Municipal wastewater treatment plants (MWWTPs) are point sources of environmental contamination that can cause adverse effects on fish species exposed to their effluents (MWWEs). Contaminants, such as endocrine disrupting compounds (EDCs), commonly found in MWWEs have been shown to induce many adverse reproductive effects. In the Grand River watershed of southern Ontario, three MWWTPs from the cities of Guelph, Waterloo and Kitchener have been identified to adversely alter molecular and cellular responses in fish, which have been previously associated with exposure to estrogenic EDCs. Currently these systems are undergoing process upgrades to address aging infrastructure as well as expanding capacities to serve rapidly increasing populations. Studies in this thesis were conducted to determine whether the Guelph and Waterloo MWWEs, as well as surrogate pilot plant effluents that modeled possible treatment process upgrades for MWWTPs were estrogenic in vivo in controlled laboratory exposures. Unfortunately, the Kitchener MWWE (conventional activated sludge and lagoon) was acutely toxic and could not be included in laboratory exposures. Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were exposed to 20% to 90% effluent from both Guelph and Waterloo, for 2, 8 and 14 days and fish plasma was analyzed for vitellogenin (VTG) a biomarker for estrogenic exposure. These exposures indicated that neither the Guelph nor the Waterloo MWWE were estrogenic in vivo under the exposure conditions in this study. In contrast the total estrogenic equivalence measured using the yeast estrogen screen (YES) of the Guelph, Waterloo and Kitchener MWWEs increased respectively, inversely related to the degree of treatment. Three pilot plant effluents (Burlington MWWTP) including conventional activated sludge (CAS), nitrifying with CAS (CAS-N) and biological nutrient removal with CAS (CAS-BNR) were also tested in rainbow trout in vivo for plasma VTG induction. Only the CAS-BNR effluent caused weak (2-3.5 fold) induction of VTG relative to controls. Although the estrogenicity (YES) of the effluent was variable the VTG induction corresponded with the slightly higher 17??-estradiol equivalents measured in these pilot plant effluents. An effect-directed analysis (EDA) for estrogenic substances was carried out on the Waterloo and Kitchener MWWEs and revealed that the estrogenicity (YES) of the Waterloo MWWE was associated with estrone, while the estrogenicity of the Kitchener MWWE was associated with several chemicals (estrone > 17??-estradiol > bisphenol A ~ testosterone).

Les méthodes actuellement disponibles pour la surveillance de la qualité du milieu se réfèrent au suivi de composés définis par les réglementations et ne permettent pas d’appréhender l’(éco)toxicité réelle de tous les composés présents dans l’environnement (e.g. composés inconnus, produits de transformation, effets de mélange…). Dans ce contexte, une méthode d’analyse pluridisciplinaire intégrative, l’analyse dirigée par l’effet (EDA), a été développée. Cette approche bio-analytique vise à établir un lien de causalité entre une exposition aux contaminants et l’effet biologique observé. La démarche est basée sur la simplification séquentielle d’un échantillon guidée par les bio-essais afin d’individualiser puis identifier, par des techniques analytiques chimiques performantes, les composés biologiquement actifs. Les objectifs de cette thèse ont porté sur (1) le développement et la validation d’une méthodologie, allant du pré-traitement jusqu’au fractionnement, adaptée à différentes matrices environnementales ; (2) la mise en place d’une stratégie d’identification moléculaire par spectrométrie de masse haute résolution ; (3) l’application de la démarche EDA à plusieurs échantillons afin d’illustrer l’adaptabilité et l’apport d’une telle méthode à des problématiques environnementales. Ces travaux de thèse permettent de disposer aujourd’hui d’une démarche bio-analytique complète de la préparation d’échantillon à l’identification de molécules, et adaptée à tous types d’échantillons. Les différentes études environnementales réalisées au cours de ces travaux ont permis, entre autre, d’établir une liste de composés diverses non recherchés pouvant représenter un risque pour l’environnement. / To date, environmental risk assessment is based on targeted chemical analyses. These analyses allow the detection of known active compounds and this preselected set does not often explain the observed toxic effects in complex environmental samples (e.g. unknown compounds, transformation product, cocktail effect...). For an integrative contamination assessment, a multidisciplinary approach, Effect-Directed Analysis (EDA) was developed. This approach combining biological tools and chemical analyses allows determining active compounds and identitying them in such environmental complex mixtures. EDA aims at the establishment of cause-effect relationships by sequential reduction of the complexity of environmental mixtures, eventually to individual toxicants. The aims of this thesis were (1) to develop and to validate the EDA-based strategy on various environmental complex samples; (2) to set up an identification strategy for identifying non targeted or unknown molecules using high resolution mass spectrometry; (3) to prove the usefulness of EDA approach for the identification of active compounds in environnemental complex samples. This thesis work provides to a complet bio-analytical approach from the preparation step of samples to the identification of molecules. The potential of this tool was fully confirmed on various environmental studies. These investigations allowed establishing a list of non-target compounds which can represent a risk for the environment.

