cells for 14 days showed only a slight decrease in mtDNA copy number after treatment with adefovir dipivoxil and tenofovir disoproxil fumarate, underscoring some of the limitations of short-term in vitro systems. To obtain a first estimation for risk assessment based on in vitro data, potential points of departure (PoD) for each KE were calculated from the obtained in vitro data. The most common PoDs were calculated such as the effect concentra-tion at which 10 % or 20_% effect was measured (EC10, EC20), the highest no observed effect concentration (NOEC), the lowest observed effect concentration (LOEC), the benchmark 10 % (lower / upper) concentrations (BMC10, BMCL10, BMCU10) and a modelled non-toxic con-centration (NtC). These PoDs were then compared with serum and tissue concentrations de-termined from in vivo studies after treatment with therapeutic / supratherapeutic doses of the respective drugs in order to obtain a first estimate of risk based on in vitro data. In addition, AOPs were used to test whether the quantitative key event relationships between key events allow prediction of downstream effects and effects on the adverse outcome (AO) based on measurements of an early key event. Predictions of cytotoxicity from the mathematical rela-tionships showed good concordance with measured cytotoxicity after treatment with colistin and polymyxin b nonapeptide. The work also revealed uncertainties and limitations of the ap-plied strategy, which have a significant impact on the prediction and on a risk assessment based on in vitro results. / Der Bericht des US National Research Council (NRC) „Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a strategy (Tox21)“, der 2007 veröffentlicht wurde, sieht einen vollständigen Paradigmenwechsel in der Toxizitätsprüfung vor. Ein zentraler Aspekt des Berichts beinhaltet den Übergang von apikal ermittelten Endpunkten für Toxizität in in vivo Studien, zu mehr mechanistisch basierten in vitro Tests. Um den Übergang zu erleichtern und den Paradigmen-wechsel in der Prüfung auf Toxizität zu unterstützen, wird das Adverse Outcome Pathway (AOP) Konzept als pragmatisches Instrument weithin anerkannt. In dieser Arbeit wurde das AOP Konzept angewandt, um neue Ansätze zur Prüfung auf systemische Toxizität zu unter-suchen. Dazu wurden AOPs für proximale Tubulusschäden, die durch lysosomale Überladung und Inhibition der mtDNA Polymerase- initiiert werden, entwickelt. Diese AOPs wurden als mechanistische Grundlage für die Entwicklung von mechanistisch relevanten in vitro Tests für jedes Schlüsselereignis (KE) verwendet. Um die entwickelten in vitro Tests experimentell zu unterstützen, wurden proximale Tubuluszellen aus der Ratte (NRK-52E) und aus dem Men-schen (RPTEC/TERT1) mit Hilfe von Modellsubstanzen behandelt. Zur Messung der Störung der lysosomalen Funktion im AOP – Rezeptor-vermittelte Endozytose und lysosomale Überla-dung wurden Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid) als Modellsubstanzen verwendet. Die gestörte Expression des lysosomal assoziierten Membran-proteins 1/2 (LAMP 1/2) (KE1) und die Cathepsin D Freisetzung (KE2) wurden mittels Im-munofluoreszenztechnik bestimmt und die Zytotoxizität (KE3) mittels CellTiter-Glo® Zellvia-bilitätstest gemessen. Zwischen den Zelllinien wurden signifikante Unterschiede in der Auf-nahme von Polymyxinen und der Empfindlichkeit