La microscopie de fluorescence a récemment été complétée par une technique appelée dichroïsme linéaire résolu angulairement, basé sur le fait que l'absorption de la lumière est un processus sensible à l'orientation moléculaire. En analysant la réponse d'émission de fluorescence en fonction de l'orientation de la polarisation de la lumière excitatrice, cette technique permet de remonter à l'information d'orientation sur un ensemble de molécules fluorescentes, plus précisément son angle d'orientation moyenne et l'amplitude de ses fluctuations angulaires autour de cette moyenne. Dans cette thèse, nous mettons en oeuvre de nouvelle méthodes et instrumentations capables d'améliorer la robustesse et la rapidité de l'analyse de données de réponses résolues en polarisation, la vitesse de l'acquisition de données, et d'explorer la possibilité de mesurer l'orientation 3D de molécules. Nous proposons une méthode capable de mesurer les propriétés d'orientation de sondes lipidiques fluorescentes par l'utilisation d'un disque de Nipkow couplé à une imagerie par caméra, et combiné avec la modulation rapide de la polarisation par modulateur électro-optique. Une nouvelle méthode de traitement de données est développée pour considérablement améliorer la rapidité et la précision de l'information par une étude des sources de bruit et d'incertitude, dues au bruit et aux facteurs instrumentaux. Cette technique a été testée avec succés sur des vésicules géantes uni-lamellaires et sur cellules vivantes, marquées par les sondes lipidiques DiIC18 et di-8-ANEPPQ. Cette méthode est capable d'acquérir une information précise sur l'orientation moléculaire à une cadence d'une image par seconde. Enfin, afin de sonder de manière non ambiguë l'orientation 3D d'un ensemble de molécules, une nouvelle méthode est proposée, supportée par des simulations numériques, basée sur la variation hors plan de la polarisation d'excitation dans le volume focal par une somme cohérente de champs polarisés linéairement et radialement.