Este trabalho de tese de doutorado baseia-se em um desenvolvimento científico amplamente multidisciplinar combinando-se protocolos, técnicas e ensaios experimentais da área de tecnologia farmacêutica, nanotecnologia, engenharia tecidual e fotobiologia. O trabalho foi realizado em duas etapas subsequentes. Primeiramente realizaram-se os estudos de desenvolvimento e caracterização de um sistema de veiculação de fármacos, o qual foi amplamente avaliado a partir de testes físico-químicos e ensaios de citotoxidade in vitro em cultura de fibroblastos humanos. Na sequencia realizaram-se estudos fotobiológicos combinando-se a aplicação de luz laser de baixa potência e fármaco fotossensível nanoestruturado com modelos teciduais, para avaliação da resposta biológica ao fotoestímulo. Para se mimetizar ao máximo as condições in vivo, construiu-se com sucesso um modelo tridimensional in vitro de pele humana, o qual se apresentou como uma ferramenta ideal para se avaliar a resposta fotobiológica após a indução de processos fotodinâmicos. Avaliou-se também o emprego dos equivalentes dermais como sistemas alternativos em testes de permeação e retenção cutânea in vitro. Os resultados obtidos foram promissores, auxiliando na compreensão dos mecanismos de interação dos processos fotodinâmicos com a matriz extracelular em combinação com a engenharia tecidual, mimetizando assim as condições in vivo da pele humana. Foi possível estabelecer também as bases para novos protocolos disponíveis para testes dermatológicos envolvendo produtos do segmento farmacêutico, cosmecêutico e áreas correlatas. / This work of doctorate thesis bases on a scientific development thoroughly multidiscipline combining protocols, techniques and experimental assays of the pharmaceutical technology, nanotechnology, tissue engineering and photobiology. The work was accomplished in three subsequent stages. Firstly were carried out studies and characterization of a drug delivery system with nanotechnology, which was evaluated thoroughly starting from physical-chemical tests and assays of cytotoxicity in human fibroblast culture. In the sequence were carried photobiological studies combining the application of low-intensity laser and nanosized photosensitizers with tissue models, for evaluation of the biological photostimulation. In mimetic conditions it was developed an in vitro three-dimensional human skin model, as tool to evaluate the photobiological response after the induction of the photodynamic processes and also as alternative for in vitro assays of drug permeation/retention. Results were promising, aiding in the understanding of interaction of extracellular matrix with photodynamic processes. Therefore, the work was based in combination of techniques with application in dermatology, pharmaceutical process, cosmetics and correlate areas.

Os modelos de reconstrução do microambiente são úteis para investigar as propriedades biológicas dos melanócitos humanos com a matriz e como plataforma para testes de novos fármacos. Existe uma demanda crescente para a utilização de pele e derme reconstruídas em laboratório, em ensaios in vitro de citotoxicidade, viabilidade celular, crescimento celular, irritabilidade e avaliação dos constituintes da matriz extracelular. Caracterizamos, em equivalente dérmico, alguns mecanismos de viabilidade e invasão de melanoma metastático humano quando na presença da matriz, a fim de ampliar o conhecimento a respeito de novas terapias contra o melanoma e entender os mecanismos que favorecem seu potencial invasivo, mimetizando com mais fidelidade o que ocorre in vivo. Através da validação deste modelo, constatamos que ele é essencial para resgatar a fisiopatologia do tumor, pois o melanoma, na presença de equivalente dérmico, torna-se capaz de evadir mecanismos de morte e aumentar a secreção de metaproteinases e citocinas que favorecerão a evolução tumoral. Avaliamos também as propriedades antineoplásicas do ácido clorogênico, que já foram relatadas em um grande número de tumores, porém os mecanismos que levam à sua ação antitumoral ainda não foram bem elucidados. Diante dos trabalhos enfatizando o efeito quimioprotetor dos polifenóis, referentes à sua ação antioxidante em células neoplásicas e com potencial metastático, não há na literatura estudos que comprovem a