beobachtet, was die Bedeutung der in vitro Biokinetik zur Definition eines geeigneten Ausgangspunktes für die Risikobewertung unter-streicht. Im Vergleich zur in vivo Situation, konnte eine eindeutige Expression von relevanten Trans-portern wie Megalin und Cubilin auf mRNA und Proteinebene in den verwendeten Zelllinien (RPTEC/TERT1 und NRK-52E) nicht gezeigt werden, was eine zusätzliche Integration von quantitativen in vitro zu in vivo Extrapolationen (QIVIVE) unabdingbar macht. Die Integrati-on von QIVIVE durch Projektpartner der Universität Utrecht zeigte eine Verbesserung der modellierten biokinetischen Werte für Polymyxin B. Zur Bestimmung des ersten Schlüsseler-eignisse, (KE1) Depletion von mitochondrialer DNA, im AOP – Hemmung der mitochondria-len DNA Polymerase-, wurde nach Behandlung mit Modellsubstanzen (Adefovir, Cidofovir, Tenofovir, Adefovirdipivoxil, Tenofovirdisoproxil Fumarat) eine RT-qPCR Methode verwen-det, um die mtDNA Kopienzahl zu bestimmen. Die mitochondriale Toxizität (KE2) wurde mittels eines hochauflösenden Bildgebungsverfahrens und MitoTracker® vom Projektpartner des Fraunhofer Institut in Hamburg gemessen, während die Zytotoxizität (KE3) mittels Cel-lTiter-Glo® Zellviabilitätstest ermittelt wurde. Entgegen der mechanistischen Hypothese des AOPs – Hemmung der mitochondrialen DNA Polymerase-, führte eine 24 h Behandlung mit den Modellsubstanzen eher zu einer Erhöhung als zu einer Verringerung der mtDNA-Kopienzahl (KE1). Auch wurden nur geringe Auswirkungen auf die mitochondriale Toxizität (KE2) und Zytotoxizität (KE3) beobachtet. Die Behandlung von RPTEC/TERT1 Zellen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine leichte Abnahme der mtDNA Kopienzahl nach Be-handlung mit Adefovirdipivoxil und Tenofovirdisoproxil Fumarat, was den Bedarf an zeit-aufgelösten Daten und Einschränkungen von kurzfristigen in vitro Systemen unterstreicht. Um eine erste Einschätzung für die Risikobewertung basierend auf in vitro Daten zu erhalten, wurden aus den erhaltenen in vitro Daten für jedes KE mögliche Ausgangspunkte (Points of Departure (PoD)) berechnet. Dazu wurden gängige in vitro PoDs berechnet, wie die Effekt-konzentration, bei der 10 % bzw. 20 % Effekt gemessen wurden (EC10, EC20), die höchste Konzentration ohne Wirkung (no observed effect Konzentration (NOEC)), die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (lowest observed effect Konzentration (LOEC)), die Benchmark 10 % (unterer / obere) Konzentrationen (BMC10, BMCL10, BMCU10) und eine modellierte nicht-toxische Konzentration (NtC). Diese wurden dann mit Serum- bzw. Ge-webskonzentrationen aus in vivo Studien verglichen, die nach Gabe therapeutischer / suprathe-rapeutischer Dosen gemessen wurden. Zusätzlich wurde überprüft, ob es mit Hilfe von quanti-tativen Beziehungen zwischen Schlüsselereignissen möglich ist, basierend auf der Bestimmung früher Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorherzusagen. Diese Untersuchungen zeig-ten eine gute Korrelation der aus den mathematischen Beziehungen modellierten Daten mit den tatsächlich gemessenen Werten der Zytotoxizität der Modellsubstanzen Colistin und Po-lymyxin B-Nonapeptid. Im Rahmen der Arbeit wurden auch Unsicherheiten und Limitationen der Strategie deutlich, die maßgebliche Auswirkungen auf die Vorhersage und auf die Risiko-bewertung basierend auf in vitro Resultaten haben.

