RIOS, N. S. Estudo de imobilização da lipase do tipo B de Candida antarctica em silicato mesoporoso nanoestruturado (SBA-15) visando a aplicação em reações de elevado interesse industrial. 107 f. 2016. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2016-03-18T16:49:44Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_nsrios.pdf: 2080864 bytes, checksum: cd846400c8ad879619379692fcbf7804 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2016-03-30T18:19:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_nsrios.pdf: 2080864 bytes, checksum: cd846400c8ad879619379692fcbf7804 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T18:19:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_nsrios.pdf: 2080864 bytes, checksum: cd846400c8ad879619379692fcbf7804 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / A recombinant Candida antarctica lipase B expressed in Pichia pastoris by insertion of an external DNA (LIPB) was i mmobilized in nanostructured mesoporous silicas of SBA - 15 type by physical adsorption (SBA - 15 - LIPB) and covalent attachment (SBA - 15 - APTES - GA - LIPB e SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB ) . Influence of contact time enzyme - support and the medium pH were ev aluated to the production of biocatalyst s . T he thermal stability of immobilized enzymes were evaluated and the results showed that the SBA - 15 - APTES - GA - LIPB has the best thermal stability with t 1/2 = 36,91 min while the SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB has t 1/2 = 11,83 min and the SB A - 15 - LIPB has t 1/2 = 8,5 min, a t 50 ºC . However, the SBA - 15 - LIPB has high stability in organic solvents than the biocatalysts produced by covalent attachment. Therefore, the biocatalyst SBA - 15 - LIPB (Optimized conditions: 100 % of the recovery activity an 1 hour of contact time, pH 7) was applied in a model esterification reaction in the short chain esters synthesis, the methyl and ethyl butyrate. The results showed that in optimized conditions of esterification (temperatur e: 37 ᵒ C, solvent type: hexane for the methyl butyrate and isooctane for ethyl butyrate synthesis, substrate concentration: 0,2 mol/L, molar ratio of substrates 1:1, time of reaction: 12 h) the conversions were: 79.25 % for the methyl butyrate synthesis an d 86.52 % for ethyl butyrate synthesis. The biocatalyst SBA - 15 - LIPB exhibited high activity and operational stability on the methyl and ethyl butyrate synthesis by esterification after five and six successive cycles of 12 h each, respectively. The biocatalysts SBA - 15 - APTES - GA - LIPB and SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB were applied in a model hydrolysis reaction in the kinetic resolution of the phenylethyl acetate . The experimental data showed that were obtained positive results for both biocatalysts, but t he biocatalyst SBA - 15 - APTES - GA - LIPB was more efficient, producing enantiomeric excess 99 %, conversio n 50 % and enantiomeric ratio 1057. / A lipase do tipo B de Candida antarctica recombinante expressa em Pichia pastoris pela inserção de um DNA externo (LIPB) foi imobilizada em sílica mesoporosa nanoestruturada (SBA-15) pelo método da adsorção (SBA-15-LIPB) e ligação covalente (SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB). A influência do tempo de contato enzima-suporte e do pH do meio foram avaliados para a produção dos biocatalisadores. A estabilidade térmica das enzimas imobilizadas foi avaliada e os resultados mostraram que o SBA-15-APTES-GA-LIPB possui maior estabilidade térmica com um t1/2 = 36,91 min enquanto o derivado SBA-15-APTES-DVS-LIPB teve t1/2= 11,83 min e o SBA-15-LIPB teve t1/2= 8,5 min, a 50 ºC. No entanto, o SBA-15-LIPB possui maior estabilidade em solventes orgânicos do que os biocatalisadores produzidos por ligação covalente. Assim, o biocatalisador SBA-15-LIPB (Condições otimizadas: 100 % de atividade recuperada em um tempo de contato de 1 hora, pH 7) foi aplicado em uma reação modelo de esterificação, que é a síntese de ésteres de cadeia curta, o butirato de metila e etila. Os resultados mostraram que, em condições otimizadas de esterificação (temperatura: 