eficácia do ácido clorogênico sobre células de melanoma metastático humano. Portanto, este estudo visou recriar a estrutura dérmica in vitro e, a partir disso, comparar a resposta de fármacos em células de melanoma cultivada em equivalente dérmico, a fim de avaliar se há modulação diferencial nesse substrato, sugerindo, portanto, um protocolo mais eficaz para a prospecção de fármacos antimelanoma. / The microenvironment reconstruction models are useful for investigating the biological properties of human melanocytes onto the matrix and as platform for testing new drugs. There is a growing demand for the use of reconstructed skin and dermis in the laboratory for in vitro assays of cytotoxicity, viability, cell growth, irritability, and evaluation of the extracellular matrix. We characterize in dermal equivalent some mechanisms for cell viability and invasion of human metastatic melanoma in the presence of matrix, the order to increase knowledge about new therapies against melanoma and to understand the mechanisms that favor its invasive potential, to more closely mimic what occurs in vivo. By means of this model, we find that it is essential to rescue the tumor physiopathology as melanoma, in the presence of dermal equivalent, it is able to evade death mechanisms and increase the expression of metalloproteinases and cytokines which favor the tumor evolution. We also evaluated the antineoplastic properties of chlorogenic acid, that have been reported in a large number of tumors, but the mechanisms that lead to its antitumor action has not been well elucidated. Before the work emphasizing the chemoprotective effect of polyphenols related to its antioxidant action in neoplastic cells and with metastatic potential, there is no literature studies confirming the effectiveness of chlorogenic acid on human metastatic melanoma cells. Therefore, this study aims to rebuild the dermal structure in vitro, and from this, to compare the response to drugs in melanoma cells dermal equivalent cultured in order to evaluate whether modulation differential on the substrate, thus suggesting a protocol more effective for prospecting antimelanoma drugs.

Os modelos de reconstrução do microambiente são úteis para investigar as propriedades biológicas dos melanócitos humanos com a matriz e como plataforma para testes de novos fármacos. Existe uma demanda crescente para a utilização de pele e derme reconstruídas em laboratório, em ensaios in vitro de citotoxicidade, viabilidade celular, crescimento celular, irritabilidade e avaliação dos constituintes da matriz extracelular. Caracterizamos, em equivalente dérmico, alguns mecanismos de viabilidade e invasão de melanoma metastático humano quando na presença da matriz, a fim de ampliar o conhecimento a respeito de novas terapias contra o melanoma e entender os mecanismos que favorecem seu potencial invasivo, mimetizando com mais fidelidade o que ocorre in vivo. Através da validação deste modelo, constatamos que ele é essencial para resgatar a fisiopatologia do tumor, pois o melanoma, na presença de equivalente dérmico, torna-se capaz de evadir mecanismos de morte e aumentar a secreção de metaproteinases e citocinas que favorecerão a evolução tumoral. Avaliamos também as propriedades antineoplásicas do ácido clorogênico, que já foram relatadas em um grande número de tumores, porém os mecanismos que levam à sua ação antitumoral ainda não foram bem elucidados. Diante dos trabalhos enfatizando o efeito quimioprotetor dos polifenóis, referentes à sua ação antioxidante em células neoplásicas e com potencial metastático, não há na literatura estudos que comprovem a eficácia do ácido clorogênico sobre células de melanoma metastático humano. Portanto, este estudo visou recriar a estrutura dérmica in vitro e, a partir disso, comparar a resposta de fármacos em células de melanoma cultivada em equivalente dérmico, a fim de avaliar se há modulação diferencial nesse substrato, sugerindo, portanto, um protocolo mais eficaz para a prospecção de fármacos antimelanoma. / The microenvironment reconstruction models are useful for investigating the biological properties of human melanocytes onto the matrix and as platform for testing new drugs. There is a growing demand for the use of reconstructed skin and dermis in the laboratory for in vitro assays