In the past decade, poly(2-oxazoline)s (POx) and very recently poly(2-oxazine)s (POzi) based amphiphiles have shown great potential for medical applications. Therefore, the major aim of this thesis was to further explore the pharmaceutical and biomedical applications of POx/POzi based ABA triblock and AB diblock copolymers, respectively with the special emphasis on structure property relationship (SPR). ABA triblock copolymers (with shorter side chain length in the hydrophobic block) have shown high solubilizing capacity for hydrophobic drugs. The issue of poor aqueous solubility was initially addressed by developing a (micellar) formulation library of 21 highly diverse, hydrophobic drugs with POx/POzi based ABA triblock copolymers. Theoretically, the extent of compatibility between polymers and drug was determined by calculating solubility parameters (SPs). The SPs were thoroughly investigated to check their applicability in present systems. The selected formulations were further characterized by various physico-chemical techniques. For the biomedical applications, a novel thermoresposive diblock copolymer was synthesized which has shown promising properties to be used as hydrogel bioink or can potentially be used as fugitive support material. The most important aspect i.e. SPR, was studied with respect to hydrophilic block in either tri- or di-block copolymers. In triblock copolymer, the hydrophilic block played an important role for ultra high drug loading, while in case of diblock, it has improved the printability of the hydrogels. Apart from the basic research, the therapeutic applications of two formulations i.e. mitotane (commercially available as tablet dosage form for adrenocortical carcinoma) and BT-44 (lead compound for nerve regeneration) were studied in more detail. / In den letzten zehn Jahren haben auf Poly(2-oxazolinen) (POx) und in jüngster Zeit auf Poly(2-oxazinen) (POzi) basierende Amphiphile ein großes Potenzial für medizinische Anwendungen gezeigt. Daher war das Hauptziel dieser Arbeit die weitere Erforschung der pharmazeutischen und biomedizinischen Anwendungen von POx/POzi-basierten ABA-Triblock- und AB-Diblock-Copolymeren, jeweils mit besonderem Schwerpunkt auf Struktur-Eigenschafts-Beziehungen (SPR). ABA-Triblockcopolymere (mit kürzerer Seitenkettenlänge im hydrophoben Block) haben eine hohe Solubilisierungskapazität für hydrophobe Arzneimittel gezeigt. Das Problem der schlechten Wasserlöslichkeit wurde zunächst durch die Entwicklung einer (mizellaren) Formulierungsbibliothek von 21 sehr unterschiedlichen, hydrophoben Arzneimitteln mit ABA-Triblockcopolymeren auf POx/POzi-Basis angegangen. Theoretisch wurde das Ausmaß der Kompatibilität zwischen Polymeren und Arzneistoff durch Berechnung von Löslichkeitsparametern (SPs) bestimmt. Die SPs wurden gründlich untersucht, um ihre Anwendbarkeit in gegenwärtigen Systemen zu überprüfen. Die ausgewählten Formulierungen wurden weiter durch verschiedene physikalisch-chemische Techniken charakterisiert. Für biomedizinische Anwendungen wurde ein neuartiges thermoresponsives Diblockcopolymer synthetisiert, das vielversprechende Eigenschaften für die Verwendung als Hydrogel-Biotinte gezeigt hat oder möglicherweise als flüchtiges Trägermaterial verwendet werden kann. Der wichtigste Aspekt, d. h. SPR, wurde im Hinblick auf den hydrophilen Block in entweder Tri- oder Di-Block-Copolymeren untersucht. Beim Triblock-Copolymer spielte der hydrophile Block eine wichtige Rolle für die ultrahohe Wirkstoffbeladung, während er beim Diblock die Bedruckbarkeit der Hydrogele verbessert hat. Neben der Grundlagenforschung wurden die therapeutischen Anwendungen von zwei Formulierungen, nämlich Mitotan (kommerziell erhältlich als Tablettenform für das Nebennierenrindenkarzinom) und BT-44 (Leitsubstanz für die Nervenregeneration) genauer untersucht.

Motivated by the perceived great potential of chiral polymers, the presented work aimed at the investigation of synthesis, solubility and optical activity of chiral poly(2,4-disubstituted-2-oxazoline)s. A novel polymeric carrier based on ABA-type triblock copolymers poly(2-oxazoline)s with chiral and racemic hydrophobic blocks was developed for the formulation of chiral and achiral drugs (Fig. 5.1). Poly(2-methyl-2-oxazoline) (pMeOx) was used as hydrophilic A block, and poly(2-ethyl-4-ethyl-2-oxazoline) (pEtEtOx) and poly(2-propyl-4-methyl-2-oxazoline) (pPrMeOx) were used as hydrophobic B blocks. Curcumin (CUR), paclitaxel (PTX) and chiral/racemic ibuprofen (R/S/RS-IBU) were applied as model drugs. Nanoformulations were prepared consisting of these triblock copolymers and model drugs. ... / Motiviert durch das wahrgenommene große Potential chiraler Polymere zielte die vorliegende Arbeit auf die Untersuchung der Synthese, Löslichkeit und optischen Aktivität von chiralen Poly(2,4-disubstituierten-2-oxazolin)en ab. Für die Formulierung von chiralen und achiralen Arzneimitteln wurde ein neuartiger polymerer Träger auf der Basis von ABA-Typ Triblock-Copolymeren aus Poly(2-oxazolin)en mit chiralen und racemischen hydrophoben Blocken entwickelt (Abbildung 5.1). Poly(2-methyl-2-oxazolin) (pMeOx) wurde als hydrophiler A Block und Poly(2-ethyl-4-ethyl-2-oxazolin) (pEtEtOx) und Poly(2-propyl-4-methyl-2-oxazolin) (pPrMeOx) als hydrophober B Block verwendet. Als Modellarzneimittel wurden Curcumin (CUR), Paclitaxel (PTX) und chirales/racemisches Ibuprofen (R/S/RS-IBU) eingesetzt. Es wurden Nanoformulierungen hergestellt, die aus diesen Triblock-Copolymeren und Modellarzneimitteln bestehen. ...

