The honeybee is a well studied and important organism in neuroethology. The possibility to train them with a classical conditioning paradigm and their miniature brain provide a perfect requisite to investigate the neuronal principles of learning and memory. Honeybees use visual and olfactory cues to detect flowers during their foraging trips. Hence, the reward association of a nectar source is a multi-modal construct, which has at least two major components - olfactory and visual cues. It is still an open question, how both sensory components are converged in the mushroom body, which represent the multi-modal integration centre of the honeybee brain. The main goal of this study, is to investigate the processing of multiple modalities and how a reward association is formed. This includes, how and wether both sensory modalities interfere during learning. Thus, in this study stimulation with UV, blue and green light was used to evoke distinct photoreceptor activities in the compound eye. Furthermore, three different odours (Geraniol, Citronellol and Farnesol) were used. These stimuli were tested in three different experimental series. The first experiment involved classical differential conditioning of the single modalities - odour and colour. Honeybees showed high learning performances in differentiating olfactory stimuli and also reliable responses for visual conditioning. Furthermore, a temporal discrepancy in the stimulus length for best learning in the olfatcoty and visual cues was found. In the second series, it was tested how multi-modal compounds are perceived. This includes, unique cues (configural processing) or the sum of the single components of a compound (elemen- tal processing). This was tested by combining single odour components with monochromatic light in a positive (PP) and negative patterning (NP) experiment. During PP, the olfactory- visual compound was rewarded, whereas the single components were unrewarded. In contrast, during NP the single components were reinforced, but the compound was not. In addition, the ability to distinguish between two different light stimuli presented as a part of an olfactory-visual compound with the same odour component during acquisition was tested. In a memory test, the light stimuli were presented again as a compound and in addition as the single components. The results revealed that bees used elemental processing with compounds containing green and blue light. In contrast, when UV light was presented the bees used configural processing. Finally, a third experiment was conducted at the neuronal level. Multi-unit recordings were established to provide a suitable method to analyse extrinsic neurons at the mushroom body output region, the so called ventral lobe of the pedunculus. Here, three different odours (Geran- iol, Farnesol and Citronellol), two colours (green and blue) and two combined stimuli (colour + odour) were chosen as stimuli, to search for possible variations in processing stimuli with different modalities. Two units could be detected that responded mainly to visual stimuli. / Die Honigbiene ist ein gut untersuchter und wichtiger Organismus für die neuroethologische Forschung. Die Möglichkeit sie auf klassische Weise zu Konditionieren und ihr relativ kleines Gehirn macht sie zum idealen Untersuchungs-Gegenstand um die neuronalen Prinzipien des Lernens und der Gedächtnisbildung zu erforschen. Während des Furagierens nutzen Honigbi- enen beides: visuelle und olfaktorische Merkmale der Futterplanzen. Daher ist die Belohnungs- Assoziation mit der Nektar-Belohnung ein multi-modales Konstrukt, welches aus mindestens zwei Hauptkomponenten, den olfaktorischen und den visuellen Reizen, besteht. In dieser Arbeit soll untersucht werden, wie olfaktorische und visuelle Reize verarbeitet wer- den und wie sie im Pilzkörper, dem multi-modalen Integrationszentrum des Bienengehirnes, konvergieren. Wie beide sensorischen Modalitäten integriert werden um eine gemeingültige Belohnungs-Assoziation zu bilden, ist immer noch eine offene Frage. Weiterhin ist unklar ob und wie sie miteinander interferieren. Die hier dargestellten Studien nutzen Stimulationen mit UV, blauem und grünem Licht um unterschiedliche Photorezeptor Aktivitäten im Komplexauge auszulösen. Des Weiteren wurden drei verschiedene Duftkomponenten (Geraniol, Citronellol und Farnesol) verwendet. Diese Stimuli wurden in drei verschiedenen Experiment-Reihen gestestet. Das erste Experiment umfasste die klassische differentielle Konditionierung der Einzelmodalitäten (Duft und Farbe). Honigbienen zeigten eine hohe Lernfähigkeit bei der Unterscheidung zweier olfaktorischer Reize sowie eine solide Lern-Leistung während der Konditionierung mit Licht. Im zweiten Experiment wurde getestet, ob ein zusammengesetzter Reiz aus beiden Modalitäten als Summe der einzelnen Elemente (elementare Verarbeitung) oder als unikaler Reiz (konfigu- rale Verarbeitung) wahrgenommen wird. Hierbei wurde monochromatisches Licht und einzelne Duftkomponenten in positive patterning- (PP) und negative patterning-Experimenten (NP) getestet. Beim PP, wurde der zusammengesetzte Reiz belohnt, wohingegen die Einzelkom- ponenten unbelohnt blieben. Dagegen wurden beim NP nur die Einzelkomponenten belohnt, aber nicht ihre Kombination. Außerdem wurde der Frage nachgegangen, ob die Fähigkeit zur Differenzierung unterschiedlich ist, wenn zwei verschiedene Lichtreize teil einer olfaktorisch- visuellen Kombination sind, oder nicht. Interessanterweise zeigten die Verhaltensleistungen einen prominenten Fall von konfiguraler Verarbeitung, allerdings nur wenn UV-Licht ein El- ement der olfaktorisch-visuellen Zusammensetzung war. Die Ergebnisse der Experimente mit blauem oder grünem Licht hingegen, unterstützen die Theorie einer elementaren Verarbeitung. Abschließend wurde mittels elektrophysiologischer multi-unit-Aufnahmen eine passende Meth- ode etabliert, um die extrinsischen Neurone des Pilzkörpersausganges zu analysieren. Hierbei wurden drei verschiedene Düfte und zwei Farben sowie zwei Kombinationen aus Farbe und Duft getestet, um mögliche Variationen der multimodalen Reiz-Verarbeitung zu untersuchen. Zwei neuronale Einheiten (units) wurden gefunden, welche hauptsächlich auf Lichtreize antworteten.

Bacterial small RNAs are key mediators of post-transcriptional gene regulation. An increasing number of sRNAs have been implicated in the regulation of virulence programs of pathogenic bacteria. Recently, in the enteric pathogen Salmonella Typhimurium, the PinT sRNA has gained increased importance as it is the most upregulated sRNA as Salmonella infects mammalian host cells (Westermann et al., 2016). PinT acts as a temporal regulator of Salmonella‘s two major pathogenicity islands, SPI-1 and SPI-2 (Kim et al., 2019; Westermann et al., 2016). However, the complete set of PinT targets, its role in Salmonella infection and host response is not yet fully understood. Building on the MS2 affinity purification and RNA- seq (MAPS) method (Lalaouna et al., 2015), we here set out to globally identify direct RNA ligands of PinT, relevant to Salmonella infection. We transferred the classical MAPS technique, based on sRNA-bait overexpression, to more physiological conditions, using endogenous levels of the sRNA. Making the henceforth identified targets, less likely to represent artefacts of the overexpression. More importantly, we progressed the MAPS technique to in vivo settings and by doing so, we were able pull-down bacterial RNA transcripts bound by PinT during macrophage infection. While we validate previously known PinT targets, our integrated data revealed novel virulence relevant target. These included mRNAs for the SPI-2 effector SteC, the PhoQ activator UgtL and the 30S ribosomal protein S22 RpsV. Next, we follow up on SteC, the best characterized virulence relevant PinT target. Using genetic and biochemical assays, we demonstrate that PinT represses steC mRNA by direct base-pairing and translational interference. PinT-mediated regulation of SteC leads to alterations in the host response to Salmonella infection. This regulation impacts the cytokine response of infected macrophages, by altering IL10 production, and possibly driving the macrophages to an anti-inflammatory state, more permise to infection. SteC is responsible for F-actin meshwork rearrangements around the SCV (Poh et al., 2008). Here we demonstrate that PinT-mediated regulation of SteC, impacts the formation of this actin meshwork in infected cells. Our results demonstrate that SteC expression is very tightly regulated by PinT in two layers; indirectly, by repressing ssrB and crp; and directly by binding to steC 5’UTR. PinT contributes to post-transcriptional cross-talk between invasion and intracellular replication programs of Salmonella, by controlling the expression of both SPI-1 and SPI-2 genes (directly and indirectly). Together, our collective data makes PinT the first sRNA in Gram-negatives with a pervasive role in virulence, at the center of Salmonella virulence programs and provide molecular input that could help explain the attenuation of pinT-deficient Salmonella strains in whole animal models of infection. / Kleine RNAs sind zentrale Stellschrauben der posttranskriptionellen Genregulation in Bakterien. Eine zunehmende Anzahl von sRNAs ist an der Regulation von Virulenzprogrammen pathogener Bakterien beteiligt. In jüngster Zeit hat beim enterischen Erreger Salmonella Typhimurium die PinT-sRNA an Bedeutung gewonnen, da sie die am stärksten hochregulierte sRNA während der Infektion von Säugetierwirtszellen ist (Westermann et al., 2016). PinT fungiert als zeitlicher Regulator der beiden wichtigsten Pathogenitätsinseln von Salmonella, SPI-1 und SPI-2 (Kim et al., 2019a; Westermann et al., 2016). Die vollständige Liste der Targets von PinT und die Rolle von PinT bei der Salmonella-Infektion sowie der Wirstantwort sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Mit Hilfe der MS2 affinity purification and RNA-seq (MAPS)-Methode (Lalaouna et al., 2015) möchten wir hier direkte RNA-Liganden von PinT identifizieren, die für die Salmonella-Infektion relevant sind. Wir übertragen die klassische MAPS-Technik, die auf der Überexpression von sRNA-Baits basiert, auf physiologischere Bedingungen unter Verwendung endogener Mengen der