Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

Ornitina decarboxilase (ODC) (EC 4.1.1.17) é a primeira enzima que desencadeia a síntese das poliaminas putrescina, espermidina e espermina nas células. As poliaminas são cátions alifáticos envolvidos no controle de crescimento e são requeridas para uma variedade de eventos biológicos como síntese de proteína, replicação do DNA e divisão celular. No presente estudo, a atividade da ODC foi medida em ovo, larva, pupa, fêmea jovem e adulta de Anastrepha fraterculus. Durante o desenvolvimento de A. fraterculus, a atividade da ODC apresentou flutuações. Entre os estágios anteriores à emergência, o ovo teve a mais alta atividade específica, provavelmente devido à embriogênese que é caracterizada pela alta taxa de divisão celular. A atividade da ODC foi também altamente significativa em ovários e corpo gorduroso de fêmeas jovens possivelmente devido ao avanço da oogênese e vitelogênese. Parâmetros cinéticos (Km app e Vmax) para atividade da ODC foram determinados em pupa, larva e ovário de fêmeas jovens e apresentaram grande variação. A guanosina trifosfato (GTP) demonstrou afetar grandemente estes parâmetros cinéticos, sugerindo estarem ocorrendo modificações pós-traducionais. Fêmeas jovens (4 dias) de A. fraterculus também foram analisadas quanto ao efeito do estresse de temperatura (6ºC e 20/6ºC) e da aplicação tópica do hormônio juvenil isolados ou em conjunto. . Os principais resultados foram que a concentração de 500 ng e os tempos de incubação de 3, 7 e 18 horas aumentaram a atividade da ODC. As fêmeas mantidas a 6ºC e 20/6ºC tiveram atividade da ODC mais alta do que as fêmeas mantidas a 25ºC. O tempo de incubação de 1 hora com o HJ aumentou a atividade da ODC no tratamento de 6ºC, quando comparado com fêmeas mantidas apenas com o estresse de temperatura sem a adição do hormônio (controle). No entanto, no tratamento das fêmeas mantidas a 20/6ºC, somente os tempos de 3 e 18 horas de incubação com o HJ demonstraram aumento na atividade da ODC quando comparadas com o tempo de incubação de 1 hora e com as fêmeas mantidas sem a adição do hormônio (controle). Os machos não apresentaram diferença na atividade da ODC quando submetidos ao estresse de temperatura de 6ºC, mas as medidas do apódema ejaculatório foram maiores a 25ºC que a 6ºC. Estes resultados podem ser considerados como parte de um processo adaptativo a mudanças ambientais. Por último, observamos que as medidas dos ovários (comprimento e largura) de fêmeas jovens mantidas com o inibidor da ODC, -difluormetilornitina (-DFMO; 50mM) são diferentes significativamente quando comparadas com às medidas das fêmeas controle sem o inibidor. O conjunto desses resultados indica a importância da relação entre ODC, HJ e estresse de temperatura para a A. fraterculus. Como esta mosca é uma das piores pragas para a fruticultura brasileira, estes dados, além de contribuírem para um maior conhecimento de sua biologia básica, poderão também ser usados para a escolha de melhores estratégias de controle populacional.

