Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2016. / Aspergillus terreus é um fungo filamentoso que produz numerosas enzimas com uma vasta gama de aplicações biotecnológicas. Este estudo tem como objetivo caracterizar a produção das enzimas lignocelulolíticas de A. terreus, estirpe BLU24, crescido em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais (bagaço de cana de açúcar, casca do grão de soja e piolho de algodão sujo) e analisar a expressão diferencial desses genes em resposta a essas fontes de carbono. A crescente utilização de resíduos como bagaço de mandioca, bagaço de cana de açúcar, polpa de beterraba, polpa de maçã, farelo de trigo, etc evidencia que diferentes áreas da indústria utilizam estes resíduos como matéria prima para a produção de etanol, enzimas, cogumelos, ração animal, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários, produtos farmacêuticos. A. terreus BLU24 foi crescido à 28 ° C sob agitação (120rpm) ao longo de um período de dez dias. O secretoma foi analisado de acordo com as atividades enzimáticas de xilanase, endoglucanase, mananase, pectinase e FPase identificadas de acordo com o método DNS. Dentre todas as atividades estudadas a que foi mais expressiva foi à atividade relacionada com proteínas do tipo xilanases. A atividade de xilanase após cultivo no meio contendo piolho de algodão sujo atingiu um valor máximo de 0,935 UI.mL-1 no sexto dia de cultivo, já no meio com bagaço de cana de açúcar este valor foi de 1,017 UI.mL-1 no sétimo dia e no meio contendo casca do grão da soja a atividade máxima foi também no sétimo dia, atingindo um valor de 1,019 UI.mL-1. A maior atividade de CMCase foi no bagaço de cana de açúcar que atingiu um valor máximo no quarto dia de cultivo (0,275 UI.mL-1). Já a maior atividade de pectinase foi no substrato casca do grão da soja no terceiro dia de cultivo (0,494 UI.mL-1) e a maior atividade de FPase foi também na casca do grão da soja no sétimo dia de cultivo (0,494 UI.mL-1). O preparo das bibliotecas de cDNA de mRNA do fungo A. terreus foi conduzida utilizando o kit RNA TruSeq Kit v2 (® Illumina, Inc.). A. terreus também mostrou um desempenho significativo como produtor de holocellulases. As bibliotecas de cDNA sequenciadas produziu uma média total de 2,7 GB, com cerca de 27 milhões de leituras. Aproximadamente 81% das leituras exibiram uma boa qualidade (Q> = 30). A caracterização deste transcritoma oferece a descoberta de genes promissores para aplicação em diferentes áreas da indústria biotecnológica. As análises de RNA-seq do isolado A. terreus BLU24 cultivado em bagaço de cana de açúcar identificaram um total de 102 genes CAZy, já em casca do grão da soja o total de genes CAZy foi 159 (padj <0.01). Tanto no tratamento contendo bagaço de cana de açúcar quanto no tratamento contendo casca do grão da soja comparado a glicose, as famílias CAZy mais abundantes foram a GH3 e GH43. Análises das famílias glicosil hidrolases revelou regulação positiva de 6 genes que codificam proteínas da família GH5, 7 genes da família GH43 e 8 genes da família GH3 no tratamento com bagaço de cana de açúcar contra a glicose. Similarmente no tratamento com casca do grão da soja contra a glicose foram relatados 7 genes que codificam proteínas da família GH5, 6 genes da família GH10, 11 genes da família GH3 e 12 genes da família GH43 (p<0,01). Os genes que codificam proteínas relacionadas com a degradação da biomassa são expressos nas duas fontes de carbono estudadas, porém alguns desses genes com expressão diferencial ocorreram apenas no bagaço de cana de açúcar ou apenas na casca do grão da soja nos tempos de 36 e 48 horas. O estudo do transcritoma global do fungo A. terreus BLU24 identificou uma grande quantidade de genes que codificam enzimas utilizadas na degradação da parede celular vegetal e também fatores de transcrição que são importantes neste processo. A. terreus é conhecido por ser um bom produtor de enzimas envolvidas na degradação da biomassa vegetal e uma característica importante deste fungo é o fato dele ser termofílico e com isso poder produzir enzimas termotolerantes com diferentes aplicações na indústria têxtil, biocombustível, papel, alimento e etc. / Aspergillus terreus is a filamentous fungus that produces numerous enzymes with a wide range of biotechnological applications. The aim of this study was to characterize the production of lignocellulolytic enzymes in A. terreus strain BLU 24 following culture in growth media containing agro-industrial residues (sugar cane bagasse, soy bean hulls and cotton louse) and analyze differential gene expression in response to carbon source. Given the abundance of agricultural waste materials such as cassava bagasse, sugar cane bagasse, sugar beet pulp, apple pulp and wheat bran, numerous applications are under development using such residues as raw material. These include utilization in production of ethanol, industrial enzymes, edible mushrooms, animal feed, organic acids, amino acids, secondary metabolites, and pharmaceutical products. A. terreus BLU 24 was grown at 28 ° C under agitation (120rpm) over a period of ten days. The secretome was analyzed for