The introduction of novel bioactive materials to manipulate living cell behavior is a crucial topic for biomedical research and tissue engineering. Biomaterials or surface patterns that boost specific cell functions can enable innovative new products in cell culture and diagnostics. This study aims at investigating the interaction of living cells with microstructured, nanostructured and nanoporous material surfaces in order to identify distinct systematics in cell-material interplay. For this purpose, three different studies were carried out and yielded individual effects on different cell functions. Cell migration processes are controlled by sensitive interaction with external cues such as topographic structures of the cell's environment. The first part of this study presents systematically controlled assays to investigate the effects of spatial density and local geometry of micron scale topographic cues on amoeboid migration of Dictyostelium discoideum cells in quasi-3D pillar fields with systematic variation of inter-pillar distance and pillar lattice geometry. We can extract motility parameters in order to elucidate the details of amoeboid migration mechanisms and consolidate them in a two-state contact-controlled motility model, distinguishing directed and random phases. Specifically, we find that directed pillar-to-pillar runs are found preferably in high pillar density regions, and cells in directed motion states sense pillars as attractive topographic stimuli. In contrast, cell motion in random probing states is inhibited by high pillar density, where pillars act as obstacles for cell motion. In a gradient spatial density, these mechanisms lead to topographic guidance of cells, with a general trend towards a regime of inter-pillar spacing close to the cell diameter. In locally anisotropic pillar environments, cell migration is often found to be damped due to competing attraction by different pillars in close proximity and due to lack of other potential stimuli in the vicinity of the cell. Further, we demonstrate topographic cell guidance reflecting the lattice geometry of the quasi-3D environment by distinct preferences in migration direction. We further investigate amoeboid single-cell migration on intrinsically nano-structured, biodegradable silica fibers in comparison to chemically equivalent plain glass surfaces. Cell migration trajectories are classified into directed runs and quasi-random migration by a local mean squared displacement (LMSD) analysis. We find that directed movement on silica fibers is enhanced in a significant manner by the fibers' nanoscale surface-patterns. Further, cell adhesion on the silica fibers is a microtubule-mediated process. Cells lacking microtubules detach from the fibers, but adhere well to glass surfaces. Knock-out mutants of myosin II migrating on the fibers are as active as cells with active myosin II, while the migration of the knock-out mutants is hindered on plain glass. We investigate the influence of the intrinsically nano-patterned surface of nanoporous glass membranes on the behavior of mammalian cells. Three different cell lines and primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) proliferate readily on nanoporous glass membranes with mean pore sizes between 10 nm and 124 nm. In both proliferation and mRNA expression experiments, L929 fibroblasts show a distinct trend towards mean pore sizes > 80 nm. For primary hMSCs, excellent proliferation is observed on all nanoporous surfaces. hMSC on samples with 17 nm pore size display increased expression of COL10, COL2A1 and SOX9, especially during the first two weeks of culture. In upside down culture, SK MEL-28 cells on nanoporous glass resist the gravitational force and proliferate well in contrast to cells on flat references. The effect of paclitaxel treatment of MDA MB 321 breast cancer cells is already visible after 48 h on nanoporous membranes and strongly pronounced in comparison to reference samples. The studies presented in this work showed novel and distinct effects of micro- and nanoscale topographies on the behavior of various types of living cells. These examples display how versatile the potential for applications of bioactive materials could become in the next years and decades. And yet this variety of different alterations of cell functions due to topographic cues also shows the crucial part of this field of research: Carving out distinct, robust correlations of external cues and cell behavior is of utmost importance to derive definitive design implications that can lead to scientifically, clinically and commercially successful products. / Die Erforschung neuartiger bioaktiver Materialien zur Beeinflussung des Verhaltens lebender