Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor bienzimático confeccionado com as enzimas glicose oxidase e frutose dehidrogenase imobilizadas em camadas auto-organizadas ou self-assembled monolayers (SAMs) de cistamina para a quantificação de açúcares em alimentos. Após o preparo do eletrodo de ouro com a SAM de cistamina, biossensores foram construídos e para obtenção de melhores respostas, condições foram otimizadas, tais como: concentração do mediador tetratiafulvaleno (TTF), porcentagem de glutaraldeído, temperatura e tempo de vida do biossensor. Com as condições estabelecidas, fez-se então, a determinação analítica da D-glicose e da D-frutose em eletrólito puro pelo método da adição de padrão e os resultados foram obtidos por voltametria cíclica e cronoamperometria. A corrente de pico de oxidação do mediador de elétrons (TTF) aumentou proporcionalmente com o aumento da concentração e não ocorreram deslocamentos nos potenciais de pico. Os limites de detecção (LD) foram encontrados por meio do desvio padrão da média aritmética de dez amperogramas do branco no potencial equivalente aos dos picos de oxidação do mediador de elétrons TTF, juntamente com o valor do coeficiente angular da curva analítica. Após a obtenção da curva analítica o biossensor foi aplicado diretamente em amostras de refrigerante dietético e não dietético, bem como em amostras de adoçantes comerciais, onde foram realizados testes comparativos da resposta dos biossensores. Para o eletrólito puro e amostras de refrigerante dietético e de adoçantes, ou seja, onde não há presença de D-glicose e D-frutose, notou-se a ausência de corrente de pico, enquanto que para as amostras de refrigerante não dietético, houve um valor significativo de resposta de corrente, indicando a presença dos açúcares em estudo. Com o propósito de verificar a influência de interferentes e o efeito de matriz, foi construída uma curva analítica para a D-glicose e para a D-frutose, em amostras de refrigerante dietético e adoçantes, onde foram obtidas as menores quantidade destes açúcares. Para o refrigerante não dietético, foi determinado o valor inicial dos açúcares presentes nas amostras. Pode-se afirmar que a utilização dos biossensores baseados nas enzimas GOx e FDH mostraram-se eficientes para a determinação dos açúcares D-glicose e D-frutose nas amostras analisadas (com diferença significativa nos valores de corrente), apresentando uma resposta rápida, além da eliminação do efeito da matriz. A utilização do mediador de elétrons (TTF) possibilitou a reação em potencial próximo de zero, diminuindo o efeito de interferentes e evitando a desnaturação das enzimas. / This work describes the preparation, characterization and application of a bienzymatic biosensor based in the glucose oxidaze and fructose dehydrogenase immobilized on self-assembled monolayer of cystamine for sugar quantification in foodstuff. After the modification of the gold electrode with cystamine, the biosensors were developed and optimized for best responses. Optimization parameters were: mediator tetrathiafulvalene (TTF) concentration, glutaraldehyde percentage, temperature and life time of the biosensor. With the best conditions established, the analytical determinations of d-glucose and d-fructose in pure phosphate buffer were conducted by the standard additions method and the results obtained by cyclic voltammetry and chronoamperometry. The oxidation peak current related to the TTF voltammetric behavior raised proportionally to the increasing concentration of d-glucose or d-fructose, in a given and constant peak potential. The methodology detection limits were found using the standard deviation of ten chronoamperograms of the blank solution, in the potential value corresponding to that of TTF oxidation, and the slope of the analytical curve. After the analytical curve acquirement the biosensor was directly applied in samples of diet or non-diet softdrinks, as well as in commercial sweeteners samples, with comparative tests of the biosensor responses. For pure electrolyte and for diet foodstuff samples, i.e., were there is not expectation for d-glucose or d-fructose existence, it was detected the lack of the voltammetric peak associated with the mediator oxidation. In non-diet samples, a pronounced voltammetric peak was obtained, testifying the presence of sugar in the electrolytes under study. The matrix effect was verified by means of an analytical curve obtained for both analytes (d-glucose and d-fructose), in diet and sweeteners samples, properly spiked with known amounts of each analyte. It can be concluded that the utilization of the biosensor based in GOx and FDH showed to be efficient for d-glucose and d-fructose determinations in the analysed samples, with a fast response time and elimination of the matrix effect. The mediator promoted the electrochemical reaction to occur in potentials very close to zero, minimizing the interferences or the enzyme denaturation.

Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor bienzimático confeccionado com as enzimas glicose oxidase e frutose dehidrogenase imobilizadas em camadas auto-organizadas ou self-assembled monolayers (SAMs) de cistamina para a quantificação de açúcares em alimentos. Após o preparo do eletrodo de ouro com a SAM de cistamina, biossensores foram construídos e para obtenção de melhores respostas, condições foram otimizadas, tais como: concentração do mediador tetratiafulvaleno (TTF), porcentagem de glutaraldeído, temperatura e tempo de vida do biossensor. Com as condições estabelecidas, fez-se então, a determinação analítica da D-glicose e da D-frutose em eletrólito puro pelo método da adição de padrão e os resultados foram obtidos por voltametria cíclica e cronoamperometria. A corrente de pico de oxidação do mediador de elétrons (TTF) aumentou proporcionalmente com o aumento da concentração e não ocorreram deslocamentos nos potenciais de pico. Os limites de detecção (LD) foram encontrados por meio do desvio padrão da média aritmética de dez amperogramas do branco no potencial equivalente aos dos picos de oxidação do mediador de elétrons TTF, juntamente com o valor do coeficiente angular da curva analítica. Após a obtenção da curva analítica o biossensor foi aplicado diretamente em amostras de refrigerante dietético e não dietético, bem como em amostras de adoçantes comerciais, onde foram realizados testes comparativos da resposta dos biossensores. Para o eletrólito puro e amostras de refrigerante dietético e de adoçantes, ou seja, onde não há presença de D-glicose e D-frutose, notou-se a ausência de corrente de pico, enquanto que para as amostras de refrigerante não dietético, houve um valor significativo de resposta de corrente, indicando a presença dos açúcares em estudo. Com o propósito de verificar a influência de interferentes e o efeito de matriz, foi construída uma curva analítica para a D-glicose e para a D-frutose, em amostras de refrigerante dietético e adoçantes, onde foram obtidas as menores quantidade destes açúcares. Para o refrigerante não dietético, foi determinado o valor inicial dos açúcares presentes nas amostras. Pode-se afirmar que a utilização dos biossensores baseados nas enzimas GOx e FDH mostraram-se eficientes para a determinação dos açúcares D-glicose e D-frutose nas amostras analisadas (com diferença significativa nos valores de corrente), apresentando uma resposta rápida, além da eliminação do efeito da matriz. A utilização do mediador de elétrons (TTF) possibilitou a reação em potencial próximo de zero, diminuindo o efeito de interferentes e evitando a desnaturação das enzimas. / This work describes the preparation, characterization and application of a bienzymatic biosensor based in the glucose oxidaze and fructose dehydrogenase immobilized on self-assembled monolayer of cystamine for sugar quantification in foodstuff. After the modification of the gold electrode with cystamine, the biosensors were developed and optimized for best responses. Optimization parameters were: mediator tetrathiafulvalene (TTF) concentration, glutaraldehyde percentage, temperature and life time of the biosensor. With the best conditions established, the analytical determinations of d-glucose and d-fructose in pure phosphate buffer were conducted by the standard additions method and the results obtained by cyclic voltammetry and chronoamperometry. The oxidation peak current related to the TTF voltammetric behavior raised proportionally to the increasing concentration of d-glucose or d-fructose, in a given and constant peak potential. The methodology detection limits were found using the standard deviation of ten chronoamperograms of the blank solution, in the potential value corresponding to that of TTF oxidation, and the slope of the analytical curve. After the analytical curve acquirement the biosensor was directly applied in samples of diet or non-diet softdrinks, as well as in commercial sweeteners samples, with comparative tests of the biosensor responses. For pure electrolyte and for diet foodstuff samples, i.e., were there is not expectation for d-glucose or d-fructose existence, it was detected the lack of the voltammetric peak associated with the mediator oxidation. In non-diet samples, a pronounced voltammetric peak was obtained, testifying the presence of sugar in the electrolytes under study. The matrix effect was verified by means of an analytical curve obtained for both analytes (d-glucose and d-fructose), in diet and sweeteners samples, properly spiked with known amounts of each analyte. It can be concluded that the utilization of the biosensor based in GOx and FDH showed to be efficient for d-glucose and d-fructose determinations in the analysed samples, with a fast response time and elimination of the matrix effect. The mediator promoted the electrochemical reaction to occur in potentials very close to zero, minimizing the interferences or the enzyme denaturation.