xylanase, endoglucanase, mannanase, pectinase and FPase enzyme activities, according to the DNS method. Among all the activities studied, most significant enzyme activities were related to xylanase, with activity reaching a maximum of 0.935 UI.mL-1 after six days incubation in minimal growth medium plus cotton louse as sole carbon source, 1.017 UI.mL-1 after seven days incubation with sugarcane bagasse as carbon source, and 1,019 UI.mL-1after seven days incubation with soybean hulls as carbon source. Most CMCase activity was observed on sugarcane bagasse, with a peak in activity by the fourth day of cultivation (0.275 UI.mL-1). Pectinase activity was higher on soybean hulls as substrate after cultivation during three days (0.494 UI.mL-1) , with highest FPase activity observed on soybean hulls in seven day old cultures (0.494 IU. ml- 1).Characterization of the fungal transcriptome was conducted to identify candidate genes for application in different areas of the biotechnology industry. cDNA libraries were prepared from A. terreus BLU 24 mRNA following 36 h and 48 h growth on sugarcane bagasse and soybean hull-derived carbon sources. Illumina Hiseq sequencing of cDNA libraries produced a mean total of 2.7 GB, equaling approximately 27 million reads. A total of 81% of the reads exhibited good quality (Q> = 30). RNA-seq analysis of A. terreus BLU 24 identified a total of 102 expressed cazy genes following growth on sugarcane bagasse with 159 identified following growth on media with soybean hull carbon source (padj <0.01). For both carbon source treatments, compared to glucose, the most abundant Cazy gene families were GH3 and GH43. Analysis of the glycosyl hydrolase family revealed up-regulation of six genes encoding GH5, seven GH43 genes and eight GH3-encoding genes following cultivation on sugarcane bagasse against glucose. Similarly, cultivation on soybean hulls against glucose revealed seven genes that encode protein family GH5, six genes encoding GH10, 11 genes encoding GH3 and 12 genes encoding the GH43 family (p<0,01). Genes encoding proteins related to the degradation of biomass were expressed during growth on the two carbon sources studied, with differential expression in relation to glucose occuring for different sets of genes in sugarcane bagasse and soybean hulls at each growth period of 36 and 48 hours. This global analysis of the transcriptome for the fungus A. terreus BLU 24 following cultivation on lignocellulosic carbon sources enabled identification of a number of genes encoding enzymes and transcription factors involved in the degradation of the plant cell wall. A. terreus is recognized as a promising fungal species for production of enzymes involved in the degradation of plant biomass. Given that this fungus is also able to produce thermophilic enzymes, considerable potential exists in the application of the characterized candidate genes in different applications in the textile, biofuel, paper, food and feed industries.

A enzima L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase, E.C. 3.5.1.1) é uma das drogas mais utilizadas no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. A enzima catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônia. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, dependendo do aminoácido presente no plasma para a síntese proteica. A redução dos níveis plasmáticos de asparagina inibe a síntese de proteínas e depois a síntese de RNA e DNA das células leucêmicas levando-as a morte por apoptose. A cepa de Aspergillus terreus (PC-1.7.A) utilizada nesse trabalho foi isolada de solo e produziu altas concentrações de L-asparaginase. O objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar, conjugar a enzima e avaliar sua atividade citotóxica em linhagens de células tumorais in vitro. Para a purificação da enzima foram utilizados métodos cromatográficos de interação por troca iônica (DEAE Sepharose) e por gel filtração em diferentes fluxos (Sephacryl S-200HR). A enzima pura foi conjugada com metóxi polietilenoglicol e manteve 93% da atividade inicial. A enzima presente no fluido da cultura dialisado e concentrado manteve sua atividade por até 90 dias a 5ºC. Composta por uma subunidade com massa molecular de 125 kDa a L-asparaginase purificada de A. terreus apresentou atividade catalítica ótima em pH 9,5 e 40ºC e foi estável nessa temperatura por pelo menos 120 minutos. A enzima pura e pura-conjugada apresentou valores de Km de 2,42 e 2,51 mmol/L e Vmax de 11,91 e 12,08 umol.min-1.mg-1, respectivamente. A enzima pura-conjugada perdeu metade de sua atividade em trinta minutos quando incubada com enzimas proteolíticas, enquanto que a enzima pura perdeu metade de sua atividade em cinco minutos sob as mesmas condições. A L-asparaginase pura na concentração de 200 ug/mL reduziu em 50% as células viáveis das linhagens tumorais HL-60 e RS4;11 nos tempos de incubação de 72 e 96 horas, respectivamente, sob as mesmas condições a enzima pura não apresentou atividade citotóxica contra a linhagem controle (PBMC). / The enzyme L-asparaginase (L-asparagin amino hydrolase, E.C. 3.5.1.1) is one of the most commonly used drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. This enzyme catalyzes a hydrolysis of amino acid asparagine into aspartic acid and ammonia. Some tumour cell lines are unable to produce asparagine depending on the amino acid in plasma for protein synthesis. Reduced levels of plasma asparagine inhibit protein synthesis and later synthesis of RNA and DNA in leukemic cells causing them to die by apoptosis. The strain of Aspergillus terreus (PC-1.7.A) in this work was isolated from soil and produced high concentrations of L-asparaginase. The aim of this study was to purify, characterize, conjugate the enzyme and to evaluate its cytotoxic activity in tumour cell lines in vitro. Enzyme purification was achieved by applying chromatography methods of ion exchange (DEAE Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200HR) at different flows. The pure enzyme was conjugated with methoxy polyethylene glycol and kept 93% of initial activity. The enzyme present in dialysed and concentrated culture fluid maintained its activity for up to 90 days at 5°C. Composed of a subunit with molecular mass of 125 kDa, L-asparaginase purified from A. terreus showed optimum catalytic activity at pH 9.5 and 40°C and was stable at this temperature for at least 120 minutes. The pure and pure-conjugated enzymes showed Km values of 2.42 and 2.51 mmol/L and Vmax of 11.91 and 12.08 umol.min-1.mg-1 respectively. The pure-conjugated enzyme lost half of its activity in thirty minutes when incubated with proteolytic enzymes, while pure enzyme lost half of its activity in five minutes under same conditions. Pure L-asparaginase at a concentration of 200 ug/mL reduced by 50% number a viable cells in tumour cell lines HL-60 and RS4;11 in incubation times of 72 and 96 hours, respectively. Under same conditions pure enzyme showed no cytotoxic activity against control cell line.

A enzima L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase, E.C. 3.5.1.1) é uma das drogas mais utilizadas no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. A enzima catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônia. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, dependendo do aminoácido presente no plasma para a síntese proteica. A redução dos níveis plasmáticos de asparagina inibe a síntese de proteínas e depois a síntese de RNA e DNA das células leucêmicas levando-as a morte por apoptose. A cepa de Aspergillus terreus (PC-1.7.A) utilizada nesse trabalho foi isolada de solo e produziu altas concentrações de L-asparaginase. O objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar, conjugar a enzima e avaliar sua atividade citotóxica em linhagens de células tumorais in vitro. Para a purificação da enzima foram utilizados métodos cromatográficos de interação por troca iônica (DEAE Sepharose) e por gel filtração em diferentes fluxos (Sephacryl S-200HR). A enzima pura foi conjugada com metóxi polietilenoglicol e manteve 93% da atividade inicial. A enzima presente no fluido da cultura dialisado e concentrado manteve sua atividade por até 90 dias a 5ºC. Composta por uma subunidade com massa molecular de 125 kDa a L-asparaginase purificada de A. terreus apresentou atividade catalítica ótima em pH 9,5 e 40ºC e foi estável nessa temperatura por pelo menos 120 minutos. A enzima pura e pura-conjugada apresentou valores de Km de 2,42 e 2,51 mmol/L e Vmax de 11,91 e 12,08 umol.min-1.mg-1, respectivamente. A enzima pura-conjugada perdeu metade de sua atividade em trinta minutos quando incubada com enzimas proteolíticas, enquanto que a enzima pura perdeu metade de sua atividade em cinco minutos sob as mesmas condições. A L-asparaginase pura na concentração de 200 ug/mL reduziu em 50% as células viáveis das linhagens tumorais HL-60 e RS4;11 nos tempos de incubação de 72 e 96 horas, respectivamente, sob as mesmas condições a enzima pura não apresentou atividade citotóxica contra a linhagem controle (PBMC). / The enzyme L-asparaginase (L-asparagin amino hydrolase, E.C. 3.5.1.1) is one of the most commonly used drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. This enzyme catalyzes a hydrolysis of amino acid asparagine into aspartic acid and ammonia. Some tumour cell lines are unable to produce asparagine depending on the amino acid in plasma for protein synthesis. Reduced levels of plasma asparagine inhibit protein synthesis and later synthesis of RNA and DNA in leukemic cells causing them to die by apoptosis. The strain of Aspergillus terreus (PC-1.7.A) in this work was isolated from soil and produced high concentrations of L-asparaginase. The aim of this study was to purify, characterize, conjugate the enzyme and to evaluate its cytotoxic activity in tumour cell lines in vitro. Enzyme purification was achieved by applying chromatography methods of ion exchange (DEAE Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200HR) at different flows. The pure enzyme was conjugated with methoxy polyethylene glycol and kept 93% of initial activity. The enzyme present in dialysed and concentrated culture fluid maintained its activity for up to 90 days at 5°C. Composed of a subunit with molecular mass of 125 kDa, L-asparaginase purified from A. terreus showed optimum catalytic activity at pH 9.5 and 40°C and was stable at this temperature for at least 120 minutes. The pure and pure-conjugated enzymes showed Km values of 2.42 and 2.51 mmol/L and Vmax of 11.91 and 12.08 umol.min-1.mg-1 respectively. The pure-conjugated enzyme lost half of its activity in thirty minutes when incubated with proteolytic enzymes, while pure enzyme lost half of its activity in five minutes under same conditions. Pure L-asparaginase at a concentration of 200 ug/mL reduced by 50% number a viable cells in tumour cell lines HL-60 and RS4;11 in incubation times of 72 and 96 hours, respectively. Under same conditions pure enzyme showed no cytotoxic activity against control cell line.