Une grande partie de cette thèse est dédiée à la chimie des isonitriles: ainsi plusieurs chapitres traitent des interactions entre isonitriles et dérivés d'acides, une part importante y a été consacrée à la valorisation des pyruvamides fluorés obtenus par addition d'isonitriles sur l'anhydride trifluoroacétique. Il nous a ainsi été possible de démontrer l'intérêt des hydrates de trifluoropyruvamides en tant qu'électrophiles vis à vis de cétones et de dérivés nitrés. Des tentatives de couplages pinacoliques de pyruvamides nous ont par la suite entraîné vers l'étude d'une réduction très originale d'aldéhydes aromatiques par le diméthylphosphite. Le mécanisme implique probablement un réarrangement de type Phospha-Brook avec formation directe de phosphates benzyliques. Quelques applications synthétiques de cette réaction ont été testées avant de revenir sur la chimie des isonitriles. Nous avons pu combiner une réaction de type Ugi avec une cyclisation de N-acyliminium dans une synthèse très courte de dicétopipérazines tricycliques.

Les dicétopipérazines (DKP : diketopiperazines) sont une classe de produits naturels largement utilisée en médecine. Chez les organismes producteurs, elles peuvent servir de facteurs de virulence, de molécules de signalisation ou encore être impliquées dans la concurrence entre (micro-)organismes ou la défense contre les prédateurs, mais souvent leur rôle est inconnu. Elles peuvent être synthétisées par deux voies de biosynthèse principales : soit par des voies dépendant de synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS: Non Ribosomal Peptide Synthetase), des complexes enzymatiques de grande taille utilisant comme substrats les acides aminés protéinogènes ou non, soit par des voies dépendant des cyclodipeptide synthases (CDPS), de petites enzymes utilisant comme substrats des ARNt chargés. Je me suis intéressé à ce deuxième type de voie de biosynthèse. J’ai d’abord participé à une étude visant à caractériser la diversité des CDPS et des DKP synthétisées par ces enzymes. Ce travail a permis d’élargir le champ des CDPS caractérisées expérimentalement, de démontrer l’incorporation par ces enzymes de 17 acides aminés dans des DKP et de poser les bases de la prédiction des DKP synthétisées grâce à l’identification dans la séquence protéique des CDPS de motifs de résidus responsables de la sélection du substrat. J’ai ensuite étudié chez Streptomyces venezuelae un cluster de gènes homologues à des gènes essentiels impliqués chez Mycobacterium tuberculosis dans la biosynthèse d’une dicétopipérazine. J’ai enfin identifié chez Streptomyces aizunensis les gènes dirigeant la biosynthèse de la bicyclomycine, un antibiotique de la famille des DKP utilisé en médecine. Je présente la caractérisation complète de la voie de biosynthèse de la bicyclomycine. Cette biosynthèse fait intervenir une CDPS, cinq dioxygénases dépendantes du fer et du 2-oxoglutarate et une monooxygénase de la famille des cytochromes P450. C’est la voie la plus complexe dépendante de CDPS jamais décrite, la seule contenant plusieurs enzymes d’oxydoréduction et la première voie de biosynthèse d’une molécule utilisée en médecine dépendante d’une CDPS. / Diketopiperazines (DKP) are a class of natural products widely used in medicine. In producer organisms, they may act as virulence factors, signaling molecules or may be involved in competition between (micro-) organisms or defense against predators, but often their role is unknown. They can be synthesized by two main biosynthetic pathways: either by non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) dependent pathways, NRPSs being large enzyme complexes using proteinogenic or non-proteinogenic amino acids as substrates, or by Cyclodipeptide synthases (CDPS), small enzymes using loaded tRNAs as substrates. I was interested in this second type of biosynthetic pathway. I first participated in a study having as a goal to characterize the diversity of CDPSs and DKPs synthesized by these enzymes. This work enabled to widen the field of experimentally characterized CDPSs, to demonstrate the incorporation by these enzymes of 17 amino acids in DKPs and to lay the bases for the prediction of the DKPs synthesized thanks to the identification in the protein sequence of CDPSs of residue patterns responsible for substrate selection. I then studied in Streptomyces venezuelae a cluster of genes homologous to essential genes involved in Mycobacterium tuberculosis in the biosynthesis of a diketopiperazine. I finally identified in Streptomyces aizunensis the genes directing the biosynthesis of bicyclomycin, an antibiotic of the DKP family used in medicine. I present the complete characterization of the bicyclomycin biosynthetic pathway. This biosynthesis involves a CDPS, five iron-2-oxoglutarate-dependent dioxygenases and a cytochrome P450 monooxygenase. It is the most complex CDPS-dependent pathway ever described, the only one containing several redox enzymes and the first CDPS-dependent biosynthetic pathway for a molecule used in medicine.