sRNA. Dadurch wird die Wahrschienlichkeit, dass die identifizierten Targets Artefakte sind, verringert. Darüber hinaus sind wir in der Lage, die MAPS-Technik unter in vivo-Bedingungen durchzuführen. Auf diese Weise konnten wie bakterielle Transkripte, die während einer Makrophageninfektion an PinT gebunden wurden, isolieren. Während wir bereits bekannte PinT-Ziele validieren, identifizieren unsere integrierten Daten ein neues Target, das für Virulenz relevant ist. Dazu gehörten mRNAs für den SPI-2-Effektor SteC, den PhoQ-Aktivator UgtL und das ribosomale 30S-Protein S22 RpsV. Zunächst untersuchen wir SteC, das am besten charakterisierte virulenzrelevante PinT-Ziel. Anhand genetischer und biochemischer Assays zeigen wir, dass PinT die steC-mRNA durch direkte Basenpaarung und Translationsrepression reguliert. Die PinT-vermittelte Regulation von SteC führt zu einer veränderten Wirtsreaktion auf eine Salmonella-Infektion. Diese Regulation beeinflusst die Zytokinreaktion infizierter Makrophagen, indem sie die IL10-Produktion verändert und die Makrophagen möglicherweise in einen entzündungshemmenden Zustand versetzt, der sie anfälliger für eine Infektion macht. SteC ist verantwortlich für die Umlagerung von F-Actin-Netzen um die SCV (Poh et al., 2008). Hier zeigen wir, dass die PinT-vermittelte Regulation von SteC die Bildung dieses Aktin-Netzwerks in infizierten Zellen beeinflusst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Regulation der SteC-Expression durch PinT auf zwei Ebenden stattfindet: indirekt durch Unterdrückung von ssrB und crp; und direkt durch Bindung an steC 5’UTR. PinT trägt zum posttranskriptionellen Crosstalk zwischen Invasions- und intrazellulären Replikationsprogrammen von Salmonella bei, indem die Expression von SPI-1- und SPI-2-Genen (direkt und indirekt) gesteuert wird. Insgesamt macht unterstreichen unsere Daten die zentrale Rolle von PinT in Virulenzprogrammen von Salmonella. PinT ist die erste sRNA in Gram-Negativen mit einer derart durchdringenden Rolle bei der Virulenz. Zudem liefern unsere Ergebnisse Einblick auf molekularer Ebene, die die Attenuation von PinT-defizienten Salmonella-Stämmen in Tiermodellen erklären könnte.

Optogenetics became successful in neuroscience with Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, as an easy applicable tool. The success of ChR2 inspired the development of various photosensory proteins as powerful actuators for optogenetic manipulation of biological activity. However, the current optogenetic toolbox is still not perfect and further improvements are desirable. In my thesis, I engineered and characterized several different optogenetic tools with new features. (i) Although ChR2 is the most often used optogenetic actuator, its single-channel conductance and its Ca2+ permeability are relatively low. ChR2 variants with increased Ca2+ conductance were described recently but a further increase seemed possible. In addition, the H+ conductance of ChR2 may lead to cellular acidification and unintended pH-related side effects upon prolonged illumination. Through rational design, I developed several improved ChR2 variants with larger photocurrent, higher cation selectivity, and lower H+ conductance. (ii) The light-activated inward chloride pump NpHR is a widely used optogenetic tool for neural silencing. However, pronounced inactivation upon long time illumination constrains its application for long-lasting neural inhibition. I found that the deprotonation of the Schiff base underlies the inactivation of NpHR. Through systematically exploring optimized illumination schemes, I found illumination with blue light alone could profoundly increase the temporal stability of the NpHR-mediated photocurrent. A combination of green and violet light eliminates the inactivation effect, similar to blue light, but leading to a higher photocurrent and therefore better light-induced inhibition. (iii) Photoactivated adenylyl cyclases (PACs) were shown to be useful for light-manipulation of cellular cAMP levels. I developed a convenient in-vitro assay for soluble PACs that allows their reliable characterization. Comparison of different PACs revealed that bPAC from Beggiatoa is the best optogenetic tool for cAMP manipulation, due to its high efficiency and small size. However, a residual activity of bPAC in the dark is unwanted and the cytosolic localization prevents subcellular precise cAMP manipulation. I therefore introduced point mutations into bPAC to reduce its dark activity. Interestingly, I found that membrane targeting of bPAC with different linkers can remarkably alter its activity, in addition to its localization. Taken together, a set of PACs with different activity and subcellular localization were engineered for selection based on the intended usage. The membrane-bound PM-bPAC 2.0 with reduced dark activity is well-tolerated by hippocampal neurons and reliably evokes a transient photocurrent, when co-expression with a CNG channel. (iv) Bidirectional manipulation of cell activity with light of different wavelengths is of great importance in dissecting neural networks in the brain. Selection of optimal tool pairs is the first and most important step for dual-color optogenetics. Through N- and C-terminal modifications, an improved ChR variant (i.e. vf-Chrimson 2.0) was engineered and selected as the red light-controlled actuator for excitation. Detailed comparison of three two-component potassium channels, composed of bPAC and the cAMP-activated potassium channel SthK, revealed the superior properties of SthK-bP. Combining vf-Chrimson 2.0 and improved SthK-bP “SthK(TV418)-bP” could reliably induce depolarization by red light and hyperpolarization by blue light. A residual tiny crosstalk between vf-Chrimson 2.0 and SthK(TV418)-bP, when applying blue light, can be minimized to a negligible level by applying light pulses or simply lowering the blue light intensity. / Die Optogenetik wurde in den Neurowissenschaften mit Channelrhodopsin-2 (ChR2), einem lichtgesteuerten Kationenkanal aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, als leicht anwendbares Werkzeug erfolgreich. Der Erfolg von ChR2 inspirierte die Entwicklung verschiedener photosensorischer Proteine als leistungsstarke Aktuatoren für die optogenetische Manipulation der biologischen Aktivität. Die derzeitige optogenetische Toolbox ist jedoch immer noch nicht perfekt und weitere Verbesserungen sind wünschenswert. In meiner Arbeit habe ich verschiedene optogenetische Werkzeuge mit neuen Funktionen entwickelt und charakterisiert. (i) Obwohl ChR2 der am häufigsten verwendete optogenetische Aktuator ist, sind seine Einzelkanal-Leitfähigkeit und seine Ca2 + -Permeabilität relativ gering. Kürzlich wurden ChR2-Varianten mit erhöhter Ca2 + -Leitfähigkeit beschrieben, eine weitere Verbesserung schien jedoch möglich. Darüber hinaus kann die H+-Leitfähigkeit von ChR2 bei längerer Beleuchtung zu einer Ansäuerung der Zellen und zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen im Zusammenhang mit dem pH-Wert führen. Durch rationales Design entwickelte ich mehrere verbesserte ChR2-Varianten mit größerem Photostrom, höherer Kationenselektivität und geringerer H+-Leitfähigkeit. (ii) Die lichtaktivierte Chloridpumpe NpHR ist ein weit verbreitetes optogenetisches Werkzeug für die neuronale Inhibierung. Eine ausgeprägte Inaktivierung bei längerer Beleuchtung schränkt jedoch die Anwendung für eine lang anhaltende neuronale Hemmung ein. Ich konnte zeigen, dass die Deprotonierung der Schiffschen Base der Inaktivierung von NpHR zugrunde liegt. Durch die systematische Untersuchung optimierter Beleuchtungsschemata fand ich heraus, dass die Beleuchtung mit blauem Licht allein die zeitliche Stabilität des NpHR-vermittelten Photostroms erheblich verbessern kann. Eine Kombination aus grünem und violettem Licht eliminiert den Inaktivierungseffekt, ähnlich wie blaues Licht, führt jedoch zu einem höheren Photostrom und deswegen effektiverer Licht-induzierter Inhibierung. (iii) Photoaktivierte Adenylylcyclasen (PACs) erwiesen sich als nützlich für die Lichtmanipulation der zellulären cAMP-Spiegel. Ich habe einen praktischen in-vitro-Test für lösliche PACs entwickelt, der deren zuverlässige Charakterisierung ermöglicht. Ein Vergleich verschiedener PACs ergab, dass bPAC von Beggiatoa aufgrund seiner hohen Effizienz und geringen Größe das beste optogenetische Werkzeug für die cAMP-Manipulation ist. Eine Restaktivität von bPAC im Dunkeln ist jedoch unerwünscht und die cytosolische Lokalisierung verhindert eine subzellulär präzise cAMP-Manipulation. Ich habe daher Punktmutationen in bPAC eingeführt, um dessen Dunkelaktivität zu reduzieren. Interessanterweise fanden Ich heraus, dass das Membrantargeting von bPAC mit verschiedenen „Linkern“ zusätzlich zu seiner Lokalisierung seine Aktivität erheblich verändern kann. Zusammengenommen wurde eine Reihe von PACs mit unterschiedlicher Aktivität und subzellulärer Lokalisation für unterschiedliche Anwendungen konstruiert. Das membrangebundene PM-bPAC 2.0 mit reduzierter Dunkelaktivität wird von Hippocampus-Neuronen gut vertragen und erlaubt, bei gleichzeitiger Expression mit einem CNG-Kanal, zuverlässig einen Licht-induzierten Strom auszulösen. (iv) Die bidirektionale Manipulation der Zellaktivität mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge ist für die Dissektion neuronaler Netze im Gehirn von großer Bedeutung. Die Auswahl der optimalen Werkzeugpaare ist der erste und wichtigste Schritt für die zweifarbige Optogenetik. Durch N- und C-terminale Modifikationen wurde eine verbesserte ChR-Variante (d. h. Vf-Chrimson 2.0) entwickelt und als Rotlicht-gesteuerter Aktuator zur Anregung ausgewählt. Ein detaillierter Vergleich von drei Zweikomponenten-Kaliumkanälen, bestehend aus bPAC und dem cAMP-aktivierten Kaliumkanal SthK, ergab die überlegenen Eigenschaften von SthK-bP. Die Kombination von vf-Chrimson 2.0 und verbessertem SthK-bP „SthK(TV418)-bP“ konnte zuverlässig eine Depolarisation durch rotes Licht und eine Hyperpolarisation durch blaues Licht induzieren. Ein restliches, kleines Übersprechen zwischen vf-Chrimson 2.0 und SthK(TV418)-bP kann beim Anlegen von blauem Licht durch Anlegen von Lichtimpulsen oder durch einfaches Verringern der Intensität von blauem Licht auf ein vernachlässigbares Maß minimiert werden.