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-04T12:53:05Z No. of bitstreams: 1 DielledeOliveiraMottaDissertacao2014.pdf: 3579770 bytes, checksum: 082642eeca29a044c3ecc5a70434c6bb (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-04T12:53:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DielledeOliveiraMottaDissertacao2014.pdf: 3579770 bytes, checksum: 082642eeca29a044c3ecc5a70434c6bb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T12:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DielledeOliveiraMottaDissertacao2014.pdf: 3579770 bytes, checksum: 082642eeca29a044c3ecc5a70434c6bb (MD5) Previous issue date: 2014-01-01 / The identification of filamentous fungiis traditionally based on morphological and biochemical criteria which are time demanding and for which results can be inaccurate. This fact motivated the evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization ??? time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for the identification of 36 brazilian isolates of Aspergillus terreus. The species is important worldwide due to its ability to produce lovastatin, a drug extremely successful in decreasing plasmatic cholesterol and consequently decreasing the risk of cardiovascular disease, main cause of death worldwide. Prior to MS analysis, the sequencing of internal transcribed spacer (ITS) allowed the identity confirmation of 94% of samples when compared GenBank database. First of all with the aim to compare the molecular biological technique with identification for MALDI-TOF was evaluated the influence of important factors in the quality of mass spectrums and then selected those more suitable to the identification of the specie. This enabled to characterize the proteic profile 30 of the 36 isolates. Nevertheless only 20% of brazilian isolates were identified as A. terreus when compared at the almost 4000 organisms of Biotyper database which may be attributed to the low representation of the specie. The results show that there are strong evidences that the technique is suitable which corroborates with this is: the similar pattern in the dendograms generated for each methodology, the ability to distinguish of the isolates comparatively higher by MALDI-TOF and the proven effectiveness of the technique evaluated by dark tests from the construction of a personal library. For these reasons the use of MALDI-TOF in the identification of isolates of A. terreus in replacing the conventional techniques is promising nevertheless requires optimizations regarding standardizing the processing of samples and inclusion of more reference spectra in the specie in database. / A identifica????o de fungos filamentosos ?? tradicionalmente baseada em crit??rios morfol??gicos e bioqu??micos que demandam tempo e cujos resultados podem ser imprecisos. Isso motivou a avalia????o do uso da t??cnica alternativa de espectrometria de massa por ioniza????o e dessor????o a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) para a identifica????o de 36 isolados brasileiros de Aspergillus terreus. A esp??cie ?? importante mundialmente, dentre outros motivos, devido ?? habilidade de produzir lovastatina, uma droga bem sucedida na redu????o do colesterol plasm??tico com consequente redu????o do risco de doen??as cardiovasculares, principal causa mundial de ??bitos. Antes das an??lises por MALDI-TOF, o sequenciamento do espa??ador interno transcrito (ITS) permitiu a confirma????o da identidade de 94% (34/36) dos isolados quando comparado ?? base de dados GenBank. Inicialmente de forma a comparar a t??cnica de biologia molecular com a identifica????o por MALDI-TOF foi avaliado a influ??ncia de importantes fatores na qualidade dos dados e selecionado aqueles que mais se adequavam a identifica????o da esp??cie. Isso permitiu caracterizar quanto ao perfil proteico 30 dos 36 isolados. Contudo, somente 20% dos isolados brasileiros foram identificados como A. terreus quando comparado aos quase 4000 organismos da base de dados Biotyper o que pode ser atribu??do ?? baixa representatividade da esp??cie. Segundo os resultados existem fortes evid??ncias de que a t??cnica ?? adequada o que corrobora com isso ?? o padr??o semelhante observado nos dendrogramas gerados por cada uma das metodologias, a capacidade de distin????o dos isolados comparativamente maior por MALDI e a comprovada efic??cia da t??cnica avaliada pelo teste ??s escuras a partir da constru????o de uma biblioteca pr??pria. Por essas raz??es o emprego de MALDI-TOF na identifica????o de isolados de A. terreus em substitui????o as t??cnicas tradicionais ?? promissora, por??m requer otimiza????es no que diz respeito ?? padroniza????o quanto ao processamento das amostras e o incremento de mais espectros de refer??ncia da esp??cie no banco de dados.