Ophiostoma novo-ulmi is the causal agent of Dutch elm disease (DED) which has had a severe impact on the urban landscape in Canada. This research program focused on developing molecular genetic strategies to control this pathogenic fungus. The first strategy involved the development of RNA interference (RNAi) for the down-regulation of genes involved in pathogenicity. An efficient RNAi cassette was developed to suppress the expression of the endopolygalacturonase (epg1) locus which encodes a cell-wall degrading enzyme. This epg1-RNAi cassette significantly reduced the amount of polygalacturonase activity in the fungus and resulted in almost complete degradation of epg1 mRNA. The need for a native promoter to selectively down-regulate specific gene loci was addressed by developing a carbon-catabolite regulated promoter (alcA) to drive the expression of the epg1-RNAi cassette. The expression of an alcA-driven epg1-RNAi cassette resulted in the down-regulation of epg expression under glucose starvation but normal levels of expression in high glucose. The expression could therefore be controlled by culture conditions. The second strategy explored the potential of using dsRNA viruses to vector disruptive RNAi cassettes. An isolate of O. novo-ulmi strain 93-1224 collected in the city of Winnipeg, was infected by two dsRNA mitoviruses which upon sequence characterization were named OnuMV1c and OnuMV7. To assess the transmissibility of this dsRNA virus the infected isolate 93-1224 was paired with three naive isolates of the related fungi O. ulmi and O. himal-ulmi. Through the use of nuclear and mitochondrial markers it was determined that the virus OnuMV1c may not rely on mitochondrial fusion for transmission but may have a cytoplasmic transmission route. This investigation of gene expression and manipulation has provided tools to help understand gene regulation in O. novo-ulmi. It has also added to our knowledge of mitoviruses, their transmission and potential use as a biological control. By enhancing our understanding of transmissible hypovirulence this work contributes to efforts to develop a new approach to target DED as well as a potential model for the control of other fungal diseases. / Graduate / 0307 / 0306 / 0369 / jscarneiro@hotmail.com

Etwa 3% der Weltbevölkerung sind von dem Hepatitis-C-Virus-Infektion betroffen. Phänotyp der HCV-induzierten Lebererkrankung variiert stark von einem Patienten zum anderen. Die Wahrnehmung der viralen doppelsträngigen RNA (dsRNA) und einzelsträngigen RNA (ssRNA) durch den Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3) bzw. TLR7 scheinen an der Früherkennung der Pathogene und an der Wirtsantwort auf viraler Infektion beteiligt zu sein. Darüber hinaus ist die membran-assoziierte Form des Endotoxin-Rezeptor-Bestandteils CD14 (mCD14) mit TLR3 in Intrazellulärräumen kolokalisiert und erweitert die dsRNA-Erkennung und TLR3-Signalleitung. Die vorliegende Arbeit analysiert epidemiologische und klinische Daten von Patienten kaukasischer Abstammung mit einer chronischen Hepatitis C in Bezug auf bestimmte Einzellnukleotidpolymorphismen (SNPs) mit relevanten minor allele frequencies (MAFs) in Genen, die für obengenannte Rezeptoren kodieren. Es wurde keine Assoziation von dem TLR3-Promotor-Polymorphism rs5743305 (T/A) mit TLR3-Genexpression gefunden, weder in peripheren mononukleären Zellen des Blutes (PBMCs) noch in der Leber; keine weitere Korrelation mit epidemiologischen und klinischen Parametern der chronischen Erkrankung waren zu beobachten. Andererseits, T-homozygote Patienten am rs3775291-(C/T)-Polymorphismus (der in Exon 4 lokalisierter nicht-synonymer SNP) zeigen Tendenz zu einer höheren TLR3-Genexpression in der Leber. Außerdem, unter HCV-subtyp-1a-infizierten Patienten sind keine T-Homozygoten zu finden. Im Unterschied zur Lage bei alkoholischer Lebererkrankung wurde in chronischen Hepatitis-C-Patienten keine Assoziation zwischen den Fibrosegrad und CD14-Gen-C-159T-Polymorphismus gefunden. Bei T-homozygoten Patienten wurden jedoch häufiger portale lymphoide Aggregaten gefunden als bei C-Allele-Trägern. Außerdem das Vorhandensein von portalen lymphoiden Aggregaten korrelierte eng mit der Leberentzündung und mit Gallengangsläsionen. Am Ende wurde der funktionelle nicht-synonyme SNP in Exon 3 des X-gekoppelten TLR7 Gens, rs179008/Gln11Leu, untersucht. Die Analyse war auf homo- und hemizygoten Personen, die mittels Allelspezifischentranskriptquantifizierung (ASTQ) in heterozygoten weiblichen Personen eingeordnet wurden, eingeschränkt. Es zeigte sich dabei ein individueller verzerrter Mosaizismus in PBMCs. Das variante T-Allel war nur mit der Anwesenheit der portalen lymphoiden Aggregaten assoziiert. Hepatische Viruslast und Expression der Gene, die bekannterweise bei einer chronischer HCV-Infektion induziert sind, unterschieden sich zwischen Wildtyp- und Variantallelträger nicht. Jedoch eine signifikant niedrigere Expression der interleukin-29 (IL-29)/lambda1 interferon (IFN-λ1) und beider Untereinheiten seines Rezeptors (IL-10 Rβ and IL-28Rα) war bei T-homo- und hemizygoten Patienten zu beobachten. Diese Tatsache könnte eher eine Auswirkung auf die Ansprechbarkeit auf zukünftige IFN- λ-basierte Therapie haben, als auf eine Vorhersage des Ausgangs der gängigen IFN-α-basierten Therapie.