Bone marrow dosimetry is a topic of high interest in molecular radiotherapy. Predicting the level of hematological toxicity is one of the most important goals of nuclear medicine radiation dosimetry. To achieve this, it is necessary to quantify the absorbed dose to the active bone marrow, thus aiming at administering the most efficient therapy with a minimum level of adverse effects in the patient. The anatomical complexity of trabecular bone and bone marrow leads to the need of applying non-nuclear medicine imaging methods for determining the spatial distribution of soft tissue, adipose tissue, and bone in spongiosa. Therefore, the two objectives of this dissertation are: i) to apply magnetic resonance imaging (MRI) for quantification of the fat volume fraction, and ii) to validate a method based on dual-energy quantitative computed tomography (DEQCT) for quantification of the trabecular bone volume fraction. In a first step, an MRI sequence (two-point Dixon) for fat-water separation was validated in a 3 Tesla system by quantifying the fat volume fraction in a phantom and the lumbar vertebrae of volunteers and comparing with magnetic resonance spectroscopy (MRS). After successful validation, the fat volume fraction was retrospectively measured in the five lumbar vertebrae of 44 patient images acquired in the clinical routine. The two-point Dixon showed a good quantification of the fat volume fraction in the phantom experiment (-9.8% maximum relative error with respect to the nominal values). In the volunteers, a non-significant difference between MRI and MRS was found for the quantification of the fat volume fraction in volumes-of-interest with similar dimensions and position in both quantification methodologies (MRI and MRS). In the study with patient data, the marrow conversion (red → yellow marrow) was found to be age-dependent, and slower in males (0.3% per year) than in females (0.5% per year). Also, considerable variability of the fat volume fraction in patients of similar ages and the same gender was observed. These results enable the use of two-point Dixon MRI in the quantification of the fat volume fraction in the bone marrow. Additionally, the constant marrow conversion during adulthood suggests that a patient-specific approach should replace the assumption of a constant cellularity volume fraction of 0.7 (reference man) (1,2) as proposed by the International Commission on Radiological Protection (ICRP). In a second step, a quantification method based on DEQCT was validated in two CT systems: i) a clinical CT integrated into a SPECT/CT and ii) a dual-source computed tomography (DSCT) system. The method was applied in two phantoms: the first was used to validate the DEQCT method by the quantification of the hydroxyapatite volume fraction in three vials of 50 ml each and three different hydroxyapatite concentrations (100 mg/cm3, 200 mg/cm3, 300 mg/cm3). The second phantom was the European spine phantom (ESP), an anthropomorphic spine phantom. It was used to quantify the bone mineral content (BMC) on the whole vertebra and the hydroxyapatite volume fraction (VFHA) in the spongiosa region of each vertebra of the phantom. Lastly, the BMC of lumbar vertebrae 1 (LV1) and 2 (LV2) was measured in a patient using DEQCT and dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA). Furthermore, the hydroxyapatite volume fraction (VFHA) and the bone volume fraction (VFB) was calculated for both the whole vertebrae and the spongiosa region of LV1 and LV2. The measured and nominal hydroxyapatite volume fraction in the vial phantom showed a good correlation (maximum relative error: 14.2%). The quantification of the BMC on the whole vertebra and the VFHA on the spongiosa region showed larger relative errors than in the validation phantom. The quantification of BMC on LV1 and LV2 showed relative errors between DEXA and DSCT equal to 7.6% (LV1) and -8.4% (LV2). Also, the values of the VFHA (mineral bone) were smaller than the VFB. This result is consistent with the bone composition (mineral bone plus organic material). The DEQCT method enables the quantification of hydroxyapatite (mineral bone) and bone (mineral bone plus organic material) in a clinical setting. However, the method showed an overestimation of the quantified mineral bone volume fraction. This overestimation might be related to the lack of detailed information on the CT X-ray spectra and detector sensitivity. Also, the DEQCT method showed a dependency on the CT reconstruction kernel and the chemical description of the materials to be quantified. Based on the results of this work, the feasibility for quantifying the fat volume fraction and the bone volume fraction in the spongiosa in a clinical setting has been demonstrated/proven. Furthermore, the differences in fat volume fraction in females and males, as well as the variability of the fat volume fraction in subjects of similar ages, questions the approximation of the cellularity volume fraction by only a single ICRP reference value in bone marrow dosimetry for molecular radiotherapy. Lastly, this study presents the first approach for non-invasive quantification of the bone volume fraction (mineral bone plus organic material) for improved bone marrow dosimetry. / Die Knochenmarkdosimetrie ist von großem Interesse für die Radionuklidtherapie. Die Vorhersage des Grades der hämatologischen Toxizität ist eines der wichtigsten Ziele der nuklearmedizinischen Dosimetrie. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es erforderlich, die Energiedosis des aktiven Knochenmarks zu quantifizieren, um dem Patienten so eine möglichst effiziente Therapie mit einem minimalen Maß an unerwünschten Nebenwirkungen verabreichen zu können. Die anatomische Komplexität von Knochentrabekel und Knochenmark macht es erforderlich, nicht-nuklearmedizinische bildgebende Verfahren anzuwenden, um die räumliche Verteilung von Weichgewebe, Fettgewebe und Knochen in der Spongiosa zu bestimmen. Daher sind die zwei Ziele dieser Dissertation: i) die Anwendung der Magnetresonanztomographie (MRT) zur Quantifizierung des Fettvolumenanteils und ii) die Validierung einer auf der quantitativen Dual-Energy Computertomographie (engl. Dual-energy quantitative computed tomography, DEQCT) basierenden Methode zur Quantifizierung des Knochentrabekelvolumenanteils. In einem ersten Schritt wurde eine Zweipunkt-Dixon-Sequenz der MRT zur Fett-Wasser-Trennung in einem 3 Tesla-System validiert, indem der Fettvolumenanteil in einem Phantom und in den Lendenwirbeln von Probanden quantifiziert und mit mittels der Magnetresonanzspektroskopie (MRS) ermittelten Werten verglichen wurde. Nach erfolgreicher Validierung wurde der Fettvolumenanteil retrospektiv an den fünf Lendenwirbeln von 44 in der im klinischen Routine aufgenommenen Patientendatensätzen gemessen. Die Zweipunkt-Dixon-Methode zeigte eine gute Quantifizierung des Fettvolumenanteils im Phantomexperiment (-9,8% maximaler relativer Fehler in Bezug auf die Nennwerte). Bei den Probanden wurde ein nicht signifikanter Unterschied zwischen MRT und MRS für die Quantifizierung des Fettvolumenanteils in einem Zielvolumen mit ähnlichen Dimensionen und ähnlicher Orientierung festgestellt. In der Patientenstudie wurde festgestellt, dass die Umwandlung des Knochenmarks (rotes Knochenmark → gelbes Knochenmark) altersabhängig und bei Männern (0,3% pro Jahr) langsamer als bei Frauen (0,5% pro Jahr) voranschreitet. Es wurde allerdings auch eine beträchtliche Variabilität des Fettvolumenanteils bei Patienten ähnlichen Alters und gleichen Geschlechts beobachtet. Diese Ergebnisse ermöglichen die Verwendung der