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-13T19:56:49Z No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T16:39:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T16:39:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Metabólitos secundários (MS) são moléculas heterogêneas de baixo peso molecular e, alternativamente aos metabólitos primários, não estão diretamente envolvidas no crescimento do organismo que as produz. Entre os microrganismos produtores de MS destacam-se os fungos filamentosos do gênero Aspergillus, abrangendo diversas espécies com estilos de vida variados e produzindo inúmeros compostos de importância para os homens, animais e plantas. A espécie A. terreus é produtora de diversos MS, entre eles destaca-se a lovastatina, fármaco da classe das estatinas, que são mundialmente utilizadas para a redução dos níveis de colesterol. Visando a bioprospecção de cepas de A. terreus produtoras de lovastatina utilizamos a genômica comparativa para detalhar a estrutura e variabilidade dos genes responsáveis por sua biossíntese. Oito cepas de A. terreus isoladas no Brasil foram submetidas a sequenciamento de segunda geração utilizando a plataforma Illumina. Os dados resultantes foram mapeamentos contra o genoma de referência da espécie (cepa NIH 2624) e observou-se uma conservação de 86% de todo genoma entre as cepas. No entanto, grandes regiões com tamanho maior que 10 kb apresentaram cobertura anômala, e posteriormente verificou-se que se tratava de variantes estruturais (grandes indels) nos genomas das cepas, inclusive no agrupamento gênico de biossíntese (BCG) de lovastatina. As variantes estruturais dentro deste loco foram validadas experimentalmente via ensaios de PCR e a ausência de genes essenciais à biossíntese da lovastatina explica o fenótipo não produtor em algumas cepas. A observação variabilidade genômica entre as cepas motivou o desenvolvimento de uma nova metodologia para detecção de BCGs em geral. Esta baseia-se na estrutura de grafos de Bruijn coloridos e pode ser aplicada diretamente nos dados brutos de sequenciamento, sem necessitar montagens genômicas de alta qualidade. Com esta abordagem foi possível identificar os limites gênicos dos agrupamentos de biossíntese dos metabólitos acetilaranotina, terretonina e outros. As análises de genômica comparativa neste estudo apontam as relevantes diferenças na composição gênica de indivíduos da mesma espécie, as quais podem ser correlacionadas com fenótipos de interesse biotecnológico. Ademais, ressaltam a complexa história evolutiva dos fungos e a plasticidade de seus genomas. Assim como acontece em muitos procariotos, os genomas dos fungos filamentosos devem ser representados por um pan-genoma. / Secondary metabolites (SM) are a heterogeneous class of low molecular weight compounds not directly involved in the growth of the producing organism. Among the SM producing microorganisms stands out the genus Aspergillus, a diverse group of filamentous fungi of medical and biotechnological relevance. The species A. terreus is known to produce several metabolites, noticeably lovastatin, belonging to the statins class with worldwide application as cholesterol lowering drugs. Aiming at the bioprospection of lovastatin producing strains we employed a comparative genomics study to pinpoint the structure and variability of the genes involved in its biosynthesis. Eight A. terreus strains, isolated in different locations, were sequenced by second generation genome sequencing platform Illumina. The resulting reads were mapped against the reference genome of A. terreus (strain NIH 2624) unveiling a 86% genome-wide conservation between the strains. However, large blocks spanning over 10 kb showed anomalous mapping coverage depth, and further analyses showed that these were structural variants (large indels) occurring in the genome of the strains. Strikingly, some strains exhibited structural variations in the lovastatin biosynthetic gene cluster (BCG), further validated by PCR assays, which offers a plausible explanation for the non-producing phenotype observed in some strains. The observation of strain-specific genome variation prompted the development of a new BCG detection methodology based on colored de Bruijn graphs and directly applied to raw sequencing data without the necessity of a high quality reference genome. This approach uncovered the presence and the gene boundaries of several BCGs in our study, such as the biosynthetic clusters for the metabolites acetilranotin, terretonin and others. The comparative genomic analyses in this study highlight the gene composition differences among individuals of the same species and the correlation with biotechnological relevant phenotypes. Moreover, underlies the complex fungal evolutive pathways and the plasticity of microbial genomes.