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-10-01T23:29:45Z No. of bitstreams: 1 Aspergillus terreus isolamento identifica??o e avalia??o da capacidade catalitica na redu??o de cetonas pr? quirais.pdf: 1820055 bytes, checksum: c5c60d2c4b1c577c84c8b1baaa95660d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-01T23:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aspergillus terreus isolamento identifica??o e avalia??o da capacidade catalitica na redu??o de cetonas pr? quirais.pdf: 1820055 bytes, checksum: c5c60d2c4b1c577c84c8b1baaa95660d (MD5) Previous issue date: 2014-09-30 / The object of this inquiry is the isolation, the selection and the potential evaluation of a microorganism with biocatalytic activity in carrying out selective-stereo biorreduction of pro-chial ketones. In the research procedure, Fungi was isolated from soil samples contaminated with lead. Only one of the isolates fungi, identified as Aspergillus terreus, presented good catalytic activity in the reduction of acetophenone. The biomass was grown submerged in broth culture, inoculated with 1,1 x 103 (spores/mL of malt extract) and maintained at 30?C under orbital agitation. Morphological differences and catalytic activity were evaluated in function of the orbit of agitation during the growth process. The catalytic activity in terms of conversion of acetophenone and enantiomeric excess (S), ee_S, in 1-feniletanol, was determinate in conjunction with the growth curve of the fungus. The results were used to construct a graphic showing the variation of quality of the catalyst, according to age of biomass. Apart from acetophenone were tested o-Xacetophenone, p-Xacetophenone and m-Xacetophenone (X = methyl, methoxy, nitro, fluorine, bromine). For reaction with 24 hours growing cells (30?C; 150rpm/r = 50mm), the conversions were between 27% and 97% with ee_S between 41% and 83%. For reactions with cells in suspension in buffered medium (pH = 4.5 ? 6,5) was decrease in activity/selectivity at pH above 5.5. The kinetics of conversion was evaluated for biomasses with different ages and for various concentrations of acetophenone. An amount between 100mg and 200mg of biomass (dry mass) with 168 hours of culture can convert 100mg of acetophenone to 1(S)-feniletanou ee_S (91%) with 98% yield in 72 hours of reaction (93% at 48 hours). The development of this process described above, constitutes the body of this thesis. / O objetivo desta pesquisa ? o isolamento, a sele??o e a avalia??o de um microorganismo com atividade biocatalisadora na biorredu??o estereoseletiva de cetonas pro-quirais. No procedimento de investiga??o, fungos foram isolados de amostras de solo contaminadas com chumbo. Apenas um dos fungos isolados, identificado geneticamente como Aspergillus terreus, apresentou boa atividade catal?tica na redu??o de acetofenona. A biomassa foi cultivada submersa no caldo de cultura, inoculado com 1,1x103 (esporos/mL de extrato de malte) e mantido a 30? sob agita??o orbital. Diferen?as morfol?gicas e de atividade catal?tica foram avaliadas em fun??o da ?rbita de agita??o durante o crescimento. A atividade catal?tica, em termos de convers?o da acetofenona e do excesso enantiom?rico (S), ee_S, no 1-feniletanol, foi determinada em conjunto com a curva de crescimento do fungo. Os resultados foram usados para construir um gr?fico mostrando a varia??o da qualidade do catalisador em fun??o da idade da biomassa. Al?m de acetofenona, foram testadas o-Xacetofenona, p-Xacetofenona e m-Xacetofenona (X=metil, metoxi, nitro, fl?or, bromo). Para 24 horas de rea??o com c?lulas em crescimento (30?C; 150rpm/r = 50mm), as convers?es ficaram entre 94 e 100%, com ee_S ? 98% para acetofenona e para acetofenonas orta ou meta substitu?das. Com substituintes na posi??o para, a convers?o ficou entre 27% e 97%, com ee_S entre 41% e 83%. Para rea??es com c?lulas em suspens?o em meio tamponado (pH = 4,5 ? 6,5), houve queda na atividade/seletividade em pH acima de 5,5. A cin?tica de convers?o foi avaliada para biomassas com idades distintas e para v?rias concentra??es de acetofenona. Uma quantidade entre 100mg e 200mg de biomassa (massa seca) com 168 horas de cultura, pode converter 100mg de acetofenona a 1(S)-feniletanol (ee_S 91%), com 98% de rendimento em 72 horas de rea??o (93% em 48 horas). O desenvolvimento desse processo, acima descrito, constitui o corpo desta Tese.