Zweipunkt-Dixon-MRT zur Quantifizierung des Fettvolumenanteils im Knochenmark. Darüber hinaus legt die konstante Umwandlung des Knochenmarks im Erwachsenenalter nahe, dass der von der Internationalen Strahlenschutzkommission (engl. International Commission on Radiological Protection, ICRP) vorgeschlagene konstante Zellvolumenanteil von 0,7 (Referenzwert für einen männlichen Erwachsenen) (1,2) durch einen patientenspezifischen Ansatz ersetzt werden sollte. In einem zweiten Schritt wurde eine auf DEQCT basierende Quantifizierungsmethode in zwei CT-Systemen validiert: i) ein in ein SPECT/CT integriertes klinisches CT und ii) ein Dual-Source-Computertomographie-System (DSCT). Die Methode wurde an zwei Phantomen erprobt: Das erste diente zur Validierung der DEQCT-Methode, wobei der Hydroxylapatit-Volumenanteil in drei 50-Milliter-Phiolen mit drei verschiedenen Hydroxylapatit-Konzentrationen (100 mg/cm3, 200 mg/cm3, 300 mg/cm3) quantifiziert wurde. Das zweite Phantom war das European Spine Phantom (ESP), ein anthropomorphes Wirbelsäulenphantom. Es wurde verwendet, um den Knochenmineralgehalt (engl. Bone Mineral Content, BMC) des gesamten Wirbels und den Hydroxylapatit-Volumenanteil (VFHA) in der Spongiosa-Region jedes Phantomwirbels zu quantifizieren. Schließlich wurde der BMC der Lendenwirbel 1 (LV1) und 2 (LV2) bei einem Patienten unter Verwendung von DEQCT und Dual-Röntgen-Absorptiometrie (engl. dual-energy X-ray absorptiometry, DEXA) gemessen. Darüber hinaus wurden der Hydroxylapatit-Volumenanteil (VFHA) und der Knochenvolumenanteil (VFB) sowohl für die gesamten Wirbel als auch für die Spongiosa-Region von LV1 und LV2 berechnet. Der gemessene und der nominelle Hydroxylapatit-Volumenanteil in den Phiolen zeigten eine gute Korrelation (maximaler relativer Fehler: 14,2%). Die Quantifizierung des BMC im gesamten Wirbel und des VFHA in der Spongiosa-Region zeigten größere relative Fehler als im Validierungsphantom: Die BMC-Quantifizierung für LV1 und LV2 ergaben relative Fehler zwischen DEXA und DSCT in Höhe von 7,6% (LV1) und -8,4% (LV2). Auch die Werte des VFHA (mineralischer Knochen) waren kleiner als die des VFB. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Knochenzusammensetzung (Knochenmineral plus organisches Material). Die DEQCT-Methode ermöglicht die Quantifizierung von Hydroxylapatit (mineralischer Knochen) und Knochen (mineralischer Knochen plus organisches Material) in einem klinischen Umfeld. Die Methode zeigte jedoch eine Überschätzung des quantifizierten mineralischen Knochenvolumenanteils. Diese Überschätzung könnte mit dem Mangel an detaillierten Informationen über die CT-Röntgenspektren und die Detektorempfindlichkeit zusammenhängen. Auch die DEQCT-Methode zeigte eine Abhängigkeit vom verwendeten CT-Rekonstruktionsalgorithmus und der chemischen Beschreibung der zu quantifizierenden Materialien. Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen die Machbarkeit einer Quantifizierung des Fettvolumenteils und des Knochenvolumenteils in der Spongiosa in einem klinischen Kontext. Darüber hinaus geben die Unterschiede im Fettvolumenanteil von Frauen und Männern sowie die Variabilität des Fettvolumenanteils bei Individuen ähnlichen Alters Grund zur kritischen Auseinandersetzung mit der Näherung des Zellvolumenanteils durch nur einen einzelnen ICRP-Referenzwert in der Knochenmarkdosimetrie bei Radionuklidtherapien. Zusätzlich wird in dieser Arbeit der erste Ansatz für eine nicht-invasive Quantifizierung des Volumenanteils des Knochens (Knochenmineral plus organisches Material) für eine verbesserte Dosimetrie des Knochenmarks vorgestellt.

Peripheral neuropathies can severely affect patients. Causes for the disease are diverse but can be classified into two main groups, acquired and hereditary. Examples for these two types are chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (CIDP) and Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A). CIDP has an estimated prevalence of about 1-9:100 000. In this pathogenetically hetereo- geneous patient group about 5-10% show auto-antibodies against the node of Ranvier and present with distinct symptoms. Treatment with rituximab - a monoclonal antibody that deletes CD20 + B cells - has been shown to be effective in a majority of auto-antibody as- sociated CIDP cases. This suggests that B cells and the produced auto-antibodies might be pathogenic. Previous studies delivered evidence that auto-antibodies alone can induce nerve damage. In this study, the aim was to investigate the pathomechanism of auto-antibodies in vivo and their exact origin: For the analysis of the pathogenicity of auto-antibodies, passive transfer experiments on Lewis rats were performed with whole IgG from a patient with anti-contactin-1 (CNTN1) IgG4 auto-antibodies. IgG was infused through an intrathe- cal catheter targeting the thoracic/lumbar region of the spine over a long-term, 3-week period. In a previous study of our group, the IgG from the same patient has been re- ported to have mild pathogenic effects when applied intraneurally into the sciatic nerve of Lewis rats. In this study however, binding of auto-antibodies to nerve roots could not be detected. Neither evaluation of electrophysiological properties after the injection period nor motor and sensory skills tested throughout the injection period showed differences when compared to animals infused with control IgG. This suggests that in the chronic intrathecal protocol anti-CNTN1 auto-antibodies did not have a pathogenic effect. In peripheral blood, four B cell subsets capable to produce antibodies were previously described: memory B cells, plasmablasts (PBs), B1 cells and CD20 + CD38 hi cells. For the identification of the B cell subsets that produce auto-antibodies, purification and sort protocols as well as an enzyme-linked immuno spot (ELISpot) assay for IgG and IgM were established successfully. Since unstimulated B cell subsets produced very small amounts of IgG and IgM, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated with IL-2 and R848 for 72 h prior to sorting. While the memory B cell frequency decreased after stimulation, the frequency of CD20 + CD38 hi cells increased and the overall number of antibody-secreting cells was increased. When stimulating patient PBMCs for 10 days though, detection of anti-neurofascin-155 (NF155) auto-antibodies in supernatants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was possible in two out of three patient samples. Even though cell sorting was feasible after 10 days of stimulation, detection of auto-antibodies could not be accomplished using antigen-specific ELISpot. Although the implementation of the cell sorting and purification protocol was successful, further adjustments of the antigen-specific ELISpot need to be performed. However, we could show that after 10 days of stimulation auto-antibody detection is possible by ELISA which helps to pre-screen if patient PBMC contain auto-reactive B cells. CMT1A has an estimated prevalence of 1:5000 and is caused by a duplication of the peripheral myelin protein 22 kDa (PMP22) gene. Patients suffer from distal weakness and muscle wasting leading even to wheelchair-dependency in some cases. Although different treatment options for CMT1A have been tested in previous clinical trials, none of them have been successful. In this study, the aim was to identify objective and reproducible outcome measures that assess the actual nerve damage in a large cohort of CMT1A patients by analyzing a series of parameters. Glabrous skin samples were collected from 48 CMT1A, 7 CIDP and 16 small fiber neuropathy patients and 45 healthy controls. 