Zellen ist ein wichtiges Thema für die biomedizinische Forschung und das Tissue Engineering. Biomaterialien oder Oberflächenstrukturen, die spezifische Zellfunktionen fördern, können innovative neue Produkte in der Zellkultur und Diagnostik ermöglichen. Ziel dieser Studie ist es, die Interaktion von lebenden Zellen mit mikrostrukturierten, nanostrukturierten und nanoporösen Materialoberflächen zu untersuchen, um unterschiedliche Systematiken im Zusammenspiel von Zellen und Materialien zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Studien durchgeführt, die individuelle Effekte auf unterschiedliche Zellfunktionen ergaben. Im ersten Teil dieser Arbeit werden systematisch kontrollierte Assays aufgebaut, die die Auswirkungen der Dichte und Geometrie topografischer Stimuli im Mikrometerbereich auf die amöboide Migration von Dictyostelium discoideum-Zellen untersuchen - in Quasi-3D-Säulenfeldern mit systematischer Variation des Abstands zwischen den Säulen und der Gittergeometrie der Säulen. Wir konnten Motilitätsparameter extrahieren und damit die amöboiden Migrationsmechanismen in einem kontaktgesteuerten Motilitätsmodell mit zwei Zuständen beschreiben, das zwischen gerichteten und ungerichteten (zufälligen) Migrationsphasen unterscheidet. Es konnte gezeigt werden, dass gerichtete Bewegungen von Säule zu Säule vorzugsweise in Regionen mit hoher Säulendichte zu finden sind und Zellen in gerichteten Bewegungszuständen Säulen als attraktive topographische Stimuli wahrnehmen. Im Gegensatz dazu wird die Zellbewegung in ungerichteten Migrationsphasen durch eine hohe Säulendichte gehemmt, da Säulen als Hindernisse für die Zellbewegung wirken. In Säulenfelder mit Dichtegradienten führen diese Mechanismen zu einer topografischen Führung der Zellen, mit einer allgemeinen Tendenz zu einem Regime von Säulenabständen nahe dem Zelldurchmesser. In lokal anisotropen Säulenumgebungen wird die Zellmigration häufig durch konkurrierende Anziehungskräfte verschiedener Säulen in unmittelbarer Nähe und durch das Fehlen anderer potenzieller Stimuli in der Nähe der Zelle gedämpft. In Teil zwei der Arbeit wurde die amöboide Einzelzellmigration auf intrinsisch nanostrukturierten, biologisch abbaubaren Siliziumdioxidfasern im Vergleich zu chemisch äquivalenten glatten Glasoberflächen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die gerichtete Bewegung auf Siliziumdioxid-Fasern durch die nanoskalige Oberflächenstruktur der Fasern deutlich verstärkt wird. Außerdem ist die Zelladhäsion auf den Siliziumdioxidfasern ein durch Mikrotubuli vermittelter Prozess - Zellen, denen Mikrotubuli fehlen, lösen sich von den Fasern ab, haften aber gut an den Glasoberflächen. Knock-out-Mutanten von Myosin II sind auf den Faseroberflächen genauso aktiv wie Zellen mit aktivem Myosin II, während die Migration der Knock-out-Mutanten auf normalem Glas behindert wird. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss der intrinsisch nanostrukturierten Oberfläche von nanoporösen Glasmembranen auf das Verhalten von Säugetierzellen. Drei verschiedene Zelllinien und primäre humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) vermehren sich gut auf nanoporösen Glasmembranen mit mittleren Porengrößen zwischen 10 nm und 124 nm. Sowohl in Proliferations- als auch in mRNA-Expressionsversuchen zeigen L929-Fibroblasten einen deutlichen Trend zu mittleren Porengrößen > 80 nm. Bei primären hMSC wird auf allen nanoporösen Oberflächen eine ausgezeichnete Proliferation beobachtet. hMSC auf Proben mit 17 nm Porengröße zeigen eine erhöhte Expression von COL10, COL2A1 und SOX9, insbesondere während der ersten zwei Wochen der Kultur. In der Upside-Down-Kultur widerstehen SK MEL-28-Zellen auf nanoporösem Glas der Schwerkraft und vermehren sich im Gegensatz zu Zellen auf flachen Referenz-Oberflächen gut. Die Wirkung der Paclitaxel-Behandlung von MDA MB 321 Brustkrebszellen ist bereits nach 48 Stunden auf nanoporösen Membranen sichtbar und im Vergleich zu Referenzproben stark ausgeprägt. Die in dieser Arbeit vorgestellten Studien zeigen neuartige und sehr unterschiedliche Auswirkungen von mikro- und nanoskaligen Topographien auf das Verhalten verschiedener Arten von lebenden Zellen. Diese Beispiele zeigen, wie vielfältig das Anwendungspotenzial bioaktiver Materialien in den nächsten Jahren und Jahrzehnten sein könnte. Die Vielfalt der unterschiedlichen Veränderungen von Zellfunktionen durch topographische Einflüsse zeigt aber auch, wie essentiell Grundlagenforschung in diesem Bereich ist: Es ist von größter Wichtigkeit, eindeutige, robuste Zusammenhänge zwischen externen Stimuli und dem Verhalten von Zellen zu identifizieren, um wissenschaftlich, klinisch und kommerziell erfolgreiche Produkte zu entwickeln.