A Araucaria angustifolia é uma conífera nativa do Brasil. Em função da sua intensa exploração florestal, a espécie ocupa apenas 2% de sua vegetação natural. Neste sistema, a aplicação de técnicas biotecnológicas, como a embriogênese somática, podem ser integradas a programas de melhoramento genético e conservação. A similaridade entre a embriogênese somática e zigótica, tem sido utilizada para o estabelecimento de estudos visando o aperfeiçoamento do cultivo in vitro dos embriões somáticos, bem como para um maior conhecimento dos aspectos moleculares e fisiológicos que regulam a embriogênese. O metabolismo de poliaminas (PAs), mais especificamente putrescina, espermidina e espermina, tem se mostrado como fundamental para a compreensão e evolução da embriogênese zigótica e somática. Entretanto, a biossíntese das PAs e seu envolvimento nos vários processos biológicos que regulam a embriogênese, são pouco conhecidas em coníferas. Inserido nessa perspectiva, o presente trabalho teve como objetivo o estudo do metabolismo de PAs durante três estádios de desenvolvimento da semente (contendo as fases da embriogênese inicial até a tardia) e na proliferação de linhagens embriogênicas com diferentes potenciais embriogênicos de A. angustifolia. Foram investigados: a) os perfis de PAs (livres e conjugadas) e aminoácidos; b) determinação da via preferencial da biossíntese de putrescina, através da atividade enzimática da arginina descarboxilase (ADC) e ornitina descarboxilase (ODC); c) identificação e caracterização do padrão de expressão dos genes envolvidos no metabolismo de PAs; e d) a identificação das relações entre os perfis de PAs e aminoácidos presentes nas sementes das matrizes, e sua potencial influência nas fases de indução, proliferação e maturação dos embriões somáticos. Durante a embriogênese zigótica, a expressão dos genes AaADC (arginina descarboxilase) e AaSAMDC (S-adenosilmetionina descarboxilase) aumentaram no estádio cotiledonar, juntamente com o aumento de PAs. A biossíntese da putrescina é realizada preferencialmente via ADC, enquanto que a citrulina foi o principal aminoácido presente nas sementes. Em relação ao metabolismo de PAs nas culturas embriogênicas, os dados obtidos demonstraram que a arginina e ornitina parecem ter diferentes funções em cada linhagem testada. Na linhagem com alto potencial embriogênico, a arginina parece estar associada com a ativação dos genes relacionados ao catabolismo de PAs (AaPAO2, AaCuAO e AaALDH), enquanto que esse efeito não foi observado na linhagem bloqueada. A ODC tem uma maior atividade na linhagem responsiva, enquanto que na linhagem bloqueada, as atividades da ADC e ODC são similares. Dependendo da matriz foram observados diferentes perfis de PAs e aminoácidos, sendo estes perfis relacionados com as taxas de indução, proliferação e desenvolvimento dos embriões somáticos. Putrescina total, ornitina e asparagina foram os metabólitos diferencialmente identificados entre as matrizes, os quais podem ser propostos como marcadores bioquímicos para a seleção de matrizes com alto potencial para a embriogênese somática. Os resultados obtidos fornecem informações relevantes e inéditas sobre o metabolismo de PAs e aminoácidos na embriogênese zigótica e somática de A. angustifolia, bem como fornece novos subsídios para o aprimoramento das condições artificiais utilizadas para o desenvolvimento dos embriões somáticos / The Araucaria angustifolia is a native conifer species of Brazil. Due to its intense exploitation, the species cover only 2% of its original forest area. In this system, biotechnological tools, like somatic embryogenesis, may be integrated into breeding and conservation programs. The similarity between zygotic and somatic embryogenesis have been used to establishment of studies in order to optimization of somatic embryos in vitro culture, as well as for a better understanding of physiologic and molecular aspects that modulates the embryogenesis. The metabolism of polyamines (PAs), specifically putrescine, spermidine and spermine, has been demonstrated as fundamental for the comprehension and evolution of zygotic and somatic embryogenesis. However, the biosynthetic pathways of PAs and their involvement in various biological process that regulate the embryogenesis are little known in conifers. Inserted in this perspective, the aim of the current work was to study the metabolism of PAs during three seeds development stages (containing the early till late embryogenesis phases) and in proliferation of cell lines with different embryogenic potential of A. angustifolia. Were investigated: a) PAs (free and conjugated) and amino acids profiles; b) determination of preferential pathway for putrescine biosynthesis, through enzymatic activity of arginine decarboxylase (ADC) and ornithine decarboxylase (ODC); c) identification and characterization of gene expression profile of genes related to metabolism of PAs; and d) identification of the relationship between PAs and amino acids profiles in seeds of mother plants, and their potential influence in initiation, proliferation and maturation phases of somatic embryos. During the zygotic embryogenesis, AaADC (arginine decarboxylase) and AaSAMDC (S-adenosylmethionine decarboxylase) genes were up-regulated at cotyledonary stage along with the increasing of PAs. The biosynthesis of putrescine is performed preferentially by ADC pathway, while citrulline was the main amino acid recorded during the seed development. Regarding the metabolism of PAs in embryogenic cultures, the data demonstrated that arginine and ornithine seem to have different functions in each cell line tested. In cell line with high embryogenic potential, arginine seems to be associated to activation of genes related to PAs catabolism (AaPAO2, AaCuAO e AaALDH), while in blocked cell line this effect was not observed. ODC has a higher enzymatic activity in responsive cell line, while in blocked cell line, both ADC and ODC activities are similar. Depending of mother plant, were observed different PAs and amino acids profiles, being these profiles related with the rate of initiation, proliferation and maturation of somatic embryos. Total putrescine, ornithine and asparagine were the differentially metabolites identified between the mother plants, which can be proposed as biochemical marker to select mother plant with high potential to somatic embryogenesis. The results obtained provide relevant and inedited information about the metabolism of PAs and amino acids in zygotic and somatic embryogenesis of A. angustifolia, as well as provide news subsidies for optimization of in vitro conditions for somatic embryos development