Depuis quelques années, un des défis de la Recherche est de valoriser les co-produits agro-industriels. Une des voies permettant la valorisation de ces « déchets » est la fermentation en milieu solide.Le but de ce travail est de produire de l'acide itaconique par des souches d'Aspergilli (Aspergillus itaconicus et Aspergillus terreus) à partir de ressources renouvelables. Le substrat choisi dans cette étude est le son de blé, coproduit largement disponible en Champagne-Ardenne.L'acide itaconique a été classé dans le TOP 12 des molécules plateformes par le Department Of Energy Américain. Ces molécules plateformes peuvent être produites à partir de biomasse ligno-cellulosique et peuvent être utilisées à la place de molécules d'origine pétrochimique.Dans notre étude, nous n'avons pas mis en évidence de production d'acide itaconique par la souche Aspergillus terreus NRRL 1960 mais nous avons observé, pour la première fois, la production d'acide fumarique par fermentation en milieu solide. L'acide fumarique est tout aussi intéressant que l'acide itaconique puisqu'il fait également partie du TOP 12 des molécules plateformes. La production maximale obtenue est de 0,44 mg/g de matière sèche par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70% et à pH 3, après 5 jours d'incubation à 30°C.De plus, nous avons montré qu'Aspergillus itaconicus NRRL 161 est capable de produire 6,77 mg d'acide itaconique/g de matière sèche par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400 g/L et à pH 3, après 4 jours d'incubation à 30°C.Dans une dernière partie, nous avons mis en évidence, chez Aspergillus itaconicus NRRL 161, la présence potentielle du gène codant pour la Cis-Aconitic acid Decarboxylase, enzyme clé dans la production d'acide itaconique. / Since a few years, one of research's challenges is to valorise agro-industrial by-products. One of the ways permitting the valorisation of these “wastes” is solid-state fermentation.The aim of this work is to produce itaconic acid with Aspergilli (Aspergillus itaconicus and Aspergillus terreus) strains from renewable resources. The chosen substrate in this study is wheat bran, by-product widely available in Champagne-Ardenne.Itaconic acid is classified among the TOP 12 of building blocks by the American Department Of Energy. Building blocks can be produced from ligno-cellulosic biomass and can be used instead of petrochemical-based molecules.In our study, we have not highlighted itaconic acid production by Aspergillus terreus NRRL 1960, but we have observed fumaric acid production by solid state fermentation. Fumaric acid is as interesting as itaconic acid since it also belongs to the TOP 12 of building blocks. Maximal production of fumaric acid is 0.44 mg/g dry matter by solid-state fermentation on wheat bran moistened at 70% and at pH 3, after 5 days of incubation at 30°C.Furthermore, we have shown that Aspergillus itaconicus NRRL 161 is able to produce 6.77 mg of itaconic acid/g dry matter by solid state fermentation on wheat bran moistened at 60% with sucrose solution at 400 g/L and at pH 3, after 4 days of incubation at 30°C.In a last part, we have highlighted, in Aspergillus itaconicus NRRL 161, the potential presence of the Cis-Aconitic acid Decarboxylase encoding gene, key enzyme in itaconic acid production.

Production of xylanase and itaconic acid (IA) from Aspergillus terreus NRRL 1960 from agricultural residues was investigated in this study. Two different media were tested and the medium having itaconic acid inducing capacity was chosen for further studies due to its high xylanase and IA production capacity. The best xylan concentration was found as 2% (w/v). Addition of commercial xylanase to production culture resulted in higher initial simple sugar concentration which increased IA production slightly but decreased xylanase production. Among tested agricultural residues / corn cob, cotton stalk and sunflower stalk, the highest xylanase production was obtained on corn cob. Increasing the corn cob concentration and applying wet heat pretreatment increased the xylanase production level. In a two-step fermentation process, 70000 IU/L xylanase production was achieved in a medium containing 7% wet heat treated corn cob followed by 17 g/L IA production in a medium containing 10% glucose. Molecular weight and isoelectric point of xylanase were found as 19 kDa and pH 9.0, respectively. The enzyme was optimally active at 50&deg / C and pH 6.5-7.0. Kinetic experiments at 50&deg / C and pH 7.0 resulted in apparent Km and Vmax values of 2.5&plusmn / 0.05 mg xylan/mL and 50.2&plusmn / 0.4 IU/&micro / g protein, respectively. The major products of birchwood xylan hydrolysis were determined by thin layer chromatography as xylobiose and xylotriose. These findings indicate that the enzyme could be advantageous for use in different industrial applications due to its low molecular weight and its potential use for xylooligosaccharide production.