40-µm cryosections from the lateral part of the index finger were double-labeled using immunoflu- orescence to investigate cutaneous innervation. The disease severity which was assessed using the Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2 (CMTNSv2) and ranged between mild to severe (3-27) correlated with age in CMT1A patients. Furthermore, the intraepidermal nerve fiber density (IENFD) was reduced in CMT1A patients in comparison to controls and correlated negatively with the disease severity. In controls however, the IENFD correlated inversely with age. Meissner corpuscle density tended to be reduced and correlated inversely with age in CMT1A patients. This was not observed in healthy controls though. Compared to controls, Merkel cell density was also reduced in CMT1A, while the fraction of denervated Merkel cell was increased and correlated with age. Further differences were revealed concerning the node of Ranvier. Paranodes were shortened and the fraction of long nodes was decreased in CMT1A patients compared to controls. These data suggest that the IENFD, the Meissner corpuscle and Merkel cell densities are possible candidates for outcome measures as they are associated with disease severity or age of patients. However, a reliable statement about the suitability as a marker for disease progression can not be made in this study since only six CMT1A patients agreed to give a follow-up biopsy two years later. / Polyneuropathien können Patienten schwer betreffen. Krankheitsursachen sind vielfältig, können jedoch in zwei Hauptgruppen unterteilt werden. Sie können erworben oder genetisch bedingt sein. Beispiele für diese zwei Klassen sind die chronisch inflammatorische demyelinisierende Polyradikuloneuropathie (CIDP) und Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung Typ 1A (CMT1A). CIDP hat eine geschätzte Häufigkeit von etwa 1-9:100 000. 5-10% der Patienten dieser pathogenetisch heterogenen Gruppe weisen Auto-Antikörper gegen den Ranvier’schen Schnürring auf und zeigen Symptome, die sich von anderen CIDP-Patienten unterscheiden. Es wurde gezeigt, dass die Behandlung mit Rituximab - einem monoklonalen Antiköper, der CD20+ B-Zellen deletiert - bei der Mehrheit der Auto-Antikörper-assoziierten CIDP-Fälle wirksam ist. Das deutet darauf hin, dass B-Zellen und die produzierten Auto-Antikörper pathogenetisch sein könnten. Frühere Studien liefern Beweise, dass Auto-Antikörper allein Nervenschädigungen verursachen können. Ziel dieser Studie war es, den Pathomechanismus der Auto-Antikörper in vivo zu untersuchen und deren genaue Herkunft zu ermitteln: Um die Pathogenität von Auto-Antikörpern zu ermitteln, wurden Passiv-Transfer-Versuche an Lewis Ratten mit Gesamt-IgG einer Patientin mit anti-CNTN1 IgG4 Auto-Antikörpern durchgeführt. Das IgG wurde mittels eines intrathekalen Katheters, der am thorakalen/lumbalen Abschnitt der Wirbelsäule endete, über eine langzeitige, 3-wöchige Zeitspanne injiziert. Eine frühere Studie unserer Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass das IgG derselben Patientin milde pathogenetische Effekte hatte, als diese intraneural in den Ischiasnerv von Lewis Ratten appliziert wurden. In dieser Studie jedoch konnten keine Bindungen von Auto-Antikörpern an die Nervenwurzel ermittelt werden. Patienten-Tiere zeigten keine Unterschiede zu Tieren auf, die mit Kontroll-IgG behandelt wurden, weder in der Untersuchung von elektrophysiologischen Eigenschaften nach der Injektionszeit noch bezüglich motorischer und sensorischer Fähigkeiten, die auch während der Injektionszeit getestet wurden. Dies deutet darauf hin, dass anti-CNTN1 Auto-Antikörper keinen pathogenetischen Effekt bei Anwendung des chronischen, intrathekalen Protokolls hatten. In peripherem Blut wurden vier B-Zell-Subgruppen beschrieben, die fähig sind, Antikörper zu produzieren: Gedächtnis-B-Zellen, Plasmablasten, B1-Zellen und CD20+ CD38hi B-Zellen. Um die Auto-Antikörper-produzierenden B-Zell-Subtypen zu identifizieren, wurden Protokolle zur Anreicherung und zum Sortieren sowie zum ELISpot für IgG und IgM erfolgreich etabliert. Da die Produktion von IgG- und IgM-Antikörpern in unstimulierten B-Zell-Subtypen sehr gering war, wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) mit IL-2 und R848 vor dem Sorten für 72 h stimuliert. Während die Häufigkeit von Gedächtnis-B-Zellen nach der Stimulation abnahm, ist die Häufigkeit von CD20+ CD38hi B-Zellen gestiegen und die Gesamtzahl an Antikörper-sezernierenden Zellen hat zugenommen. Wurden Patienten PBMCs jedoch für 10 Tage stimuliert, konnten Auto-Antikörper in Überständen mittels ELISA in zwei von drei Patientenproben ermittelt werden. Obwohl das Sorten nach 10-tägiger Stimulation immernoch durchführbar war, war die Detektion von Auto-Antikörper durch antigenspezifischen ELISpot nicht erfolgreich. Trotz der gelungenen Etablierung der Anreicherungs- und Sortierungsprotokolle müssen weitere Einstellarbeiten am antigenspezifischen ELISpot-Protokoll vorgenommen werden. Trotzdem konnten wir zeigen, dass die Detektion von Auto-Antikörpern nach 10-tägiger PBMC-Stimulation mittels ELISA möglich ist, was dabei hilft zu ermitteln, ob Patienten-PBMCs auto-reaktive B-Zellen enthalten. CMT1A hat eine geschätzte Häufigkeit von etwa 1:5000 und wird durch eine Duplikation des PMP22-Gens (peripheral myelin protein 22 kDa) verursacht. Patienten leiden unter distaler Schwäche und Muskelschwund, was in manchen Fällen sogar zu Rollstuhlabhängigkeit führen kann. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten für CMT1A in früheren Studien getestet wurden, ist keine von ihnen erfolgreich gewesen. Das Ziel dieser Studie war es, objektive und reproduzierbare Outcome-Parameter, die den tatsächlichen Nervenschaden bemessen, in einer großen Kohorte von CMT1A-Patienten zu identifizieren, wozu eine Reihe an Parametern analysiert wurde. Von 48 CMT1A-, 7 CIDP- und 16 small fiber neuropathy- Patienten und 45 gesunden Kontrollen wurden unbehaarte Hautproben der lateralen Region des Zeigefingers entnommen. An diesen wurden Doppelfluoreszenzfärbungen vorgenommen, um die kutane Innervation zu untersuchen. Der Krankheitsgrad der CMT1A-Gruppe, der durch den Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2 eingestuft wurde, erstreckte sich von mild bis schwer (3-27) und korrelierte mit dem Alter der Patienten. Zudem war die intraepidermale Nervenfaserdichte (IENFD) reduziert in CMT1A-Patienten im Vergleich mit gesunden Kontrollen und korrelierte invers mit dem Krankheitsgrad der Patienten. In gesunden Kontrollen korrelierte jedoch die IENFD invers mit dem Alter. Die Dichte der Meissner-Körperchen neigte zu Abnahme in CMT1A-Patienten und korrelierte negativ mit deren Alter, was nicht in gesunden Kontrollen beobachtet wurde. Im Vergleich mit gesunden Kontrollen war die Dichte der Merkel-Zellen ebenfalls verringert in CMT1A, während der Anteil von denervierten Merkel-Zellen erhöht war und mit dem Alter korrelierte. Weitere Unterschiede wurden am Ranvier’schen Schnürring festgestellt. Paranodale Regionen waren verkürzt und der Anteil von langen Schnürringen war erhöht in CMT1A-Patienten im Vergleich zu den Kontrollen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die IENFD, die Dichten der Meissner-Körperchen und Merkel-Zellen potentielle Kandidaten für Outcome-Parameter sind, da sie entweder mit dem Krankheitsgrad oder dem Alter zusammenhängen. Jedoch kann in dieser Studie keine verlässliche Aussage über die Eignung dieser Parameter als Marker für den Krankheitsfortschritt gemacht werden, da zwei Jahre später nur sechs CMT1A-Patienten zu einer Folgebiopsie eingewilligt haben.