Le nombre des génomes bactériens séquencés disponibles dans les bases des données ne cesse d’augmenter. Grâce au développement d’outils bio informatiques, l’exploration de ces données génomiques est devenue beaucoup plus aisée. Ces analyses génomiques révèlent qu’un important réservoir de gènes du métabolisme spécialisé, et potentiellement de métabolites bioactifs, reste encore à explorer. J’ai étudié le métabolisme spécialisé d’une souche de Streptomyces appelée Streptomyces sp.TN58, isolée à partir d’un échantillon de sol tunisien et retenue pour son spectre d’activité biologique assez large. Son génome a été séquencé dans le cadre de ce travail. Je me suis particulièrement intéressée à la biosynthèse de deux familles de métabolites spécialisés, les acyl alpha-L-rhamnopyranosides et les dicétopipérazines.Les acyl alpha-L-rhamnopyranosides sont des composés qui possèdent un groupement rhamnose lié à un groupement acyle. Ils présentent plusieurs activités d’intérêt médical (antitumorale, antifongique, antibactérienne…). Leur biosynthèse par des Streptomyces a déjà été décrite, mais aucune étude de leur voie de biosynthèse n’est disponible dans la littérature. La souche Streptomyces sp.TN58 était connue pour produire deux molécules de cette famille. J’ai montré qu’elle en produisait une troisième et j’ai recherché quels gènes dirigeaient leur biosynthèse. J’ai pu identifier les gènes impliqués dans la biosynthèse du précurseur rhamnose et montrer qu’ils sont impliqués dans la biosynthèse des acyl alpha-L-rhamnopyranosides. Les gènes localisés au voisinage de ceux qui dirigent la biosynthèse du rhamnose ne sont pas impliqués dans la biosynthèse des acyl alpha-L-rhamnopyranoides. Cette organisation est originale, car tous les gènes impliqués dans la biosynthèse d’un métabolite spécialisé ne sont pas groupés, contrairement à ce qui est classiquement trouvé chez les Streptomyces et plus généralement chez les microorganismes. L’analyse du génome de Streptomyces sp. TN58 a permis l’identification d’autres gènes candidats, mais l’inactivation de certains de ces gènes n’abolit pas la biosynthèse des trois molécules d’acyl alpha-L-rhamnopyranoside. Ceci peut suggérer plusieurs enzymes promiscuitaires pourraient être impliquées dans la biosynthèse des acyl alpha-L-rhamnopyranosides.Les dicétopipérazines sont des dérivés de dipeptides cycliques et constituent une classe de produits naturels possédant des activités biologiques diverses, mais leur rôle physiologique chez l’organisme producteur reste peu connu. Elles peuvent être synthétisées par des mégacomplexes enzymatiques, les synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS), ou par des cyclodipeptides synthases (CDPS). Ces dernières sont des enzymes de petite taille utilisant des ARN de transfert amino-acylés comme substrat. Les cyclodipeptides synthétisés peuvent subir différentes modifications, ce qui explique la diversité de leur structure chimique. L’analyse du génome de Streptomyces sp.TN58 a permis d’identifier un cluster de deux gènes (codant une CDPS et un cytochrome P450) homologues à des gènes impliqués dans la biosynthèse d’une dicétopipérazine (la mycocyclosine) chez Mycobacterium tuberculosis. J’ai identifié les produits dont la biosynthèse est dirigée par ces gènes. J’ai construit des souches mutées pour tester l’hypothèse d’un rôle de ces produits dans la signalisation pour la différenciation morphologique et la production d’antibiotiques chez Streptomyces sp.TN58. Les premiers résultats obtenus semblent en accord avec cette hypothèse. / The number of sequenced bacterial genomes available in databases is steadily increasing. With the development of bioinformatics tools, the exploration of these genomic data has become much easier. These genomic analyzes reveal that an important reservoir of genes for specialized metabolism, and potentially bioactive metabolites, remains to be explored. The vast majority of bacterial specialized metabolism was therefore ignored. I studied the specialized metabolism of a Streptomyces strain called Streptomyces sp.TN58, isolated from a Tunisian soil sample and retained for its broad spectrum of biological activity. Its genome has been sequenced in the frame of this work. I was particularly interested in the biosynthesis of two families of specialized metabolites, acyl alpha-L-rhamnopyranosides and diketopiperazines (DKPs).Acyl alpha-L-rhamnopyranosides are compounds having a rhamnose group linked to an acyl group. They possess a variety of biological activities of medical interest (anti-tumor, antifungal, antibacterial…). Their production by Streptomyces sp. has been described previously but no study of their biosynthetic pathway is available in literature. Streptomyces sp.TN58 strain was known to produce two molecules of this family. I showed that it produced a third one and I looked for the genes directing