This thesis deals with the isolation and structural elucidation of bioactive naphthylisoquinoline alkaloids and related analogs. The mode of action of the antiplasmodial activity exhibited by the naphthylisoquinoline alkaloids was explored and compared to that of the antimalarial drug chloroquine. Furthermore, the phase 1 and 2 metabolism of dioncophyllines A and C and dioncopeltine A were investigated. In detail the following results have been obtained: • From the leaves of the recently discovered East African liana A. tanzaniensis six naphthylisoquinoline alkaloids were isolated. • The leaves of a botanical yet undescribed Ancistrocladus species, collected by Prof. Dr. V. Mudogo in the Democratic Republic of Congo in the habitat Yeteto near the town Ikela, were analyzed for naphthylisoquinoline alkaloids for the first time. The isolation work led to the first identification of an N,C-coupled naphthyldihydroisoquinoline alkaloid; ancistrocladinium B. Phytochemical investigation of the roots of the Congolese Ancistrocladus species (habitat Yeteto), , afforded five new derivatives of known naphthylisoquinoline alkaloids, namely 5'-O-demethylhamatine, 5'-O-demethylhamatinine, 6-O-demethylancistroealaine A, 6,5'-O,O-didemethylancistroealaine A, and 5-epi-6-O-methylancistrobertsonine A, along with six known naphthylisoquinoline alkaloids. • The antiplasmodial activity guided purification of 60Co irradiated samples containing commercially available naphthylisoquinoline related substances, afforded the isolation of the irradiation products 3,4-dihydro-1-isoquinolinone, 3,4-dihydro-1-isoquinolineamine, and 1,2,3,4-tetrahydro-1,2-diazirino-isoquinoline. The compounds were found to be more active than the starting material, although only exhibiting weak antiplasmodial activity against P. falciparum. • The effect on the absorption spectrum of FPIX due to complex formation with the naphthylisoquinoline alkaloids dioncophyllines A and C, dioncopeltine A korupensamine A, and ancistrocladine was examined by a titration study. Job's plot analyses by UV-spectroscopy determined the stoichiometry for the complex formation of FPIX and naphthylisoquinoline alkaloids to be 2:1. Furthermore, the dissociation constants for the complexation with FPIX were determined for each of the naphthylisoquinoline alkaloids investigated. Dioncophylline C and dioncopeltine A were found to possess dissociation constants, which are comparable to the one reported for the antimalarial drug chloroquine. The ability of ESI to transfer noncovalent solution-phase assemblies intact into the gas phase, was conducted on solution mixtures of naphthylisoquinoline alkaloid and FPIX, as well as on mixtures of chloroquine and FPIX. The mass spectrometry analyses revealed several peaks, which corresponded to the complex formation of FPIX to the respective ligands investigated. The most interesting results obtained were the detection of peaks corresponding to the complex formation between a chelated dimer of FPIX and dioncophylline Cand of peaks corresponding to a double protonated tetramer of FPIX – consisting of two chelated -oxo dimers of FPIX – in complex formation with two molecules of chloroquine. • Two phase 1 metabolism products of dioncophylline A were identified. Coelution in combination with HPLC-MS/MS, NMR, and CD investigations assigned the major metabolic product as 5'-O-demethyldioncophylline A. The minor metabolic product was only present in small amounts, which disabled an unambiguous structural characterization of the compound. However, as deduced from the mass spectrometry analyses