<p>Tri soja gljive bukovače, P. ostreatus NS 77, P. ostreatus NS 355 i P. ostreatus 244,<br />gajena su na supstratima četiri biljne vrste, p&scaron;enica, kukuruz, soja i suncokret, kao<br />samostalni supstrati i u kombinaciji sa p&scaron;eničnom slamom. Nakon plodono&scaron;enja<br />vr&scaron;ena su ispitivanja odgajivačkih, morfolo&scaron;kih, hemijskih, svojstva gljiva, kao i<br />hemijske i mikrobiolo&scaron;ke&nbsp;&nbsp;&nbsp; sirovim supstratima u odnosu na sadržaj celuloze u<br />supstratima nakon plodono&scaron;enja sojeva, dok je kod sadržaja pepela obrnuto, u sirovim<br />supstratima je niži u odnosu na supstrate nakon plodono&scaron;enja. Koncentracija ukupnog<br />broja mikroorganizama, brojnost amonifikatora i brojnost saprofitnih gljiva na<br />nesterilisanim supstratima je niža nego na iskori&scaron;tenim supstratima. Dehidrogenazna<br />aktivnost&nbsp; je najvi&scaron;a na supstratima nakon plodono&scaron;enja soja NS 244, dok kod<br />enzimskog kompleksa celulaza varira u zavisnosti od soja i supstrata Kod sva tri soja<br />maksimalni prinosi su bili na supstratu Soja (S5), a minimlni na supstratu P&scaron;enica<br />(S1). Na osnovu morfolo&scaron;kih osobine konstatovana je velika varijabilnist između<br />sojeva. Supstrat Kukuruz (S6) se pokazao kao najbolji, sa aspekta vodnog režima, dok<br />se Suncokret (S7) pokazao kao najlo&scaron;iji. Na supstratu Kukuruz (S6) je najvi&scaron;i, a na<br />supstratu P&scaron;enica (S1) je najniži sadržaj pepela. Sadržaj natrijuma u nožici je veći od<br />sadržaja u &scaron;e&scaron;iru, &scaron;to je obrnuto u odnosu na druge mikroelemente i makroelemente.<br />Sadržaj celuloze je vi&scaron;i u svim&nbsp; sirovim supstratima, dok&nbsp; je kod sadržaja pepela<br />obrnuto. Brojnost svih mikroorgnaizma na nesterilisanim supstratima je niža nego na<br />iskori&scaron;tenim supstratima.&nbsp; Dehidrogenazna&nbsp; je najvi&scaron;a na supstratima nakon<br />plodono&scaron;enja soja NS 244, dok kod enzimskog kompleksa celulaza varira u zavisnosti<br />od soja i supstrata.</p> / <p>Three strains of oyster mushroom (P. ostreatus NS 77, NS 355, and 244) were grown on substrates made from four crops (wheat, maize, soybean, and sunflower), as individual substrates or in combination with wheat straw. After fruit maturity,&nbsp; mushroom growing, morphological, and chemical properties were analysed, as well as chemical and microbiological analyses of fresh and used substrates. All three strains showed maximum yields on soybean substrate (S5), and minimum yields on wheat substrate (S1). A large variability among the strains was observed based on the morphological properties. The strain NS 77 has caps of the smallest weight,&nbsp; width and length, the largest number of fruiting bodies, and the longest stalks. The&nbsp; strain NS 244 have caps of the largest weight, width and length, the lowest number of fruiting bodies and stalk length, but the largest width of the stalks. Regarding water regime, maize substrate (S6) was the best, while sunflower (S7) was the poorest. Ash content was the highest in maize substrate (S6) and the lowest in wheat&nbsp; substrate (S1). Potassium content in the stalk was higher than in the cap, which is opposite from other micro- and macro elements. Cellulose content was higher in all fresh substrates than in the used substrates after the strains have fruited, while ash content was higher in the used substrates. Concentration of total number of microorganisms, abundance of ammonifiers and saprophytic fungi in the unsterilized substrates were lower than in the used ones. Dehydrogenase activity was the highest in substrates after fruiting of NS 244, while cellulose enzyme complex varied regarding the strain and substrate.</p>