Um gene que codifica uma piruvato/indolpiruvato descarboxilase (PDC/IPDC) está presente no tripanossomatídeo de plantas Phytomonas serpens. A PDC atua na fermentação alcoólica, enquanto que a IPDC atua na biossíntese do fitormônio ácido indol-3-acético (AIA). Análises filogenéticas indicam que a PDC/IPDC de P. serpens é monofilética com IPDCs de gama-proteobactérias, sugerindo um evento de transferência horizontal gênica. A análise de meios de cultura de P. serpens confirma a produção de etanol e AIA. A funcionalidade do fitormônio foi confirmada em ensaios de alongamento de hipocótilos de tomateiros. Tomates inoculados com P. serpens mostraram aumento no teor de AIA-amida e -éster conjugados. A atividade PDC foi mostrada em extratos de P. serpens. Concluímos que a PDC/IPDC seria uma 2-cetoácido descaboxilase com atividade catalítica variável para diferentes substratos. A atividade PDC parece ser predominante em P. serpens, representando um mecanismo para oxidar parte do NADH formado na glicólise, principal responsável pela produção de ATP neste organismo. / A gene codifying a pyruvate/indolepyruvate decarboxylase (PDC/IPDC) is present in the plant trypanosomatid Phytomonas serpens. PDC acts in the alcoholic fermentation, whyle IPDC acts in the biosynthesis of the phytohormone indole-3-acetic acid (IAA). Phylogenetic analysis indicate that P. serpens PDC/IPDC is monophyletic with gamma-proteobacteria IPDCs, suggesting a horizontal gene transfer event. Analysis of P. serpens culture media confirms production of ethanol and IAA. The functionality of the phytohormone was confirmed by tomato hypocotyl elongation tests. Tomatoes inoculated with P. serpens showed an increase in the concentration of IAA amide and ester conjugated. PDC activity was shown in P. serpens extracts. We conclude that the PDC/IPDC would be a 2-keto acid decaboxylase with variable catalytic activity for different substrates. The PDC activity appears to be prevalent in P. serpens representing a mechanism to oxidize part of NADH formed in glycolysis, responsible for ATP production in this organism.

Um gene que codifica uma piruvato/indolpiruvato descarboxilase (PDC/IPDC) está presente no tripanossomatídeo de plantas Phytomonas serpens. A PDC atua na fermentação alcoólica, enquanto que a IPDC atua na biossíntese do fitormônio ácido indol-3-acético (AIA). Análises filogenéticas indicam que a PDC/IPDC de P. serpens é monofilética com IPDCs de gama-proteobactérias, sugerindo um evento de transferência horizontal gênica. A análise de meios de cultura de P. serpens confirma a produção de etanol e AIA. A funcionalidade do fitormônio foi confirmada em ensaios de alongamento de hipocótilos de tomateiros. Tomates inoculados com P. serpens mostraram aumento no teor de AIA-amida e -éster conjugados. A atividade PDC foi mostrada em extratos de P. serpens. Concluímos que a PDC/IPDC seria uma 2-cetoácido descaboxilase com atividade catalítica variável para diferentes substratos. A atividade PDC parece ser predominante em P. serpens, representando um mecanismo para oxidar parte do NADH formado na glicólise, principal responsável pela produção de ATP neste organismo. / A gene codifying a pyruvate/indolepyruvate decarboxylase (PDC/IPDC) is present in the plant trypanosomatid Phytomonas serpens. PDC acts in the alcoholic fermentation, whyle IPDC acts in the biosynthesis of the phytohormone indole-3-acetic acid (IAA). Phylogenetic analysis indicate that P. serpens PDC/IPDC is monophyletic with gamma-proteobacteria IPDCs, suggesting a horizontal gene transfer event. Analysis of P. serpens culture media confirms production of ethanol and IAA. The functionality of the phytohormone was confirmed by tomato hypocotyl elongation tests. Tomatoes inoculated with P. serpens showed an increase in the concentration of IAA amide and ester conjugated. PDC activity was shown in P. serpens extracts. We conclude that the PDC/IPDC would be a 2-keto acid decaboxylase with variable catalytic activity for different substrates. The PDC activity appears to be prevalent in P. serpens representing a mechanism to oxidize part of NADH formed in glycolysis, responsible for ATP production in this organism.

