En los insectos, las diferentes transiciones que se producen a lo largo del desarrollo, tanto embrionario como post-embrionario, se encuentran reguladas por pulsos de ecdisteroides, en particular por la 20 hidroxiecdisona (20E). Esta señal se transduce mediante factores de transcripción de la família de los receptores nucleares, en concreto, la 20E se une al heterodímero formado por el receptor de la ecdisona (EcR) y el producto del gen ultraespiraculo (USP) y, una vez unida, activa una pequeña serie de genes tempranos, que, a su vez, amplifican esta señal mediante la inducción de los denominados genes tardíos que controlan la respuesta biológica a la hormona. Dentro de esta cascada génica, cabe destacar el eje funcional formado por los receptores nucleares EcR-HR3-FTZ F1 el cual interviene en la coordinación de las mudas larvarias, así como en el inicio de la metamorfosis en Drosophila melanogaster. Es importante subrayar que no se conoce si la jerarquía de factores nucleares inducidos por la 20E también existe y opera en insectos más primitivos con un desarrollo hemimetábolo como es nuestro insecto modelo Blattella germanica. En la presente tesis doctoral iniciamos la caracterización del eje funcional EcR-HR3-FTZ F1 en el dictióptero Blattella germanica. Así pues, hemos llevado a cabo el clonaje de los ortólogos de los receptores nucleares HR3 y FTZ-F1 en B. germanica obteniendo tres isoformas de HR3 (BgHR3 A, BgHR3 B1 y BgHR3 B2) y dos de FTZ F1 (BgFTZ F1A y BgFTZ F1B). Hemos caracterizado los patrones de expresión de estos transcritos y del receptor de la ecdisona (BgEcR A), que se había clonado previamente en nuestro laboratorio, en las dos últimas fases ninfales así como durante la embriogénesis de B. germanica. Además, analizamos el papel regulador que estos receptores nucleares desempeñan durante el desarrollo ninfal de B. germanica, y especialmente en el proceso de la muda. Para ello, hemos utilizado la técnica del RNA de interferencia (RNAi) in vivo mediada por la inyección intraabdominal de RNAs de doble cadena (dsRNA) de cada uno de los genes a estudiar. Cuando estos dsRNAs eran inyectados en hembras recién emergidas a sexto estadio ninfal, la mayoría de las ninfas interferidas no eran capaces de completar la écdisis y morían transcurridas 24-48 h. El análisis fenotípico de estos individuos mostró que presentaban duplicación de las estructuras de origen ectodérmico y que presentaban alteraciones en los niveles de ecdisteroides hemolinfáticos. No obstante, un cierto porcentaje de las ninfas tratadas con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 eran capaces de completar la muda imaginal, esto nos permitió estudiar procesos que se ven afectados por estos dos factores de transcripción durante la vida adulta. Los individuos interferidos con dsBgEcR A que mudaban a adulto presentaban claros defectos en la extensión de los dos pares de alas, por su parte, las ninfas tratadas con dsBgFTZ F1 también presentaban alas mal posicionadas, aunque correctamente extendidas. El segundo fenotipo observado en todos los individuos tratados con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 que mudaban a adulto es que la glándula protorácica no degeneraba. Ampliamos el análisis funcional de cada uno de los receptores nucleares que estamos analizando, BgEcR A, BgHR3 y BgFTZ F1 al periodo embrionario de B. germanica. El análisis de los embriones interferidos para BgEcR A y BgFTZ F1 mostró que estos individuos progresaron hasta las 48 h de desarrollo embrionario, presentando, sin embargo, considerables malformaciones que impidieron su posterior desarrollo. Mientras que aquellos que eran silenciados para BgHR3, que fueron capaces de progresar hasta las 96 h de desarrollo, presentaron defectos en el desarrollo de la región cefálica, desde un nivel poco severo en el que únicamente se apreció una cierta reducción o pérdida de los lóbulos cefálicos hasta embriones que presentaban la pérdida de todos los segmentos cefálicos. / Ecdysteroids control molting in insects. The active form of ecdysteroids, 20 hydroxyecdisone (20E), exerts its function through the activation of a small set of transcription factors. In turn, these genes induce the expression of a larger set of other genes that control the biological response to the hormone. The orphan nuclear receptors EcR, HR3 and FTZ F1 have been shown to act as crucial members of the 20E-regulatory hierarchy in coordinating molting in the holometabolous insects Drosophila melanogaster and Manduca sexta. However, little is known on the role of these factors on primitive insects. Here, we report the cloning and characterization of BgHR3 and BgFTZ F1 in the hemimetabolous species Blattella germanica. Moreover, we use in vivo RNAi mediated by double-strand RNA (dsRNA) treatment