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-24Bitstream added on 2014-08-27T15:57:05Z : No. of bitstreams: 1 000778079.pdf: 2078209 bytes, checksum: f253bd93ea489feb471ed9cad8e18c13 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-?-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades ?-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por ?-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de ?-glucanos... / The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-?-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has ?-glucanase and xiloglucanase activities, preferring ?-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of ?-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fábio Márcio Squina / Banca: Roberto da Silva / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Leandro Cristante de Oliveira / Banca: André Ricardo de Lima Damásio / Resumo: A conversão enzimática dos polissacarídeos da biomassa é um fator chave no desenvolvimento de bioetanol de segunda geração. A recalcitrância da lignocelulose para a degradação enzimática e o custo elevado de enzimas hidrolíticas necessárias para a despolimerização de polissacarídeos encontrados na parede celular da planta são barreiras significativas para a produção em larga escala e para a comercialização de biocombustíveis e bioprodutos derivados da biomassa vegetal. A fim de aumentar rapidamente a produção de biocombustíveis celulósicos e bioprodutos, existe a necessidade de desenvolver coquetéis enzimáticos mais eficientes e de menor custo para a conversão de biomassa em açúcares fermentáveis. Nesse contexto, o estudo de enzimas degradadoras da parede celular é essencial. No presente trabalho a enzima endo-1,4-β-D-glucanase de Aspergillus terreus (ATEG_09894) foi clonada para expressão em A. nidulans. O teste de expressão mostrou a expressão solúvel da proteína. Sua identidade foi confirmada por espectrometria de massas. O pH ótimo e a temperatura ótima para sua atividade enzimática foram de 5,0 e 55ºC, respectivamente. A desnaturação térmica mostrou que a partir de 60ºC a enzima começa a perder estrutura. Interessantemente a enzima apresenta atividades β-glucanase e xiloglucanase, tendo preferência por β-glucano. A caracterização estrutural mostrou que ATEG_09894 foi expressa corretamente e os resultados de SEC e SAXS mostram que a proteína é monomérica em solução e o modelo de sua estrutura tridimensional indica que a superfície eletrostática da molécula contribui para um monômero estável. Os dados apresentados nesse trabalho são importantes pois identificam peculiaridades da enzima ATEG_09894, que atua na degradação da biomassa, sugerem os determinantes de sua seletividade enzimática e apresenta a degradação, não usual, de β-glucanos... / Abstract: The enzymatic conversion of polysaccharides from biomass is a key factor in the development of second generation bioethanol. The recalcitrance of lignocellulose to enzymatic degradation and the high cost of hydrolytic enzymes necessary for the depolymerization of polysaccharides found in plant cell wall are significant barriers to large-scale production and commercialization of biofuels and bioproducts derived from plant biomass. In order to rapidly increase the production of biofuel and byproducts cellulosic, a need exists to develop more efficient and lower cost enzymatic cocktails for the conversion of biomass into fermentable sugars. In this context, the study of cell wall degrading enzymes is essential. In this work the enzyme endo-1,4-β-D-glucanase from Aspergillus terreus (ATEG_09894) was cloned for expression in A. nidulans. The expression test showed the expression of a soluble protein. Its identity was confirmed by mass spectrometry. The optimum pH and optimum temperature for the enzyme activity were 5.0 and 55 ºC, respectively. The thermal denaturation showed that above 60 ºC the enzyme starts to lose structure. Interestingly, the enzyme has β-glucanase and xiloglucanase activities, preferring β-glucan. Structural characterization showed that ATEG_09894 was expressed correctly folded and the results of SEC and SAXS show that the protein is monomeric in solution and the model of its three dimensional structure indicates that the electrostatic surface molecule contributes to a stable monomer. The data presented in this study are important because they identify peculiarities of ATEG_09894, which acts in the degradation of biomass, suggest the determinants of its selectivity and enzymatic degradation presents, unusual, of β-glucans and xyloglucans, promising feature for degradation of lignocellulosic material / Doutor