Due to a usually late diagnosis, drug resistance and early metastases, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the seventh leading cause of global cancer deaths. Thus, there is an urgent need to develop new therapeutic concepts. Two different approaches have in recent years become the focus of intense research: (1) targeting cancer-associated metabolic rearrangements, and (2) targeting genetic vulnerabilities with combination therapy. Both concepts potentially have advantages such as increased efficacy, which decreases the likelihood of therapy-resistance, and reduced side effects, that are often associated with high concentrations of chemotherapeutic drugs. Autophagy is an evolutionary conserved signalling pathway that regulates cellular homeostasis. Regarding cancer, autophagy can either promote or suppress tumor growth. However, mouse models that allow genetic regulation of autophagy in established tumor tissue are not yet established. Therefore, we analysed new inducible shRNA mouse models targeting Atg5 or Atg7 with regard to functionality and toxicity. Both, shRNA Atg5- and shRNA Atg7-mediated knockdown anteceded functional autophagy impairment, and revealed unexpected profound phenotypic differences. Knockdown of Atg5 neither impaired the animal nor caused any grossly or microscopically detectable organ damage, whereas knockdown of Atg7 caused pancreatic destruction and eventually death. It is currently unclear whether mice died as a result of exocrine or endocrine collapse or due to a combination of both. The presented mouse models are highly potent RNAi mice that allow widespread and regulable inhibition of autophagy upon administration of doxycycline and provide a valuable and versatile toolbox for future autophagy and cancer research. In PDAC, argininosuccinate synthase 1 (ASS1) deficiency has been associated with higher recurrence rates, shorter disease-free survival, and shorter overall survival. During cancer development, rate-limiting enzymes of de novo arginine synthesis, like ASS1 or OTC, are downregulated via epigenetic silencing of their respective promotor. Known as ‘arginine auxotrophy‘, loss of these essential enzymes results in dependence on extracellular arginine. Based on this assumption, sensitivity of various cell lines to arginine deprivation was reported. However, the underlying mechanism is still unclear and the anti-tumor effects of the monotherapy are not sufficient to completely abrogate cancer cells. Therefore, the effects of arginine deprivation via rhArgI-PEG5000 were investigated in murine and human PDAC cells. In this study, we highlighted that arginine deprivation induced profound alterations such as autophagosome accumulation, induction of senescence and the ISR in pancreatic cancer cells. These alterations are potential genetic vulnerabilities that can be targeted by additional means to induce tumor cell death. / Infolge einer späten Diagnose, Therapie-Resistenz und unentdeckten Mikrometastasen wurde das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zur siebthäufigsten krebsbedingten Todesursache weltweit. Dies verdeutlicht, dass dringend neue therapeutische Ansätze entwickelt werden müssen. In den vergangenen Jahren wurde unter anderem auf zwei Ansätze fokussiert: (1) Behandlung Tumor-assoziierter metabolischer Veränderungen und (2) Behandlung genetischer Schwachstellen mit Kombinationstherapie. Zum einen erhofft man sich eine erhöhte Wirksamkeit, die die Wahrscheinlichkeit von Therapie-Resistenzen reduziert, zum anderen verringerte Nebenwirkungen, die meist mit hohen Chemotherapeutika-Konzentrationen verbunden sind. Autophagie ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der für die Regulation der zellulären Homöostase verantwortlich ist. Es ist bekannt, dass dieser das Tumorwachstum sowohl fördern, als auch unterdrücken kann. Jedoch sind Mausmodelle, die eine genetische Regulierung von Autophagie im etablierten Tumorgewebe ermöglichen, noch nicht etabliert. Aus diesem Grund wurden neue induzierbare shRNA-Mausmodelle gegen Atg5 oder Atg7 hinsichtlich Funktionalität und Toxizität analysiert. Nach Induktion führten beide shRNAs zum systemweiten Knockdown, der im weiteren Verlauf eine funktionelle Beeinträchtigung des Signalwegs zur Folge hatte. Jedoch traten unerwartete phänotypische Unterschiede auf. Der Atg5-Knockdown beeinträchtigte weder den Allgemeinzustand des Tieres noch verursachte es makroskopisch oder mikroskopisch nachweisbare Organschäden. Im Gegenteil dazu hatte der Atg7- Knockdown die Zerstörung des Pankreas und schließlich den Tod des Tieres zur Folge. Es bleibt unklar, ob die Tiere infolge eines exokrinen oder endokrinen Kollapses oder aufgrund einer Kombination aus beidem starben. Dennoch ermöglichen die vorgestellten Mausmodelle eine systemweite Regulation von Autophagie. Daher stellen sie eine wertvolle und vielseitige Methode für die zukünftige Autophagie- und Krebs-Forschung dar. Ein Argininosuccinate Synthase 1 (ASS1)-Mangel in PDAC-Patienten wird mit einem höheren Rezidiv, einem kürzeren krankheitsfreien Überleben und einem kürzeren Gesamtüberleben in Verbin-dung gebracht. Im Laufe der Entwicklung eines Tumors kommt es häufig zum Verlust essentieller Enzyme, wie ASS1 oder OTC, innerhalb der Arginine de novo Synthese. Bekannt als ‘Arginin-Auxotrophie‘, hat dies die Abhängig von extrazellulärem Arginine zur Folge. Basierend auf dieser Annahme, wurde die Sensibilität verschiedener Tumorzelllinien auf Argininentzug nachgewiesen. Jedoch ist der zugrunde liegende Mechanismus noch unklar und die Wirksamkeit nicht ausreichend, um alle Tumorzellen zu zerstören. Aus diesem Grund wurde der Effekt von Argininentzug mittels rhArgI-PEG5000-Behandlung auf murine und humane PDAC-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Argininentzug Akkumulation von Autophagosomen, die Induktion von Seneszenz und die ISR zur Folge hatte. Diese Veränderungen stellen potentielle genetische Schwachstellen dar, die in Kombination mit anderen Medikamenten behandelt werden könnten, um Tumorzelltod zu induzieren.

The small protein modifier ubiquitin is at the heart of an immensely versatile posttranslational modification system that orchestrates countless physiological and disease-associated cellular processes. Key to this versatility are the manifold modifications that can be assembled from ubiquitin “building blocks” and are associated with specific functional outcomes for the modified substrates. In particular, ubiquitin molecules can form polymeric chains of distinct lengths and linkage types that give rise to distinct chain conformations, thereby providing recognition sites for specific signaling receptors/effectors. The class of E3 enzymes (ubiquitin ligases) provides critical specificity determinants in ubiquitin linkage formation; it is therefore crucial to unravel precisely how E3 enzymes operate in order to understand the structural basis of ubiquitin signaling and exploit these insights for therapeutic benefit. Overexpression and deregulation of the HECT-type ubiquitin ligase HUWE1 is implicated in several different cancer types and neurodegenerative disorders. It is largely unknown which factors control the ubiquitin modifications formed by HUWE1, how the catalytic HECT domain interacts with functionally distinct ubiquitin molecules (donor, acceptor and regulatory ubiquitin molecules) and which conformational transitions enable these interactions during ubiquitin chain formation. One aim of this study was to structurally elucidate the recognition of donor ubiquitin by the HECT domain of HUWE1. To this end I utilized a ubiquitin activity-based probe to reconstitute a proxy for a donor ubiquitin-linked conjugate of the HECT domain of HUWE1 and determined its structure by X-ray crystallography. This structure reveals that the donor ubiquitin binds to the C-lobe of HUWE1 in the same way as NEDD4-type ligases, corroborating the idea that HECT ligases utilize a conserved mode of donor ubiquitin recognition. independent of their linkage and substrate specificities. With the help of biochemical analyses, I also validated specific features of the structure, in particular the positioning of the C-terminal tail of the ligase, which was known to be critical for activity. In the newly determined structure, which reflects an “L-shaped”, active state of the HECT domain, this tail is fully resolved and coordinated at the N-lobe-C-lobe interface. I defined residues that are critical for this coordination and showed that they are also essential for the activity of HUWE1, including auto-ubiquitination, free ubiquitin chain formation, and substrate ubiquitination. Furthermore, I discovered that the N-lobe of HUWE1 harbors a ubiquitin-binding exosite similar to NEDD4-type ligases and E6AP. My in-vitro activity and binding assays show that HUWE1 uses the exosite for isopeptide bond formation, but that it is dispensable for thioester bond formation. The binding assays further show that the donor ubiquitin loaded HECT domain binds an additional ubiquitin molecule at the exosite more tightly than the apo HECT domain, which possibly suggests allosteric communication between the two sites. Finally, I showed that the ubiquitin activity-based probe (ubiquitin-propargylamine) can label the catalytic cysteine of HUWE1 and NEDD4-type with close to quantitative turn- over, while it does not react with the HECT domain of the evolutionarily more divergent E6AP. The determinants underlying these differential reactivities remain to be explored. Taken, together my results significantly enhance our mechanistic understanding of the catalytic domain of HUWE1 and pinpoint linchpins for therapeutic interventions with the activity of this disease-relevant enzyme. / Der kleine Proteinmodifikator Ubiquitin ist das Herzstück eines immens vielseitigen posttranslationalen Modifikationssystems, das unzählige physiologische und krankheitsassoziierte zelluläre Prozesse orchestriert. Der Schlüssel zu dieser Vielseitigkeit sind die vielfältigen Modifikationen, die sich aus Ubiquitin-"Bausteinen" zusammensetzen lassen und mit spezifischen funktionellen Ergebnissen für die modifizierten Substrate verbunden sind. Insbesondere können Ubiquitin-Moleküle Ketten unterschiedlicher Länge und Verknüpfungstypen bilden, die zu unterschiedlichen Kettenkonformationen führen und dadurch Erkennungsstellen für spezifische Signalrezeptoren/-effektoren bieten. Die Klasse der E3-Enzyme (Ubiquitin-Ligasen) liefert kritische Spezifitätsdeterminanten für die Bildung von Ubiquitin-Bindungen; daher ist es entscheidend, die genaue Funktionsweise der E3-Enzyme zu entschlüsseln, um die strukturelle Grundlage der Ubiquitin-Signalisierung zu verstehen und diese Erkenntnisse für therapeutische Anwendungen zu nutzen. Die Überexpression und Deregulierung der Ubiquitin-Ligase HUWE1 aus der Klasse der HECT-E3-Ligasen ist an mehreren verschiedenen Krebsarten und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Es ist weitgehend unbekannt, welche Faktoren durch die von HUWE1 gebildeten Ubiquitin-Modifikationen kontrolliert werden, wie die katalytische HECT-Domäne mit funktionell unterschiedlichen Ubiquitin-Molekülen (Donor-, Akzeptor- und regulatorische Ubiquitin-Moleküle) interagiert und welche Konformationsübergänge diese Interaktionen während der Ubiquitin-Kettenbildung ermöglichen. Ein Ziel dieser Studie war es, die Erkennung des Donor-Ubiquitin-Moleküls durch die HECT-Domäne von HUWE1 strukturell aufzuklären. Zu diesem Zweck verwendete ich eine ´ubiquitin activity-based probe´, um ein Konjugat der HUWE1-HECT-Domäne mit einem Donor-Ubiquitin-Molekül zu rekonstitutieren und die Struktur mittels Röntgenkristallographie zu bestimmen. Diese Struktur zeigte, dass das Donor-Ubiquitin-Molekül auf die gleiche Weise an den C-lobe von HUWE1 bindet wie die Klasse der NEDD4-Ligasen, was die Idee bestätigt, dass HECT-Ligasen einen vergleichbaren Mechanismus bei der Donor-Ubiquitin-Erkennung verwenden, unabhängig von ihrer Bindung und Substratspezifität. Mit Hilfe biochemischer Analysen validierte ich auch spezifische Merkmale der Struktur, insbesondere die Positionierung des C-terminal tail der Ligase, der entscheidend für die Aktivität ist. In der neu bestimmten Struktur, die einen "L-förmigen", aktiven Zustand der HECT-Domäne widerspiegelt, ist der C-terminal tail an der Grenzfläche von N-lobe und C-lobe vollständig aufgelöst und koordiniert. Ich konnte Seitenketten festmachen, die für diese Koordination kritisch sind, und habe gezeigt, dass sie auch für die Aktivität von HUWE1 wesentlich sind, einschließlich der Auto-Ubiquitinierung, der freien Ubiquitin-Kettenbildung und der Substrat-Ubiquitinierung. Darüber hinaus entdeckte ich, dass der N-lobe von HUWE1 eine Ubiquitin-bindende exosite aufweist, ähnlich wie für die Klasse der NEDD4-Ligasen und E6AP. Meine in vitro Aktivitäts- und Bindungstests ergaben, dass HUWE1 die exosite für die Bildung von Isopeptidbindungen verwendet, diese aber für die Bildung von Thioesterbindungen entbehrlich ist. Die Bindungstests zeigten ferner, dass die Donor-Ubiquitin-beladene HECT-Domäne ein zusätzliches Ubiquitin-Molekül an der exosite stärker bindet als die Apo-HECT-Domäne, was möglicherweise auf eine allosterische Kommunikation zwischen den beiden Ubiquitin-Bindestellen hindeutet. Schließlich zeigte ich, dass die ´ubiquitin activity-based probe´ (Ubiquitin-Propargylamin) das katalytische Cystein von HUWE1 und NEDD4 mit nahezu quantitativem Umsatz markieren kann, während es nicht mit der HECT-Domäne des evolutionär stärker divergierenden E6AP reagiert. Die Faktoren, die diesen unterschiedlichen Reaktivitäten zugrunde liegen, müssen noch erforscht werden. Zusammengenommen verbessern meine Ergebnisse unser mechanistisches Verständnis der katalytischen Domäne von HUWE1 und geben uns die Dreh- und Angelpunkte für therapeutische Interventionen mit der Aktivität dieses krankheitsrelevanten Enzyms an die Hand.

Water transport through the water channels, aquaporins (AQPs), is involved in epithelial fluid secretion and absorption, cell migration, brain edema, adipocyte metabolism, and other physiological or pathological functions. Modulation of AQP function has therapeutic potential in edema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma, etc. The function of AQPs is in response to the osmotic gradient that is formed by the concentration differences of ions or small molecules. In terms of brain edema, it is a pathophysiological condition, resulting from dysfunction of the plasma membrane that causes a disorder of intracellular ion homeostasis and thus increases intracellular fluid content. Optogenetics can be used to regulate ion transport easily by light with temporal and spatial precision. Therefore, if we control the cell ion influx, boosting the water transport through AQPs, this will help to investigate the pathological mechanisms in e.g. brain edema. To this end, I investigated the possibility for optogenetic manipulating water transport in Xenopus oocytes. The main ions in Xenopus oocyte cytoplasm are ~10 mM Na+, ~50 mM Cl- and ~100 mM K+, similar to the mammalian cell physiological condition. Three light-gated channels, ChR2-XXM 2.0 (light-gated cation channel), GtACR1 (light-gated anion channel) and SthK-bPAC (light-gated potassium channel), were used in my study to regulate ion transport by light and thus manipulate the osmotic gradient and water transport. To increase water flow, I also used coexpression of AQP1. When expressing ChR2-XXM 2.0 and GtACR1 together, mainly Na+ influx was triggered by ChR2-XXM2.0 under blue light illumination, which then made the membrane potential more positive and facilitated Cl- influx by GtACR1. Due to this inward movement of Na+ and Cl-, the osmotic gradient was formed to trigger water influx through AQP1. Large amounts of water uptake can speedily increase the oocyte volume until membrane rupture. Next, when co-expressing GtACR1 and SthK-bPAC, water efflux will be triggered with blue light because of the light-gated KCl efflux and then oocyte shrinking could be observed. I also developed an optogenetic protein purification method based on a light-induced protein interactive system. Currently, the most common protein purification method is based on affinity chromatography, which requires different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH 4.5 - 6 and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. The change in conditions could influence the activity of target proteins. So, an easy and flexible protein purification method based on the photo-induced protein interactive system iLID was designed, which regulates protein binding with light in mild conditions and does not require a change of solution composition. For expression in E. coli, the blue light-sensitive part of iLID, the LOV2 domain, was fused with a membrane anchor and expressed in the plasma membrane, and the other binding partner, SspB, was fused with the protein of interest (POI), expressed in the cytosol. The plasma membrane fraction and the soluble cytosolic fraction of E. coli can be easily separated by centrifugation. The SspB-POI can be then captured to the membrane fraction by light stimulation and released to clean buffer in the dark after washing. This method does not require any specific column and functions in mild conditions, which are very flexible at scale and will facilitate extensive protein engineering and purification of proteins, sensitive to changed buffer conditions. / Der Wassertransport durch die Wasserkanäle, Aquaporine (AQPs), ist unter anderem an der Sekretion und Absorption der Epithelflüssigkeit, der Zellmigration, dem Hirnödem und dem Adipozytenstoffwechsel beteiligt. Die Modulation der AQP-Funktion hat therapeutisches Potenzial bei Ödemen, Krebs, Fettleibigkeit, Hirnverletzungen, Glaukom usw. Die Funktion von AQPs reagiert auf den osmotischen Gradienten, der durch Konzentrationsunterschiede von Ionen oder kleinen Molekülen gebildet wird. In Bezug auf das Hirnödemhandelt es sich um einen pathophysiologischen Zustand, der aus einer Funktionsstörung der Plasmamembran resultiert und eine Störung der intrazellulären Ionenhomöostase verursacht und somit den intrazellulären Wassergehalt erhöht. Die Optogenetik kann verwendet werden, um den Ionentransport durch Licht mit zeitlicher und räumlicher Präzision leicht zu regulieren. Wenn wir also den Ioneneinstrom in die Zelle erhöhen, wird dies den Wasserimport durch AQPs fördern. ...