and exclusion of a possible metabolic oxidation product by coelution with authentic reference material, the metabolite should possess a 4-hydroxylated isoquinoline portion and is assumed to be represented by structure. Dioncophylline C and dioncopeltine A were found to be stable to phase 1 metabolism reactions caused by rat liver microsomes. / • Aus Blättern der ostafrikanischen Lianenart Ancistrocladus tanzaniensis wurden sechs Naphthylischinolin-Alkaloide isoliert, darunter Ancistrotectorilin die bereits aus A. tectorius isoliert wurde. Von einer botanisch bisher unbeschriebenen Ancistrocladus Art, gesammelt von Prof. Dr. V. Mudogo in der Demokratischen Republik Kongo bei Yeteto, in der Nähe der Stadt Ikela, wurden die Blätter i auf ihren Inhalt an Naphthylischinolin-Alkloiden phytochemisch untersucht. Dabei konnte das erste N,C gekuppelte Naphthyldihydroisochinolin-Alkaloid, Ancistrocladinium B. • Die phytochemische Untersuchung der Wurzeln der Kongolesischen Ancistrocladus Art (Fundort Yeteto) wurde ausgeführt und ergab die Isolierung von fünf unbekannten Derivaten bereits bekannter Naphthylisochinolin-Alkaloide: 5'-O-Demethylhamatin , 5'-O-Demethylhamatinin, 6-O-Demethylancistroealain A, 6,5'-O,O-Didemethylancistroealain A und 5-epi-6-O-Methylancistrobertsonine A. Parallel dazu wurden sechs bereits bekannte Naphthylisochinolin-Alkaloide identifiziert. Die bioaktivitätsgeleitete Reinigung antiplasmodialer 60Co bestrahlter Proben –kommerziel verfügbarer Naphthylisochinolin abgeleiteter Substanzen – führte zur Isolierung verschiedener Bestrahlungs-Produkte, nämlich 3,4-Dihydro-1-Isochinolinon, 3,4-Dihydro-1-isochinolineamin, und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,2-Diazirino-Isochinolin. Die isolierten Substanzen waren jeweils aktiver als die Edukte, zeigten aber trotzdem nur antiplasmodiale Wirksamkeit im mittleren Berreich. • Die Auswirkung der Komplexbildung unterschiedlicher Naphthylisochinolin-Alkloide – Dioncophylline A und C, Dioncopeltin A, Korupensamin A, und Ancistrocladin – auf das Absorptions-Spektrum von FPIX wurde mittels eines Titrationsexperimentes, unter Anwendung von UV Spektroskopie, untersucht. Durch Job's Plot Analysen konnte so die Stöchiometrie der Komplex-Bildung zwischen FPIX und Naphthylisochinolin-Alkaloide zu 2:1 bestimmt werden. Weiterhin konnten die einzelnen Dissoziationskonstanten für die Komplexierung von FPIX mit den untersuchten Naphthylisochinolin-Alkaloiden errechnet werden. Die für Dioncophyllin C und Dioncopeltin A bestimmten Dissoziationskonstanten sind mit der in der Literatur für das antimalariale Arzneitmittel Chloroquine vergleichbar. Die Möglichkeit durch ESI nicht kovalent gelöste Komponenten intakt in die Gas-Phase zu transferieren, wurden auf Lösungs-Gemische von Naphthylischinolin-Alkaloiden und FPIX sowie auf Lösungs-Gemische von Chloroquine und FPIX angewandt. Die massenspektroskopischen Analysen ergaben mehrere Peaks, die der Komplex-Bildung von FPIX mit den einzeln untersuchten Liganden entsprachen. Die interessantesten Ergebnisse waren dabei die Entdeckung von Peaks, die die Komplex-Bildung zwischen einem chelatisierten Dimer von FPIX mit Dioncophyllin C, sowie zwischen einem doppelt protonierten Tetramer von FPIX – bestehend aus zwei chelatisierten -oxo Dimeren von FPIX – mit zwei Molkülen Chloroquine entsprachen. Zwei Phase 1 Metabolite von Dioncophyllin A konnten in Kooperation mit M. Sieber identifiziert werden. Die Struktur des Haupt-Metabolismus-Produktes konnte durch Koelution, HPLC-MS/MS, NMR und CD Untersuchungen als 5'-O-demethyldioncophyllin A bestätigt werden.