L’objectif de ce projet a été de développer une approche bio-analytique permettant l’évaluation du danger inhérent à la multi-contamination de l’air intérieur en Ile-de-France. Des méthodes d’analyse chromatographique couplée à la spectrométrie de masse ont été développées et validées pour 62 composés d’intérêt présentant un potentiel perturbateur endocrinien (PE) avéré ou suspecté. Le potentiel PE a été évalué sur des bio-essais cellulaires de mesure de perturbation d’activité transcriptionnelle. Les résultats montrent que les familles de composés majoritaires dans l’air intérieur sont, par ordre décroissant : phtalates > muscs synthétiques > alkylphénols > parabènes. En outre, les composés sont prédominants en phase gazeuse, et les habitats les plus contaminés sont la crèche et la maison. L’air intérieur présente un potentiel PE de type œstrogénique, thyroïdien et anti-androgénique. En accord avec son profil de contamination, l’activité biologique de ce dernier se concentre majoritairement dans la phase gazeuse, et tend à être plus élevée dans la crèche et la maison. Une analyse dirigée par les bio-essais, ou effect-directed analysis (EDA), a été mise en œuvre pour identifier les composés cibles à l’origine des effets PE de l’air intérieur. Les composés suivants ont été identifiés comme étant potentiellement à l’origine d’effets PE observés : les phtalates, le méthyl-parabène, les alkylphénols, la cyperméthrine et les muscs synthétiques. Ce travail apporte des connaissances sur le danger inhérent à la multi-contamination de l’air intérieur ainsi que des données d’exposition utiles à une évaluation des risques sanitaires. / The objective of this project was to develop a bio-analytical approach leading to the assessment of the inherent hazard of the indoor air multi-contamination. Chromatographic methods combined with mass spectrometry were developed and validated for 62 target molecules known or suspected as endocrine-disrupting (ED) compounds. The ED potential was assessed by cellular bioassays measuring perturbations of transcriptional activity. The data showed that the predominant families of compounds in indoor air were in the following descendant order: phthalates > musks > alkylphenols > parabens. The ED contaminants were mainly present in gaseous phase, and the most contaminated locations were the day nursery and the house. An estrogenic, thyroid and anti-androgenic potential was attributed to indoor air. In agreement with its contamination profile, the biological activity of the latter was concentrated predominantly in the gaseous phase, and tended to be higher in the day nursery and the house. An effect-directed analysis (EDA) was carried out to identify the target chemicals responsible for the ED effects of indoor air. The following chemicals were identified as being potentially responsible for the observed ED effects: phthalates, methyl-paraben, alkylphenols, cypermethrin and synthetic musks. This work provides both knowledge about the inherent hazard of the indoor air multi-contamination and exposure data useful in health risk assessment.

De nos jours, l’évaluation de la qualité d’un milieu naturel repose traditionnellement sur des analyses ciblant des molécules déjà connues pour être biologiquement actives. Cependant ces molécules ne reflètent que partiellement les effets biologiques observés et la complexité des matrices environnementales. Par ailleurs, les contaminants dans l’environnement subissent des phénomènes de dégradation (hydrolyse, biodégradation, photodégradation). Ces processus peuvent conduire à la génération de produits de transformation qui sont encore trop peu pris en compte dans l’évaluation du risque, alors qu’ils sont susceptibles d’occasionner des effets toxiques plus importants que les molécules mères. L’impact écotoxicologique de ces mélanges nécessite préalablement l’obtention d’une vision globale quant à la présence et au devenir de ces molécules.Dans ce contexte, ces travaux appliquent une méthodologie pluridisciplinaire afin d’identifier des molécules préoccupantes et pertinentes à surveiller. Pour cela, ce travail s’appuie sur des analyses ciblées ultra-traces, des outils bioanalytiques, et des analyses non ciblées, qui ont été appliqués sur des échantillons environnementaux ou issus d’études en laboratoire mimant l’évolution des matrices environnementales. Au final, cette étude a permis : (1) d’identifier des molécules préoccupantes en estuaire de Seine sur la base de leur occurrence et de leur persistance, (2) d’identifier de nouveaux produits de transformation et (3) d’identifier les molécules responsables d’activités biologiques dans des matrices très complexes. / To date, environmental risk assessment is based on a restricted number of molecules assessed by targeted chemical analyses. However, this approach give a partial picture of co-occurrence of known and unknown compounds. Moreover, in the aquatic environment, chemicals are not completely mineralized and are subject to abiotic and biotic processes. Transformation products (TPs) can be more toxic and more persistent than the parent compound. However, TPs are not typically included in classical monitoring and risk assessment. Because of complexity and variability of these matrices and the restricted number of molecules focused in targeted chemical analyses, selection of relevant molecules for environmental monitoring is often laborious.In this context, an integrative approach was used in order to identify chemicals of concern for a classical monitoring. This work has been realized on environmental complex samples and on laboratory-generated samples. A combination of targeted, non-targeted analyses and in vitro bioassays was performed and allowed to: (1) identify polar chemical of concern in the Seine estuary on the basis of occurrence and persistence, (2) identify new transformation products and (3) identify compounds responsible of biological activity observed in complexes matrices.

