Parte da produção de fatores de virulência em bactérias do gênero Xanthomonas esta sob controle de um grupo de genes localizados no locus rpf (regulation of pathogenicity factors), que respondem ao aumento da densidade celular num processo chamado quorum sensing. Os genes que codificam as proteínas do sistema Rpf de Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) foram clonados no vetor pOBD por Alegria (2004), e usados como iscas em ensaios de dois híbridos, contra uma biblioteca de Xac clonada no vetor pOAD. Neste ensaio, foram observadas interações entre RpfC-RpfG, RpfC-RpfF, RpfF-RpfF e RpfC-CMF. O gene cmf tem um ortólogo, cuja função esta relacionada com o processo de quorum sensing em Dictyostelium. Para confirmar essas interações, RpfC e seus domínios, RpfG, RpfF e CMF foram expressas e purificadas, produzidos anticorpos, e foram efetuados ensaios de ligação in vitro. Em adição, o domínio HD-GYP de RpfG, que apresenta atividade de fosfodiesterase, também foi usado como isca no ensaio de dois híbridos. Interessantemente, a maioria de suas presas foi derivada de domínios GGDEF (diguanilato ciclase) de um grupo de proteínas de Xac. Em bactérias, muitos fenótipos, como a ativação da virulência, a formação de biofilme e a mobilidade, são controlados pelo processo de quorum sensing e por diGMP cíclico. Neste trabalho demonstramos uma ligação direta entre quorum sensing e diGMP cíclico, representada pela interação entre HD-GYP/GGDEF. Finalmente, estudos com um mutante para o gene cmf interrompido, envolvendo formação de biofilme, produção de goma xantana e patogenicidade, evidenciam que CMF tem uma função relevante no processo de quorum sensing em Xanthomonas. / In Xanthomonas a group of genes named regulators of the pathogenicity factors (rpf) control the synthesis of virulence factors as a function of cellular density in a process termed quorum sensing. Alegria (2002) cloned the rpf genes from Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) in the pOBD vector and used them as baits in two hybrid assays against a Xac prey library cloned in the pOAD vector and showed that RpfC interacts with RpfG, RpfF and CMF. Homologous of the cmf gene are found only in amoebas such as Dictyostelium, where plays a central function in the quorum sensing process. In this work, we expressed and purified RpfC and its domains, RpfG, RpfF and CMF and raised antibodies against these polypeptides. In vitro assays demonstrated the following interactions: RpfC-RpfF, RpfC-RpfG and RpfC-CMF. We show that RpfG and CMF interact with the response regulator domain of RpfC, and interactions RpfG and CMF also interact with the histidine phosphotransfer domain of RpfC. In addition, the recently characterized HD-GYP phosphodiesterase domain of RpfG was used as bait in the two hybrid assays. Interestingly, the majority of its preys were derived from a set of Xac proteins that possess GGDEF domains (diguanilate cyclase). In bacteria, many complex processes such virulence, motility and biofilm production are controlled by quorum sensing process and by levels of the second messenger cyclic diGMP. Our results demonstrate a direct link between quorum sensing and diGMP cyclic signaling pathways in the form of a direct physical interaction between the RpfG HD-GYP domain and GGDEF domains. Finally, studies with a Xac cmf-mutant show that CMF plays an important role in the quorum sensing process in Xanthomonas, including biofilm production, synthesis of xanthan gum and pathogenicity.

Parte da produção de fatores de virulência em bactérias do gênero Xanthomonas esta sob controle de um grupo de genes localizados no locus rpf (regulation of pathogenicity factors), que respondem ao aumento da densidade celular num processo chamado quorum sensing. Os genes que codificam as proteínas do sistema Rpf de Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) foram clonados no vetor pOBD por Alegria (2004), e usados como iscas em ensaios de dois híbridos, contra uma biblioteca de Xac clonada no vetor pOAD. Neste ensaio, foram observadas interações entre RpfC-RpfG, RpfC-RpfF, RpfF-RpfF e RpfC-CMF. O gene cmf tem um ortólogo, cuja função esta relacionada com o processo de quorum sensing em Dictyostelium. Para confirmar essas interações, RpfC e seus domínios, RpfG, RpfF e CMF foram expressas e purificadas, produzidos anticorpos, e foram efetuados ensaios de ligação in vitro. Em adição, o domínio HD-GYP de RpfG, que apresenta atividade de fosfodiesterase, também foi usado como isca no ensaio de dois híbridos. Interessantemente, a maioria de suas presas foi derivada de domínios GGDEF (diguanilato ciclase) de um grupo de proteínas de Xac. Em bactérias, muitos fenótipos, como a ativação da virulência, a formação de biofilme e a mobilidade, são controlados pelo processo de quorum sensing e por diGMP cíclico. Neste trabalho demonstramos uma ligação direta entre quorum sensing e diGMP cíclico, representada pela interação entre HD-GYP/GGDEF. Finalmente, estudos com um mutante para o gene cmf interrompido, envolvendo formação de biofilme, produção de goma xantana e patogenicidade, evidenciam que CMF tem uma função relevante no processo de quorum sensing em Xanthomonas. / In Xanthomonas a group of genes named regulators of the pathogenicity factors (rpf) control the synthesis of virulence factors as a function of cellular density in a process termed quorum sensing. Alegria (2002) cloned the rpf genes from Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) in the pOBD vector and used them as baits in two hybrid assays against a Xac prey library cloned in the pOAD vector and showed that RpfC interacts with RpfG, RpfF and CMF. Homologous of the cmf gene are found only in amoebas such as Dictyostelium, where plays a central function in the quorum sensing process. In this work, we expressed and purified RpfC and its domains, RpfG, RpfF and CMF and raised antibodies against these polypeptides. In vitro assays demonstrated the following interactions: RpfC-RpfF, RpfC-RpfG and RpfC-CMF. We show that RpfG and CMF interact with the response regulator domain of RpfC, and interactions RpfG and CMF also interact with the histidine phosphotransfer domain of RpfC. In addition, the recently characterized HD-GYP phosphodiesterase domain of RpfG was used as bait in the two hybrid assays. Interestingly, the majority of its preys were derived from a set of Xac proteins that possess GGDEF domains (diguanilate cyclase). In bacteria, many complex processes such virulence, motility and biofilm production are controlled by quorum sensing process and by levels of the second messenger cyclic diGMP. Our results demonstrate a direct link between quorum sensing and diGMP cyclic signaling pathways in the form of a direct physical interaction between the RpfG HD-GYP domain and GGDEF domains. Finally, studies with a Xac cmf-mutant show that CMF plays an important role in the quorum sensing process in Xanthomonas, including biofilm production, synthesis of xanthan gum and pathogenicity.

O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.

O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.