The tropomysin receptor kinase B (TrkB), the receptor for the neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF), plays an important role in neuronal survival, neuronal differentiation, and cellular plasticity. Conventionally, TrkB activation is induced by binding of BDNF at extracellular sites and subsequent dimerization of receptor monomers. Classical Trk signaling concepts have failed to explain ligand-independent signaling of intracellular TrkB or oncogenic NTRK-fusion proteins. The intracellular activation domain of TrkB consists of a tyrosine kinase core, with three tyrosine (Y) residues at positions 701, 705 and 706, that catalyzes the phosphorylation reaction between ATPγ and tyrosine. The release of cisautoinhibition of the kinase domain activates the kinase domain and tyrosine residues outside of the catalytic domain become phosphorylated. The aim of this study was to find out how ligand-independent activation of TrkB is brought about. With the help of phosphorylation mutants of TrkB, it has been found that a high, local abundance of the receptor is sufficient to activate TrkB in a ligand-independent manner. This self-activation of TrkB was blocked when either the ATP-binding site or Y705 in the core domain was mutated. The vast majority of this self-active TrkB was found at intracellular locations and was preferentially seen in roundish cells, lacking filopodia. Live cell imaging of actin dynamics showed that self-active TrkB changed the cellular morphology by reducing actin filopodia formation. Signaling cascade analysis confirmed that self-active TrkB is a powerful activator of focal adhesion kinase (FAK). This might be the reason why self-active TrkB is able to disrupt actin filopodia formation. The signaling axis from Y705 to FAK could be mimicked by expression of the soluble, cytosolic TrkB kinase domain. However, the signaling pathway was inactive, when the TrkB kinase domain was targeted to the plasmamembrane with the help of artificial myristoylation membrane anchors. A cancer-related intracellular NTRK2-fusion protein (SQSTM1-NTRK2) also underwent constitutive kinase activation. In glioblastoma-like U87MG cells, self-active TrkB kinase reduced cell migration. These constitutive signaling pathways could be fully blocked within minutes by clinically approved, anti-tumorigenic Trk inhibitors. Moreover, this study found evidences for constitutively active, intracellular TrkB in tissue of human grade IV glioblastoma. In conclusion, the data provide an explanation and biological function for selfactive, constitutive TrkB kinase domain signaling, in the absence of a ligand. / Die Rezeptortyrosinkinase TrkB, der Rezeptor für das Neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF), spielt eine wichtige Rolle für das neuronale Überleben, die neuronale Differenzierung und die zelluläre Plastizität. Üblicherweise wird TrkB bei der Bindung von BDNF an extrazellulären Domänen durch Dimerisierung von Rezeptormonomeren aktiviert. Klassische Konzepte der Trk Signalübertragung können jedoch die Liganden-unabhängige Signalübertragung von intrazellulären TrkB- oder Onkogen-aktiven NTRK-Fusionsproteinen nicht erklären. Die intrazelluläre Aktivierungsdomäne von TrkB besitzt eine Tyrosinkinasedomäne mit drei Tyrosin (Y)-Resten an den Positionen 701, 705 und 706. Diese katalysieren die Phosphorylierungsreaktion zwischen ATPγ und Tyrosin. Durch die Enthemmung der cis-Autoinhibition wird die Kinase-Domäne aktiv und Tyrosinreste außerhalb der katalytischen Domäne werden phosphoryliert. Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, wie es zur Liganden-unabhängigen Aktivierung von TrkB kommen kann. Mit Hilfe von TrkB-Phosphorylierungsmutanten wurde gefunden, dass eine hohe, lokale Abundanz des Rezeptors ausreicht, um TrkB Liganden-unabhängig zu aktivieren. Diese Selbstaktivierung von TrkB konnte blockiert werden, wenn entweder die ATP-bindende Domäne oder Y705 in der Kinasedomäne mutiert wurden. Die überwiegende Mehrheit dieses selbstaktivierenden TrkB wurde intrazellulär, in rundlichen Zellen ohne Filopodien, gefunden. Live-Zellbildgebung der Aktindynamik zeigte zudem, dass selbstaktives TrkB die Zellmorphologie veränderte, indem es die Bildung von Aktin-Filopodien reduzierte. Die Analyse von Signalkaskaden bestätigte, dass selbstaktives TrkB ein starker Aktivator der Focal Adhesion Kinase (FAK) ist. Dies kann der Grund sein, warum selbstaktives TrkB die Bildung von Aktin-Filopodien zerstört. Die Signalkaskade von Y705 bis FAK konnte durch Expression der löslichen, zytosolischen TrkB-Kinase-Domäne imitiert werden. Der Signalweg war jedoch inaktiv, wenn die TrkB-Kinase-Domäne durch künstliche Myristoylierung an die Plasmamembran gebunden wurde. Ein intrazelluläres NTRK2-Fusionsprotein (SQSTM1-NTRK) zeigte ebenfalls konstitutive Kinaseaktivierung. In Glioblastom-ähnlichen U87MG-Zellen reduzierte die selbstaktive TrkB-Kinase sogar die Zellwanderung. Die konstitutiven Signalwege konnten durch klinisch zugelassene, anti-tumorale Trk-Inhibitoren innerhalb von Minuten vollständig blockiert werden. Darüber hinaus zeigt diese Studie Beweise für konstitutiv-aktives, intrazelluläres TrkB im Gewebe von humanem Glioblastom Grad IV. Die Daten dieser Arbeit geben somit eine Erklärung und eine biologische Funktion für die selbst-aktive, konstitutive Signalübertragung der TrkB-Kinase-Domäne, in Abwesenheit eines Liganden.

The discovery, heterologous expression, and characterization of channelrhodopsin-2 (ChR2) – a light-sensitive cation channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii – led to the success of optogenetics as a powerful technology, first in neuroscience. ChR2 was employed to induce action potentials by blue light in genetically modified nerve cells. In optogenetics, exogenous photoreceptors are expressed in cells to manipulate cellular activity. These photoreceptors were in the beginning mainly microbial opsins. During nearly two decades, many microbial opsins and their mutants were explored for their application in neuroscience. Until now, however, the application of optogenetics to plant studies is limited to very few reports. Several optogenetic strategies for plant research were demonstrated, in which most attempts are based on non-opsin optogenetic tools. Opsins need retinal (vitamin A) as a cofactor to generate the functional protein, the rhodopsin. As most animals have eyes that contain animal rhodopsins, they also have the enzyme - a 15, 15'-Dioxygenase - for retinal production from food-supplied provitamin A (beta-carotene). However, higher plants lack a similar enzyme, making it difficult to express functional rhodopsins successfully in plants. But plant chloroplasts contain plenty of beta-carotene. I introduced a gene, coding for a 15, 15'-Dioxygenase with a chloroplast target peptide, to tobacco plants. This enzyme converts a molecule of β-carotene into two of all-trans-retinal. After expressing this enzyme in plants, the concentration of all-trans-retinal was increased greatly. The increased retinal concentration led to increased expression of several microbial opsins, tested in model higher plants. Unfortunately, most opsins were observed intracellularly and not in the plasma membrane. To improve their localization in the plasma membrane, some reported signal peptides were fused to the N- or C-terminal end of opsins. Finally, I helped to identify three microbial opsins -- GtACR1 (a light-gated anion channel), ChR2 (a light-gated cation channel), PPR (a light-gated proton pump) which express and work well in the plasma membrane of plants. The transgene plants were grown under red light to prevent activation of the expressed opsins. Upon illumination with blue or green light, the activation of these opsins then induced the expected change of the membrane potential, dramatically changing the phenotype of plants with activated rhodopsins. This study is the first which shows the potential of microbial opsins for optogenetic research in higher plants, using the ubq10 promoter for ubiquitous expression. I expect this to be just the beginning, as many different opsins and tissue-specific promoters for selective expression now can be tested for their usefulness. It is further to be expected that the here established method will help investigators to exploit more optogenetic tools and explore the secrets, kept in the plant kingdom. / Die Entdeckung, heterologe Expression und Charakterisierung von Channelrhodopsin-2 (ChR2) - einem lichtempfindlichen Kationenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii vorkommt - führte zum Erfolg der Optogenetik als leistungsfähige Technologie, zunächst in den Neurowissenschaften. ChR2 wurde eingesetzt, um in genetisch veränderten Nervenzellen durch blaues Licht Aktionspotentiale zu induzieren. Bei der Optogenetik werden exogene Photorezeptoren in Zellen exprimiert, um die zelluläre Aktivität zu manipulieren. Diese Photorezeptoren waren anfangs hauptsächlich mikrobielle Opsine. Im Laufe von fast zwei Jahrzehnten wurden viele mikrobielle Opsine und ihre Mutanten für ihre Anwendung in den Neurowissenschaften erforscht. Bis jetzt ist die Anwendung der Optogenetik in der Pflanzenforschung jedoch auf sehr wenige Arbeiten beschränkt. Es wurden mehrere optogenetische Strategien für die Pflanzenforschung aufgezeigt, wobei die meisten Versuche auf optogenetischen Werkzeugen, die nicht Opsine sind, beruhen. Opsine benötigen Retinal (Vitamin A) als Kofaktor, um das funktionelle Protein, das Rhodopsin, zu generieren. Da die meisten Tiere Augen haben, die tierische Rhodopsine enthalten, verfügen sie auch über das Enzym - eine 15, 15'-Dioxygenase - zur Retinalproduktion aus mit der Nahrung zugeführtem Provitamin A (Beta-Carotin). Höheren Pflanzen fehlt jedoch ein ähnliches Enzym, was es schwierig macht, funktionale Rhodopsine erfolgreich in Pflanzen zu exprimieren. Aber die Chloroplasten der Pflanzen enthalten reichlich Beta-Carotin. Ich führte ein Gen, das für eine 15, 15'-Dioxygenase mit einem Chloroplasten-Zielpeptid kodiert, in Tabakpflanzen ein. Dieses Enzym wandelt ein Molekül β-Carotin in zwei Moleküle all-trans-Retinal um. Nach Expression dieses Enzyms in Pflanzen wurde die Konzentration von all-trans-Retinal stark erhöht. ...