Ein kompetitiver ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) für den Nachweis von Carbamazepin (CBZ) mit einer Bestimmungsgrenze von ca. 30 ng/L wurde entwickelt und validiert. Dieser in Gewässern häufig auftretende anthropogene Marker wurde anschließend in einer Vielzahl an Proben aus Abwässern, Oberflächengewässern und Trinkwässern nachgewiesen. Der ELISA zeigte eine exzellente Präzision und erbrachte in allen Matrizes geringfügig höhere Analysenergebnisse als die Referenzmethode HPLC-MS/MS. Die beständige Überbestimmung der CBZ-Konzentration in Höhe von ca. 7 % konnte auf die Präsenz von Cetirizin und geringen Mengen des persistenten Metaboliten 10,11 Epoxy¬carbamazepin (EP-CBZ) zurückgeführt werden. Die Bindungseigenschaften des verwendeten Antikörpers wurden anhand der Kreuz¬reaktivi¬täten von 37 Substanzen eingehend untersucht. Nach Kopplung von Flüssig¬chromato¬graphie und ELISA konnte das strukturell nicht mit CBZ verwandte Anti¬histaminikum Cetirizin als Kreuzreaktand identifiziert werden. Der störende Einfluss dieses Kreuz¬reaktanden auf den CBZ-ELISA konnte nach einer Änderung des pH-Wertes im Proben¬puffer minimiert werden. Die pH-abhängige Selektivitätssteuerung ermöglichte überdies die Entwicklung eines Dual-Analyt-Immunoassays für die parallele Bestimmung von CBZ und Cetirizin. Darüber hinaus wurden die Metaboliten EP-CBZ, DiOH-CBZ, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ und 10 OH-CBZ in Abwasser, Oberflächenwasser und Trinkwasser quantifiziert. DiOH-CBZ erwies sich als ähnlich persistent wie CBZ und wurde in besonders hohen Konzentrationen gefunden. Außerdem wurden mehrere weitere bislang nicht identifizierte Abbauprodukte von CBZ gefunden. Da weder Probenvorbereitung noch Probenanreicherung erforderlich sind, ist der Test schnell und kostengünstig durchführbar. Die für den Test nötigen Probenvolumen sind mit weniger als 1 mL sehr gering. Diese Eigenschaften erlauben ein Hochdurchsatzscreening und machen die Methode interessant für den Einsatz im Gewässermonitoring. / A competitive ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for the quantitation of carbamazepine (CBZ) was developed and validated. A limit of quantitation (LOQ) of ca. 30 ng/L allowed for the quantitation of CBZ in many samples from wastewater, surface water and drinking water. The method was found to be excellently precise, but it displayed slightly higher results than obtained by the reference method liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The nearly constant overestimation of 7 % could be attributed to the presence of small amounts of cetirizine and the persistent metabolite 10,11 epoxy¬carbamazepine (EP-CBZ). The binding properties of the antibody were studied by determining the cross-reactivities of 37 compounds. Hyphenating liquid chromatography to ELISA led to the discovery of the cross-reactive antihistamine cetirizine that shares no obvious structural similarity with CBZ. The bias caused by cetirizine was eliminated by changing the pH value of the sample buffer. Moreover, the antibody’s pH-dependent selectivity enabled a dual-analyte immunoassay for the parallel determination of CBZ and cetirizine. Furthermore, the metabolites EP-CBZ, DiOH-CBZ, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ and 10-OH-CBZ were quantified in wastewater, surface water and drinking water. DiOH-CBZ showed the highest concentrations of all analaytes investigated and was found to be equally persistent as CBZ. In addition, several further degradation products of CBZ were found that could not be identified. The ELISA allowed the detection of diurnal and seasonal fluctuations of analyte concentrations in wastewater and surface water. The anthropogenic marker CBZ enabled to trace wastewater from the source to the receiving waters. Since neither sample pretreatment nor enrichment is necessary, the method is very fast and cost-effective. Only a small sample volume (less than 1 mL) is needed making this ELISA an appropriate high-throughput screening tool for environmental monitoring.