to define BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during molting in B. germanica. When dsRNAs were injected at the beginning of the last larval instar, treated larvae had normal appearance and movements until the end of the instar. However, by the molting time most of them did not molt, became motionless and became arrested. Phenotypic analysis reveal that treated specimens had two pairs of mouth appendages, double tubular tracheae and produce a new cuticle. Moreover, the dsBgHR3-treated animals have higher ecdysteroids levels, whereas those of dsBgEcR A and dsBgFTZ F1-treated are lower than controls. Some of the nymphs treated with dsBgEcR A and dsBgFTZ F1 progressed through a complete molting. Interestingly, these knockdowns showed defects in wing extension and the prothoracic gland did not degenerated. Also, we have studied BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during B. germanica embryogenesis. Using RNAi parental we found that dsBgEcR-A and dsBgFTZ-F1 treated animals progress up to the 12% of development and resulted in germ bands showing severe phenotypes. While, those interfered with dsBgHR3 could progress up to the 25% of development but they shown defects in the cephalic regions which ranged in severity from reduction or loss of cephalic lobes to the complete loss of the cephalic segments.

Pluripotent cells are unique due to their developmental potential and the possibility to study them is the key step to understand human development. These cells are characterized by their ability to originate all the cellular lineages within an adult organism. Within embryonic milieu, pluripotent cells represent a dynamic fraction of the total cell number. Moreover, their physiological existence is constrained to early stages of embryonic development. In vitro culture of the different types of mammalian pluripotent cells, and singularly embryonic stem cells (ESC), enables the characterization of the pluripotent state. In the four articles included in this thesis we have addressed two different aspects of the molecular characterization of mammalian pluripotent cells. First, we investigated the establishment of the trophectoderm and the inner cell mass in the embryo measuring transcript abundance and protein presence of the transcription factors known to play a role in the earliest cellular differentiation process. In addition we have evaluated of genomic stability of human ESC lines during long-term culture, observing the accumulation of sukaryotypic aberrations such as loss of heterozygosity that affect loci comprising genes involved in genomic stability maintenance. We also checked the genomic status of two human ESC lines derived from embryos that had been diagnosed as abnormal after genetic preimplantation diagnosis (PGD). The molecular analysis of these cells ruled out the hypothesized self-correction of the aneuploidies between the PGD and the establishment of the cell lines. / Les cèl·lules pluripotents són úniques atesa la seva plasticitat durant el desenvolupament i la possibilitat d'estudiar-les és un pas essencial per poder comprendre el desenvolupament embrionari. Aquestes cèl·lules es caracteritzen per la seva habilitat per donar lloc a tots els llinatges cel·lulars de l'organisme. Dins de l'embrió, les cèl·lules pluripotents representen una fracció dinàmica del nombre total de cèl·lules i la seva existència fisiològica està constreta a els estadis més primerencs del desenvolupament embrionari. El cultiu in vitro dels diferents tipus de cèl·lules pluripotents en mamífers, i en especial les cèl·lules mare embrionàries, permet la caracterització d'aquest estat cel·lular. En els quatre capítols inclosos en aquesta tesi, hem tractat dos aspectes diferents de la caracterització molecular de les cèl·lules pluripotents. Primer, hem investigat l'establiment del trofectoderm i de la massa cel·lular interna en l'embrió mesurant l'abundància dels trànscrits i la presència de proteina dels factors de transcripció implicats en el primer process de diferenciació cel·lular conegut. A més, hem avaluat l'estabilitat genòmica de dues línies de cèl·lules mare en cultiu durant més de 40 passis. Com a resultat, hem observat l'acumulació de aberracions genòmiques a nivell subcariotípic, en especial pèrdua d'heterozigositat que afecta a locus que contenen gens implicats en el manteniment de l'estabilitat genòmica. També hem comprovat l'estatus genòmic de dos linies de cèl·lules mare embrionàries humanes derivades a partir d'embrions trobats aneuploids per un diagnòstic genètic preimplantacional. L'anàlisi molecular d'aquestes cèl·lules va descartar la hipòtesi d'una autocorrecció de les aneuploidies detectades entre el diagnòstic preimplantacional i la derivació de les línies a partir d'aquests embrions.