The field of microRNA research has gained enormous significance during recent years. Current studies have shown that microRNAs play an important role in many biological processes via posttranscriptional gene regulation. This also applies for the TLR-mediated recognition of pathogens by immune cells. Among others, the microRNAs miR-132, miR-146a and miR-155 have been characterized by various authors. However, the specific role of microRNAs in the defense against fungal infections by Aspergillus fumigatus has not been investigated so far, although this ubiquitous mold causes severe infections in immuno-compromised patients. As dendritic cells play a pivotal part in the in vivo recognition of A. fumigatus, the present study investigates the reaction of these cells to A. fumigatus and other pathogens on the microRNA level. For this purpose, dendritic cells were incubated with different forms of A. fumigatus and other pathogens for up to twelve hours. Subsequently, the expression of miR-132, miR-146a and miR-155 was quantified by real-time PCR. Levels of miR-132 in dendritic cells were significantly increased after stimulation with living germ tubes of A. fum, but showed no change after treatment with LPS. Relative expression level of miR-146a was moderately elevated upon stimulation with LPS, but did not respond to co-cultivation with living germ tubes. MiR-155 was highly induced by both stimuli. These results show, that dependent on the stimulus, microRNAs are differentially regulated in dendritic cells. Among the tested microRNAs, miR-155 showed the strongest and most stable expression values. Therefore, further experiments focused on this mircoRNA. It was shown, that the up-regulation of miR-155 is dependent on the germination stage of the fungus. Induction of miR-155 was low with conidia, moderate with hyphae and high with germ tubes. The extent of miR-155 induction also corresponded with the multiplicity of infection (MOI), with higher MOIs triggering a stronger miR-155 response. These results suggest that miR-132 and miR-155 play an important role in the immunologic reaction of DCs against A. fumigatus and that a further characterization of these microRNA, especially with respect to their specific function in DCs, could contribute to the understanding of the biological mechanisms of Aspergillosis. / Die Erforschung von MicroRNAs gewinnt zunehmend an Bedeutung. Aktuelle Arbeiten zeigen, dass MicroRNAs an der Regulation vieler biologischer Prozesse beteiligt sind, indem sie in die posttranskriptionelle Genregulation eingreifen. Dies betrifft auch die TLR-vermittelte Erkennung von Pathogenen durch Immunzellen. Hierbei wurden u.a. die MikroRNAs miR-132, miR-146a und miR-155 von verschiedenen Autoren charakterisiert. Die spezielle Rolle von MikroRNAs bei der Abwehr von Pilzinfektionen durch Aspergillus fumigatus ist bisher allerdings kaum untersucht, obwohl dieser ubiquitär vorkommende Schimmelpilz häufig schwere Infektionen bei immunsupprimierten Patienten auslöst. Da in vivo den dendritischen Zellen eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von A. fumigatus zukommt, wurde in der vorliegenden Arbeit die Reaktion dieser Zellen auf A. fumigatus und andere Pathogene auf MikroRNA Ebene untersucht. Dazu wurden dendritische Zellen mit verschiedenen Formen von A. fumigatus und LPS über Zeiträume von bis zu zwölf Stunden stimuliert. Anschließend wurde die Expression von miR-132, miR-146a und miR-155 mittels Real-Time PCR bestimmt. Dabei zeigte sich, dass nach Stimulation mit A. fumigatus die miR-132 Level in dendritischen Zellen deutlich anstiegen, wohingegen eine Inkubation mit LPS keinen Einfluss auf diese MicroRNA hatte. Die relative Expression von miR-146a war nach Stimulation mit LPS leicht erhöht, zeigte allerdings keine Veränderung nach Ko-Kultur mit A. fumigatus. Die Expression von miR-155 wurde durch beide Stimuli stark induziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass abhängig vom Stimulus eine differentielle Expression von MicroRNAs in dendritischen Zellen stattfindet. Unter den drei untersuchten MicroRNAs, zeigte miR-155 die höchsten und stabilsten Expressionswerte. Daher wurde der Schwerpunkt weiterer Experimente auf diese MicroRNA gesetzt. Dabei ergab sich, dass das Ausmaß der miR-155 Induktion vom Entwicklungsstadium des Pilzes abhängig ist. Konidien von A. fumigatus führten lediglich zu einer schwachen Hochregulation von miR-155, wohingegen Hyphen und insbesondere Keimschläuche ein starke Induktion von miR-155 verursachten. Die Dynamik der miR-155 Hochregulation korrelierte außerdem mit der multiplicity of infection (MOI), wobei eine höhere MOI mit einer stärkeren miR-155 Antwort einherging. Die dargestellten Ergebnisse legen nahe, dass miR-132 und miR-155 eine wichtige Rolle bei der Immunreaktion von DCs gegen A. fumigatus spielen und eine weitere Charakterisierung dieser MicroRNAs v.a. im Hinblick auf ihre spezielle Funktion in DCs einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der biologischen Grundlagen der Aspergillosen erbringen könnte.

Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Gefäßerkrankung. Dabei sind alle entscheidenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems involviert. Besonders dendritische Zellen (DCs) expandieren subendothelial während der Progression einer Atherosklerose. Diese können Antigene aufnehmen und daraufhin Zytokine produzieren oder andere Immunzellen aktivieren. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende Stränge aus Ribonukleinsäure, welche als weitere Ebene der Genregulation wichtige Zellvorgänge beeinflussen können. Diese Arbeit zeigt mögliche Zielproteine des miRNA 17-92 Clusters in dendritischen Zellen auf und schlägt mögliche Modelle vor, wie dadurch Zellvorgänge von DCs in der Atherosklerose reguliert werden könnten. / Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease involving the immune system, with key mechanisms involving dendritic cells. miRNAs are a small, non-coding RNAs that potentially repress translation of mRNA. This dissertation shows possible target proteins and regulation pathways of the miRNA 17-92 cluster in dendritic cells with a potential relevance in atherosclerosis

Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost. Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden. Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus analysiert. In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨ großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨ dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303- positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs. In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen (moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht. Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨ etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨ Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨ wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit. In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154- positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨ Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨ werden. Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden. / Invasive aspergillosis (IA) is one of the rare infectious diseases associated with a high mortality rate that occurs in immunocompromised patients. Like all aspergillosis, it is caused by the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. No effective therapy of IA is known to date and the current therapy is associated with high side effects and costs. More in-depth research is needed in the field of immunological infection biology, such as the interactions of human immune cells with A. fumigatus, for the development of pathogen-specific immunotherapies. In the present study dendritic cells (DCs) are investigated due to their ability to phago- cytose fungal morphologies of A. fumigatus and activate the adaptive immune system via antigen presentation. Monocytes which differentiate into DCs (moDCs) are used by many research groups due to their large numbers; however, their total generation time lasts five days. CD1c-positive myeloid DCs (mDCs) and CD303-positive plasmacytoid DCs (pDCs) found in the peripheral blood can be used directly after isolation. The two DC populations are formed from different precursor cells of the hematopoietic system in the bone marrow and therefore their phenotype and immune functions differ from each other and also from those of moDCs. ...

Erlangen, Nürnberg, Universiẗat, Diss., 2006. / Enth. 1 Sonderabdr. aus: International journal of cancer ; 111. 2004. - Beitr. teilw. dt., teilw. engl.

Würzburg, Universiẗat, Diss., 2006.

Universiẗat, Diss.--Jena, 2007.

Konstanz, Univ., Diss., 2008.

Würzburg, Universiẗat, Diss., 2008.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met een Nederlandse samenvatting.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2007.