Thema dieser Arbeit ist die evolutive Optimierung der T7-RNA-Polymerase. Zur Stabilisierung technischer oder therapeutischer RNA-Moleküle gegenüber RNAsen wäre es wünschenswert eine RNA-Polymerase zu generieren, welche RNA vollständig aus 2’- modifizierten Nucleotiden synthetisieren kann. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes Selektions- und Screeningverfahren zur Durchmusterung von Variantenbibliotheken der T7- RNA-Polymerase hinsichtlich des Einbaus von 2’-Methoxy-modifizierten Nucleotiden in RNA entwickelt. Es wurden ein gut handhabbarer, cis-regulierter Expressionsvektor sowie ein Selektionsplasmid erzeugt, die zusammen in E. coli ein in-vivo-Selektionssystem bilden, mit dessen Hilfe man Zellen, welche T7-RNA-Polymerase-Aktivität zeigen anhand ihrer grünen Fluoreszenz identifizieren konnte. Durch error-prone PCR wurden Mutantenbibliotheken generiert, und diese in das Selektionssystem eingesetzt. So konnte die Anzahl der potentiell zu testenden Varianten erheblich gesenkt werden. Zur Bestimmung der T7-RNA-Polymerase- Aktivität mit 2’-Methoxy-modifizierten Nucleotiden wurde ein Fluoreszenz-basierendes Assay etabliert. Dieses Assay, das nicht mit radioaktiv-markierten Nucleotiden arbeitete und keinen gelelektrophoretischen Separationsschritt benötigte, konnte in allen Schritten zur parallelen Bearbeitung von 96 Proben in einem Mikrotiterplatten-Format angepasst werden, so dass es prinzipiell hochdurchsatzfähig war und sich zum Screening umfangreicher Variantenbibliotheken eignete. Die Assay-Reaktion kann dabei auch unkompliziert auf ein Screening von RNA- oder DNA-Polymerase-Bibliotheken hinsichtlich anderer Eigenschaften der Polymerase-Aktivität übertragen werden.

Thema dieser Arbeit ist die evolutive Optimierung der T7-RNA-Polymerase. Zur Stabilisierung technischer oder therapeutischer RNA-Moleküle gegenüber RNAsen wäre es wünschenswert eine RNA-Polymerase zu generieren, welche RNA vollständig aus 2’- modifizierten Nucleotiden synthetisieren kann. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes Selektions- und Screeningverfahren zur Durchmusterung von Variantenbibliotheken der T7- RNA-Polymerase hinsichtlich des Einbaus von 2’-Methoxy-modifizierten Nucleotiden in RNA entwickelt. Es wurden ein gut handhabbarer, cis-regulierter Expressionsvektor sowie ein Selektionsplasmid erzeugt, die zusammen in E. coli ein in-vivo-Selektionssystem bilden, mit dessen Hilfe man Zellen, welche T7-RNA-Polymerase-Aktivität zeigen anhand ihrer grünen Fluoreszenz identifizieren konnte. Durch error-prone PCR wurden Mutantenbibliotheken generiert, und diese in das Selektionssystem eingesetzt. So konnte die Anzahl der potentiell zu testenden Varianten erheblich gesenkt werden. Zur Bestimmung der T7-RNA-Polymerase- Aktivität mit 2’-Methoxy-modifizierten Nucleotiden wurde ein Fluoreszenz-basierendes Assay etabliert. Dieses Assay, das nicht mit radioaktiv-markierten Nucleotiden arbeitete und keinen gelelektrophoretischen Separationsschritt benötigte, konnte in allen Schritten zur parallelen Bearbeitung von 96 Proben in einem Mikrotiterplatten-Format angepasst werden, so dass es prinzipiell hochdurchsatzfähig war und sich zum Screening umfangreicher Variantenbibliotheken eignete. Die Assay-Reaktion kann dabei auch unkompliziert auf ein Screening von RNA- oder DNA-Polymerase-Bibliotheken hinsichtlich anderer Eigenschaften der Polymerase-Aktivität übertragen werden.