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2017-03-22T14:33:07Z No. of bitstreams: 1 PDF - Wilma Raianny Vieira da Rocha.pdf: 20739891 bytes, checksum: c023d43879ce02bbd28a1fb3f8128c2f (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2017-03-22T15:14:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Wilma Raianny Vieira da Rocha.pdf: 20739891 bytes, checksum: c023d43879ce02bbd28a1fb3f8128c2f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T15:14:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Wilma Raianny Vieira da Rocha.pdf: 20739891 bytes, checksum: c023d43879ce02bbd28a1fb3f8128c2f (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / L-asparaginase (ASNase) is used in the treatment of acute lymphoid leukemia, the medicines contain ASNase of prokaryotic origin and the disadvantage of its use are the hypersensitivity reactions, this study had the objective of the evaluation of filamentous fungi for production of enzyme, representing a eukaryotic source. 32 filamentous fungi isolated from the Caatinga biome, through qualitative screening, using bromothymol as indicator and quantitative screening in two stages in modified Czapek Dox medium, using both culture fluid and mycelium to determine the enzymatic activity through L-aspartyl-β-hydroxamic acid (ABA) method. Characterization of Aspergillus terreus S-18 growth was carried out, the kinetic parameters {maximum growth rate (μMax), doubling time (Td) and substrate conversion factor in cells (g.g)} and optimization of biomass and enzyme production By the best producer through statistical planning divided into three blocks with repetition of the central point in two stages of cultivation, recovery of the intracellular enzyme through mechanical disruption of the mycelium, besides cultivation in an air- lift bioreactor (adapted) to evaluate the influence of the inoculum in the production of ASNase, using inoculum with spores and pre-inoculum cultured in rotativo shaker. A total of 15 fungi produced ASNase in qualitative screening, all of which produced the extracellular enzyme but the intracellular production of ASNase was higher when compared to extracellular production, and 9 fungi produced the intracellular enzyme in the quantitative screening with emphasis on intracellular production of Aspergillus Terreus S-18, which was 1.58 U.g-1 (18.2 U total) for ASNase and 0.15 U.g-1 for L- glutaminase (GLUase), showing ASNase/GLUase ratio of 10.5. In the kinetic parameters A. terreus S-18 had μMax of 0.019 h-1 , Td of 36.5 h and substrate conversion factor in cells in the growth phase of 0.9 g.g-1. In the optimization of biomass and ASNase production by A. terreus S-18, the optimum values defined for biomass production: pH 5.7 and temperature of 29 °C, already for enzyme production: pH 7.0, inoculum of 3.24E+07 spores.mL-1 and temperature of 29 °C, resulting in the production of 69.3 U total of ASNase. In the recovery of the enzyme, 0.8 U.mL-1 activity was obtained using cell disruption by glass beads and vortex. In the bioreactor cultivation, the inoculum using spores did not result in the production of extracellular and / or intracellular ASNase, and the culture using pellets of the fungus A. terreus S-18 was able to produce the intracellular enzyme, corresponding to 109.7 total U ASNase. / A enzima L-asparaginase (ASNase) é utilizada no tratamento de leucemia linfoide aguda, sendo que os medicamentos comerciais contém ASNase de origem procariótica e a principal desvantagem de seu uso são as reações de hipersensibilidade. Diante disso, este trabalho teve como objetivo a avaliação da produção de L-asparaginase por fungos filamentosos, representando uma fonte eucariótica alternativa para esta enzima. Foram avaliados 32 fungos isolados do bioma Caatinga no sertão Paraibano quanto à capacidade de produção da L- asparaginase. Inicialmente foi realizado o screening qualitativo por meio da utilização do azul de bromotimol como indicador. Os fungos selecionados nessa primeira etapa foram cultivados em meio Czapek Dox modificado para determinação da atividade enzimática, tanto intra quanto extracelular. Para determinar a atividade enzimática foi utilizado método do ácido L-aspartil- -hidroxâmico (ABA) e o Aspergillus terreus S-18 foi definido como a melhor cepa produtora. Obteve-se a caracterização dos perfis de crescimento fúngico e produção da enzima com subsquente otimização da produção de biomassa e da enzima por meio de planejamento estatístico dividido em três blocos com repetição do ponto central. Avaliou-se também a recuperação da enzima intracelular por meio do rompimento mecânico do micélio e aumento na escala de produção por meio do cultivo em biorreator air-lift (adaptado). Foram selecionados 15 fungos após o screening qualitativo. A produção intracelular de ASNase foi maior quando comparada a produção extracelular, sendo que 9 fungos produziram a enzima intracelular no screening quantitativo com destaque para produção intracelular do A. terreus S-18, que foi de 1,58 U.g-1 (18,2 U totais) para ASNase e 0,15 U.g-1 para L-glutaminase (GLUase), apresentando relação ASNase/GLUase de 10,5. Nos cálculos dos parâmetros cinéticos o A. terreus S-18 apresentou µMax de 0,019 h-1, Td de 36,5 h e fator de conversão de substrato em células, na fase de crescimento, de 0,9 g.g-1. Na otimização da produção de biomassa e de ASNase por A. terreus S-18, os valores ótimos para produção de biomassa: pH de 5,7 e temperatura de 29 °C e para produção da enzima: pH de 7,0, inóculo de 3,24E+07 esporos.mL-1 e temperatura de 29 °C, resultando na produção de 69,3 U totais de ASNase. Na recuperação da enzima obteve-se atividade de 0,8 U.mL-1 por rompimento celular por pérolas de vidro e vórtex. Em biorreator, o inóculo utilizando esporos não resultou em produção de ASNase extracelular e/ou intracelular, já o cultivo utilizando pellets o fungo A. terreus S-18 foi capaz de produzir a enzima intracelular, correspondente a 109,7 U totais de ASNase.