of cytotoxicity, viability, cell growth, irritability, and evaluation of the extracellular matrix. We characterize in dermal equivalent some mechanisms for cell viability and invasion of human metastatic melanoma in the presence of matrix, the order to increase knowledge about new therapies against melanoma and to understand the mechanisms that favor its invasive potential, to more closely mimic what occurs in vivo. By means of this model, we find that it is essential to rescue the tumor physiopathology as melanoma, in the presence of dermal equivalent, it is able to evade death mechanisms and increase the expression of metalloproteinases and cytokines which favor the tumor evolution. We also evaluated the antineoplastic properties of chlorogenic acid, that have been reported in a large number of tumors, but the mechanisms that lead to its antitumor action has not been well elucidated. Before the work emphasizing the chemoprotective effect of polyphenols related to its antioxidant action in neoplastic cells and with metastatic potential, there is no literature studies confirming the effectiveness of chlorogenic acid on human metastatic melanoma cells. Therefore, this study aims to rebuild the dermal structure in vitro, and from this, to compare the response to drugs in melanoma cells dermal equivalent cultured in order to evaluate whether modulation differential on the substrate, thus suggesting a protocol more effective for prospecting antimelanoma drugs.

Este trabalho de tese de doutorado baseia-se em um desenvolvimento científico amplamente multidisciplinar combinando-se protocolos, técnicas e ensaios experimentais da área de tecnologia farmacêutica, nanotecnologia, engenharia tecidual e fotobiologia. O trabalho foi realizado em duas etapas subsequentes. Primeiramente realizaram-se os estudos de desenvolvimento e caracterização de um sistema de veiculação de fármacos, o qual foi amplamente avaliado a partir de testes físico-químicos e ensaios de citotoxidade in vitro em cultura de fibroblastos humanos. Na sequencia realizaram-se estudos fotobiológicos combinando-se a aplicação de luz laser de baixa potência e fármaco fotossensível nanoestruturado com modelos teciduais, para avaliação da resposta biológica ao fotoestímulo. Para se mimetizar ao máximo as condições in vivo, construiu-se com sucesso um modelo tridimensional in vitro de pele humana, o qual se apresentou como uma ferramenta ideal para se avaliar a resposta fotobiológica após a indução de processos fotodinâmicos. Avaliou-se também o emprego dos equivalentes dermais como sistemas alternativos em testes de permeação e retenção cutânea in vitro. Os resultados obtidos foram promissores, auxiliando na compreensão dos mecanismos de interação dos processos fotodinâmicos com a matriz extracelular em combinação com a engenharia tecidual, mimetizando assim as condições in vivo da pele humana. Foi possível estabelecer também as bases para novos protocolos disponíveis para testes dermatológicos envolvendo produtos do segmento farmacêutico, cosmecêutico e áreas correlatas. / This work of doctorate thesis bases on a scientific development thoroughly multidiscipline combining protocols, techniques and experimental assays of the pharmaceutical technology, nanotechnology, tissue engineering and photobiology. The work was accomplished in three subsequent stages. Firstly were carried out studies and characterization of a drug delivery system with nanotechnology, which was evaluated thoroughly starting from physical-chemical tests and assays of cytotoxicity in human fibroblast culture. In the sequence were carried photobiological studies combining the application of low-intensity laser and nanosized photosensitizers with tissue models, for evaluation of the biological photostimulation. In mimetic conditions it was developed an in vitro three-dimensional human skin model, as tool to evaluate the photobiological response after the induction of the photodynamic processes and also as alternative for in vitro assays of drug permeation/retention. Results were promising, aiding in the understanding of interaction of extracellular matrix with photodynamic processes. Therefore, the work was based in combination of techniques with application in dermatology, pharmaceutical process, cosmetics and correlate areas.