37 ᵒC, tipo de solvente: hexano para o butirato de metila e iso-octano para a síntese do butirato de etila, a concentração de substrato: 0,2 M, proporção molar de substratos de 1: 1, tempo de reação: 12 h), as conversões foram: 79,25% para a síntese de butirato de metila e 86,52% para a síntese de butirato de etila. O biocatalisador SBA-15-LIPB exibiu elevada atividade e estabilidade operacional na síntese do butirato de metila e butirato de etila, por esterificação, depois de cinco e seis ciclos sucessivos de 12 horas cada, respectivamente. Os biocatalisadores SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB foram aplicados em uma reação modelo de hidrólise, que é a resolução cinética do acetato de feniletila. Os dados experimentais mostraram que foram obtidos resultados positivos para ambos os biocatalisadores, mas o biocatalisador SBA-15-APTES-GA-LIPB foi mais eficiente, produzindo excessos enantioméricos de 99 %, conversão de 50 % e razão enantiomérica de 1057.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A lipase do tipo B de Candida antarctica recombinante expressa em Pichia pastoris pela inserÃÃo de um DNA externo (LIPB) foi imobilizada em sÃlica mesoporosa nanoestruturada (SBA-15) pelo mÃtodo da adsorÃÃo (SBA-15-LIPB) e ligaÃÃo covalente (SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB). A influÃncia do tempo de contato enzima-suporte e do pH do meio foram avaliados para a produÃÃo dos biocatalisadores. A estabilidade tÃrmica das enzimas imobilizadas foi avaliada e os resultados mostraram que o SBA-15-APTES-GA-LIPB possui maior estabilidade tÃrmica com um t1/2 = 36,91 min enquanto o derivado SBA-15-APTES-DVS-LIPB teve t1/2= 11,83 min e o SBA-15-LIPB teve t1/2= 8,5 min, a 50 ÂC. No entanto, o SBA-15-LIPB possui maior estabilidade em solventes orgÃnicos do que os biocatalisadores produzidos por ligaÃÃo covalente. Assim, o biocatalisador SBA-15-LIPB (CondiÃÃes otimizadas: 100 % de atividade recuperada em um tempo de contato de 1 hora, pH 7) foi aplicado em uma reaÃÃo modelo de esterificaÃÃo, que à a sÃntese de Ãsteres de cadeia curta, o butirato de metila e etila. Os resultados mostraram que, em condiÃÃes otimizadas de esterificaÃÃo (temperatura: 37 ᵒC, tipo de solvente: hexano para o butirato de metila e iso-octano para a sÃntese do butirato de etila, a concentraÃÃo de substrato: 0,2 M, proporÃÃo molar de substratos de 1: 1, tempo de reaÃÃo: 12 h), as conversÃes foram: 79,25% para a sÃntese de butirato de metila e 86,52% para a sÃntese de butirato de etila. O biocatalisador SBA-15-LIPB exibiu elevada atividade e estabilidade operacional na sÃntese do butirato de metila e butirato de etila, por esterificaÃÃo, depois de cinco e seis ciclos sucessivos de 12 horas cada, respectivamente. Os biocatalisadores SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB foram aplicados em uma reaÃÃo modelo de hidrÃlise, que à a resoluÃÃo cinÃtica do acetato de feniletila. Os dados experimentais mostraram que foram obtidos resultados positivos para ambos os biocatalisadores, mas o biocatalisador SBA-15-APTES-GA-LIPB foi mais eficiente, produzindo excessos enantiomÃricos de 99 %, conversÃo de 50 % e razÃo enantiomÃrica de 1057. / A recombinant Candida antarctica lipase B expressed in Pichia pastoris by insertion of an external DNA (LIPB) was i mmobilized in nanostructured mesoporous silicas of SBA - 15 type by physical adsorption (SBA - 15 - LIPB) and covalent attachment (SBA - 15 - APTES - GA - LIPB e SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB ) . Influence of contact time enzyme - support and the medium pH were ev aluated to the production of biocatalyst s . T he thermal stability of immobilized enzymes were evaluated and the results showed that the SBA - 15 - APTES - GA - LIPB has the best thermal stability with t 1/2 = 36,91 min while the SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB has t 1/2 = 11,83 min and the SB A - 15 - LIPB has t 1/2 = 8,5 min, a t 50 ÂC . However, the SBA - 15 - LIPB has high stability in organic solvents than the biocatalysts produced by covalent attachment. Therefore, the biocatalyst SBA - 15 - LIPB (Optimized conditions: 100 % of the