A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I. / The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.

A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I. / The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.

A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I. / The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.

A correta classificação do tipo de DM leva mais precocemente ao tratamento adequado e atualmente é dividida em 4 categorias: DM tipo 1, DM tipo 2, Outros tipos e Diabete Gestacional. O DM tipo 1 é geralmente auto-imune, surge em geral antes dos 20 anos de idade e é dependente de insulina para impedir a cetoacidose. O DM tipo 2 é responsável por mais de 90% dos casos, acontece em geral após os 45 anos, com história familiar e associado à síndrome metabólica. Na categoria “outros tipos”, o Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) é um subtipo que inicia abaixo dos 25 anos, não-dependente de insulina e apresenta herança dominante. No entanto, apesar da classificação definir essas categorias através de características peculiares, pode existir uma sobreposição de quadros, principalmente no DM que inicia no adulto jovem. Assim, novos sistemas de classificação têm sido propostos, empregando a presença da auto-imunidade (anticorpos) e índices de função de célula β (peptídeo-C) para definir a patogênese e nomenclatura mais específicas. O objetivo desta revisão é descrever e analisar o desempenho destas ferramentas diagnósticas na classificação do DM. Os anticorpos evidenciam a auto-imunidade do DM 1. O IAA (insulin auto-antibody) está presente quando o início do DM se dá, principalmente, antes dos 5 anos de idade e o anti- GAD (glutamic acid decarboxylase) tem seu melhor desempenho nos indivíduos com início da doença acima dos 20 anos, sendo o teste que permanece positivo por mais tempo. A medida do peptídeo-C avalia a reserva pancreática de insulina e deve ser realizada com glicemia entre 70-200 mg/dl. A medida após estímulo é a mais estudada e <1,5 ng/ml define o paciente como DM 1. O estímulo com refeição mista é o recomendado pela ADA, mas o teste com 1 mg de glucagon é mais simples e igualmente acurado. Dados em relação à utilização da classificação baseada na medida de diferentes anticorpos dirigidos ao pâncreas classificação A (anticorpos) e β (peptídeo-C) pode ser adotada como um método acurado, relativamente simples e preciso de classificação de DM. / The correct classification of DM type leads to earlier appropriate treatment and is currently divided into 4 categories: type 1 DM, type 2 DM, Other types and Gestational DM. Type 1 DM is generally autoimmune, it usually appears before the age of 20 years, and depends on insulin to prevent ketoacidosis. Type 2 DM accounts for over 90% of the cases, it usually occurs after the age of 45, with a family history and metabolic syndrome. In the category “other types”, Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) is a subtype that begins before the age of 25, is non-insulin dependent and presents a dominant heritage. However, although the classification defines these categories through peculiar characteristics, there may be superimposed pictures, especially in the case of DM which begins in the young adult. Thus, new classification systems have been proposed, using the presence of autoimmunity (antibodies) and β cell (C-peptide) indexes to define the pathogenesis and more specific nomenclatures. The purpose of this review is to describe and analyze the performance of these diagnostic tools in the classification of DM. The presence of antibodies show the autoimmunity of type 1 DM. IAA (insulin auto-antibody) is present mainly before the age of 5 years, and anti-GAD (glutamic acid decarboxylase) performs best in individuals who begin the disease above the age of 20, and its test remains positive longest. The C-peptide measure evaluates the pancreatic reserve of insulin and should be performed with a glycemia between 70-200 mg/dl. Post-stimulus measuring is more widely studied and <1.5 ng/ml defines the patient as DM1. Stimulation with a mixed meal is recommended by ADA, but the test with 1 mg of glucagon is simpler and just as effective. Data on classification A (antibodies), β (Cpeptide) suggest that it may be adopted as an effective, relatively simple and precise method for DM classification.