their biosynthesis. I have identified the genes involved in the biosynthesis of the rhamnose precursor and shown that their inactivation abolished the biosynthesis of acyl alpha-L-rhamnopyranosides. However, the genes located in the vicinity of the rhamnose biosynthetic genes are not involved in acyl alpha-L-rhamnopyranoside biosynthesis. This organization is unusual because all the genes directing the biosynthesis of a specialized metabolite are not clustered, contrarily to what is usually found in Streptomyces and more generally in microorganisms. A genome-mining approach allowed the identification of candidate genes, but the inactivation of some of these genes did not abolish the biosynthesis of the three acyl alpha-L-rhamnopyranoside molecules. This suggests that several rather promiscuous enzymes might be involved in the biosynthesis of acyl alpha-L-rhamnopyranosides.DKPs are cyclic dipeptide derivatives. This class of natural products possesses a wide variety of biological activities, but their physiological role in the producing organism remains often unknown. DKPs can be synthesized by non-ribosomal peptide synthases (NRPSs) or by cyclodipetide synthases (CDPSs). Contrarily to NRPSs which are enzymatic megacomplexes using amino acids as substrate, CDPSs are small enzymes using amino-acylated tRNAs as a substrate. The synthesized cyclodipeptides can undergo various modifications, which explains the diversity of DKP chemical structures. Mining the genome of Streptomyces sp. TN58 allowed the identification of a cluster of two genes (encoding a CDPS and a cytochrome P450) homologous to genes involved in the biosynthesis of a DKP (mycocyclosin) in Mycobacterium tuberculosis. I managed to identify the DKP synthesized. I constructed mutant strains to test the hypothesis that these DKPs could play a role as signaling molecules for morphological differentiation and antibiotic production in Streptomyces sp.TN58. Preliminary results seem to support this hypothesis

Les cyclodipeptides et leurs dérivés, les dicétopipérazines (DKP), constituent une large classe de métabolites secondaires aux activités biologiques remarquables qui sont essentiellement synthétisés par des microorganismes. Les voies de biosynthèse de certaines DKP contiennent des synthases de cyclodipeptides (CDPS), une famille d’enzymes récemment identifiée. Les CDPS ont la particularité de détourner les ARNt aminoacylés de leur rôle essentiel dans la synthèse protéique ribosomale pour les utiliser comme substrats et ainsi catalyser la formation des deux liaisons peptidiques de différents cyclodipeptides. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit a pour objectif de caractériser la nouvelle famille des CDPS. Dans un premier temps, la caractérisation tant structurale que mécanistique de la première CDPS identifiée, AlbC de Streptomyces noursei, est présentée. Puis, les résultats obtenus avec trois autres CDPS, chacune de ces enzymes ayant des caractéristiques adéquates pour approfondir l’étude de la famille des CDPS, sont décrits. Ainsi, la CDPS Ndas_1148 de Nocardiopsis dassonvillei a permis d’étendre nos connaissances sur les bases moléculaires de la spécificité des CDPS. La CDPS AlbC-IMI de S. sp. IMI 351155 est un bon modèle pour analyser l’interaction de chacun des deux substrats nécessaires à la formation d’un cyclodipeptide. Enfin, la caractérisation de la CDPS Nvec-CDPS2 chez l’animal Nematostella vectensis a permis de fournir le premier exemple d’enzyme d’origine animale impliquée dans la synthèse peptidique non ribosomale. / Cyclodipeptides and their derivatives, the diketopiperazines (DKPs), constitute a large class of secondary metabolites with noteworthy biological activities that are mainly synthesized by microorganisms. The biosynthetic pathways of some DKPs contain cyclodipeptide synthases (CDPSs), a newly defined family of enzymes. CDPSs hijack aminoacyl-tRNAs from their essential role in ribosomal protein synthesis to catalyze the formation of the two peptide bonds of various cyclodipeptides. The aim of the work presented in this thesis manuscript is to characterize the CDPS family. At first, the structural and mechanistic characterization of the first identified CDPS, AlbC of Streptomyces noursei, is presented. Then, the results obtained with three other CDPSs, each of which having suitable properties to increase our understanding of the CDPS family, are described. The CDPS Ndas_1148 of Nocardiopsis dassonvillei extends our knowledge of the molecular bases of the CDPS specificity. The CDPS AlbC-IMI of S. sp. IMI 351155 is a good model to analyze the interaction of each of the two substrates required for the formation of a cyclodipeptide. Finally, the characterization of the CDPS Nvec-CDPS2 from Nematostella vectensis provides the first example of enzymes of animal origin involved in nonribosomal peptide synthesis.