recovery activity an 1 hour of contact time, pH 7) was applied in a model esterification reaction in the short chain esters synthesis, the methyl and ethyl butyrate. The results showed that in optimized conditions of esterification (temperatur e: 37 ᵒ C, solvent type: hexane for the methyl butyrate and isooctane for ethyl butyrate synthesis, substrate concentration: 0,2 mol/L, molar ratio of substrates 1:1, time of reaction: 12 h) the conversions were: 79.25 % for the methyl butyrate synthesis an d 86.52 % for ethyl butyrate synthesis. The biocatalyst SBA - 15 - LIPB exhibited high activity and operational stability on the methyl and ethyl butyrate synthesis by esterification after five and six successive cycles of 12 h each, respectively. The biocatalysts SBA - 15 - APTES - GA - LIPB and SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB were applied in a model hydrolysis reaction in the kinetic resolution of the phenylethyl acetate . The experimental data showed that were obtained positive results for both biocatalysts, but t he biocatalyst SBA - 15 - APTES - GA - LIPB was more efficient, producing enantiomeric excess 99 %, conversio n 50 % and enantiomeric ratio 1057.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho de tese apresenta suportes ativados com divilsulfona (DVS) como Ãteis para a estabilizaÃÃo de enzimas por ligaÃÃo covalente multipontual, os suportes sÃo muito estÃveis, e reagem com diferentes grupos de enzimas em diferentes condiÃÃes, etc. No entanto, em algumas ocasiÃes produzem a inativaÃÃo das mesmas, ou a imobilizaÃÃo à muito lenta, sugerindo que a imobilizaÃÃo nÃo à tÃo fÃcil como em outros suportes. O carÃter moderadamente hidrofÃbico do grupo introduzido pode ter consequÃncias. Tem sido demonstrado que a imobilizaÃÃo pode ser realizada em diferentes valores de pH, e isto parece envolver diferentes Ãreas das molÃculas da proteÃna, uma vez que apÃs a incubaÃÃo a pH 10 e subsequente bloqueio, as propriedades sÃo muito diferentes. AlÃm disso, confirmou-se a possibilidade de modular lipases atravÃs da imobilizaÃÃo ou subsequente modificaÃÃo fÃsica ou quÃmica, que podem ser nÃo sà a estabilidade, mas tambÃm a especificidade e seletividade podem ser alteradas significativamente. Essas mudanÃas nÃo sÃo previsÃveis e dependem do substrato, das condiÃÃes experimentais, e em caso de alteraÃÃes posteriores, ou do protocolo de imobilizaÃÃo utilizado. TambÃm à mostrado um protocolo simples que permite "um bioimprinting" da forma aberta de lipases utilizando um detergente para forÃar a abertura, e a estabilizaÃÃo desta lipase aberta à conseguida por meio da adiÃÃo de um polÃmero iÃnico revestindo a superfÃcie da proteÃna. / Esta tesis muestra que los soportes activados con divinil sulfona (DVS) pueden ser muy Ãtiles para conseguir la estabilizaciÃn de enzimas por uniÃn covalente multipuntual, los soportes son muy estables, reaccionan con diferentes grupos de las enzimas en diferenets condiciones, etc. Sin embargo, en ocasiones producen la inactivaciÃn de las mismas, o la inmovilizaciÃn es muy lenta sugiriendo que la inmovilizaciÃn no es tan sencilla como en otros soportes. El carÃcter moderadamente hidrofÃbico del grupo introducido puede tener consecuencias. Se ha demostrado como la inmovilizaciÃn puede realizarse a diferentes pHs, y que esto parece implicar diferentes Ãreas de las molÃculas de proteÃna, ya que tras su incubaciÃn a pH 10 y posterior bloqueo, las propiedades son muy diferentes. Por otro lado, se confirma que las lipasas se pueden modular via inmovilizaciÃn o modificaciÃn quÃmica o fÃsica posterior: no solo la estabilidad, sino tambiÃn la especificidad y la selectividad pueden alterarse de forma muy significativa. Estos cambios no son predecibles y dependen del sustrato, condiciones experimentales, y en el caso de las modificaciones posteriores, del protocolo de inmovilizaciÃn utilizado. TambiÃn se ha mostrado un protocolo muy sencillo que permite âel bioimprintingâ de la forma abierta de lipasas usando un detergente para forzar la apertura de las lipasas y estabilizando esta forma abierta por al adiciÃn de un polÃmero ionico que recubre la superfice de la protein.